przed i po wysiłku fizycznym.

PRACE ORYGINALNE Paulina KARCZ Andrzej URBANIK Spektroskopia protonowa mięśni podudzia przed i po wysiłku fizycznym Proton spectroscopy of the lower leg muscles before and after exercise Katedra Radiologii Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Kierownik: Prof. dr hab. med. Andrzej Urbanik Dodatkowe słowa kluczowe: spektroskopia protonowa mięśnie szkieletowe wysiłek fizyczny Additional key words: proton spectroscopy skeletal muscle physical effort Adres do korespondencji: Katedra Radiologii UJ CM 31-501 Kraków, ul. Kopernika 19 Tel.: 124247761, Fax: 124247391 email: radiologia@su.krakow.pl Celem pracy była ocena przydatności spektroskopii protonowej (1HMRS) w określeniu stanu metabolicznego mięśni podudzia u zdrowych ochotników przed i po intensywnym krótkim wysiłku fizycznym. 30 zdrowych ochotników wzięło udział w badaniu, które wykonano przy użyciu systemu MR 1.5T i sekwencji PRESS (The Point-Resolved Spectroscopy Sequence). VOI (Volume of Interest) umieszczano zawsze w mięśniu piszczelowym przednim (TA - Tibialis Anterior) oraz mięśniu płaszczkowatym (SOL Soleus) kończyny dolnej. Surowe dane były przetwarzane przy użyciu oprogramowania GE. Autorzy pracy przeanalizowali we wszystkich otrzymanych widmach 1HMRS następujące metabolity: lipidy wewnątrzkomórkowe (IMCL), lipidy zewnątrzkomórkowe (EMCL), karnityne (Ct), kreatynę (Cr), kompleks trimethylamin (TMA), glukozę (Glc), tauryna (Tau), mleczany (Lac). Do oceny wyników użyto testu t-studenta. Na podstawie przeprowadzonej analizy statystycznej (p<0,05) wyników nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy względnymi stosunkami stężeń (WSS) przed i po wysiłku ani dla mięśnia piszczelowego przedniego ani mięśnia płaszczkowatego. Dopiero podział grupy badawczej na podgrupy wykazało różnice statystyczne dla WSS ocenianych metabolitów. Dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA) wykazano wzrost TMA w podgrupie mężczyzn, osób uprawiających sport 2-3 razy w tygodniu oraz niepalących. Spadek Ct w podgrupie osób, u których czas wysiłku wynosił dokładnie 20 minut. Dla mięśnia płaszczkowatego (SOL) wzrost IMCL(CH2) w podgrupie osób, u których czas wysiłku wynosił dokładnie 20 minut oraz niepalących. W podgrupie osób intensywnie uprawiający sport wzrost Ct po wysiłku. 1HMRS pozwala na nieinwazyjne badanie metabolizmu mięśni szkieletowych przed i po wysiłku fizycznym. Spektroskopia rezonansu magnetycznego jest nieinwazyjną metodą umożliwiającą badanie składu metabolicznego komórek in vivo i zmian, jakie zachodzą w nich pod The aim of this study was to attempt to assess the suitability of proton spectroscopy (1HMRS) in determining the metabolic state of the lower leg muscles in healthy volunteers before and after intense exercise. 30 healthy volunteers participated in the study, performed on a 1.5T MR scanner using a point-resolved spectroscopy (PRESS) sequence. VOI (Volume of Interest) was localized in the tibialis anterior and soleus muscle lower leg. The data were processed using GE spectroscopy tools. We analyzed on all MR spectra the following metabolits: intramyocellular lipids (IMCL), extramyocellular lipids (EMCL), carnitine (Ct), creatine (Cr), choline (Cho), trimethylamines (TMA), glucose (Glc), taurine (Tau) and lactate (Lac). We compared the resultant intensity ratios using t - test. Based on statistical analysis of results, there was no significant difference between average value of relative (WSS) (p<0.05) before and after exercise for either the tibialis anterior muscle or soleus muscle. Only the division of the research group into subgroups showed statistical differences. For the tibialis anterior (TA) showed an increase in the TMA subgroup of male group, volunteers whom doing sport occasionally and non smoking. Ct decrease in subgroup volunteers whom exercise time was exactly 20 minutes. For soleus muscle (SOL) increase IMCL(CH2) in subgroup of volunteers whom exercise time was exactly 20 minuts and non smoking. In the subgroup of volunteers doing sports professionally Ct increase after exercise. 1HMRS allows noninvasive studies of muscle metabolism before and after exercises. wpływem stanów chorobowych lub bodźców zewnętrznych. Wynik badania spektroskopowego prezentowany jest w postaci linii spektralnych (tzw. pików) tworzących widmo 286 P. Karcz, A. Urbanik

Tabela I Parametry jąder [8]. Nuclear parameters [8]. ABUDANCJA (%) STAŁA ŻYROMAGNETYCZNA (MHzT-1) [10,15]. Widma stanowią cechę charakterystyczną danych tkanek i narządów. Spektroskopia rezonansu magnetycznego (MRS - Magnetic Resonance Spectroscopy) mięśni szkieletowych jest z powodzeniem stosowana od kilku lat przez lekarzy, fizjologów i fizyków medycznych do badań energetyki mięsni (spektroskopia fosforowa 31PMRS), metabolizmu glukozy i glukogenu (spektroskopia węglowa 13CMRS) oraz lipidów (spektroskopia protonowa 1HMRS) [2,9,14,16]. Najpopularniejszą metodą jest spektroskopia protonowa, która tak jak obrazowanie rezonansu magnetycznego (MRI Magnetic Rezonance Imaging) bazuje na jądrach wodoru, jednego z najczęściej występujących pierwiastków w związkach organicznych (tab. I) [12]. Spektroskopia fosforowa w porównaniu do spektroskopii 1HMRS ma znacznie mniejszą czułość wskutek mniejszej zawartości fosforu w tkankach, co znacznie pogarsza rozdzielczość przestrzenną. Spektroskopia węglowa bazuje na izotopie węgla, który rzadko występuje w przyrodzie. W związku z tym należy sztucznie wzbogacać badane substancje w jądra tego izotopu. Generuje to wysokie koszty badania i eksploatacji oraz powoduje, że opcja spektroskopii węglowej dostępna jest głównie na aparatach MR instalowanych w ośrodkach naukowych i akademickich. Dodatkowo, aby móc wykonywać spektroskopię węglową oraz fosforową system MR musi być wyposażony m. in. w tzw. wzmacniacz Multi-Nuclear-Spectroscopy i cewki radiowe przystosowane do pracy w odpowiedniej charakterystycznej dla danego jądra częstotliwości rezonansowej oraz pakiet programów do odbierania i przetwarzania tych częstotliwości [10]. Należy CZĘSTOŚĆ REZONANSOWA DLA 1,5T (MHz) 1H 99,985 42,5774 63,8646 13C 1,10 10,7084 16,0621 31P 100 17,2514 25,8765 Tabela II Porównanie właściwości podatności magnetycznej objętościowej i sprzężenia dipolowego [2]. Characteristics of bulk magnetic susceptibility shifts and of residual dipolar coupling [2]. Podatność magnetyczna objętościowa Sprzężenie dipolowe Zależność od położenia TAK TAK Zanik efektu Zależy od geometri tkanki Dla magicznego kąta 54,70 Wielkość efektu Poziom makroskopowy Poziom molekularny Podstawy efektu Właściwości efektu Superpozycja pól magnetycznych indukowanych w tkance tłuszczowej Przesunięcie i rozszczepienie lini rezonansowych Oddziaływanie dipolarne pomiędzy jądrami Rozszczepienie linii rezonansowych podkreślić, że protonowa spektroskopia jest metodą stosowaną rutynowo w praktyce klinicznej w przeciwieństwie do spektroskopii fosforowej i węglowej, które nadal zaliczane są do technik eksperymentalnych. W 1995 roku 1HMRS otrzymała akredytację Federal Drug Administration (FDA) [16]. Protonowe widmo spektroskopowe mięśni szkieletowych zdominowane jest przez sygnał pochodzący od wody. Jedynie 10% intensywności sygnału pochodzi od metabolitów, takich jak [5,8] (ryc. 1, 2): 1. IMCL(-CH 3 ) wewnątrzkomórkowe lipidy grupa metylowa - 0,9 ppm 2. EMCL(-CH 3 ) zewnątrzkomórkowe lipidy grupa metylowa - 1,1 ppm 3. IMCL(-CH 2 ) wewnątrz komórkowe lipidy grupa metylenowa - 1,3 ppm 4. EMCL(-CH 2 ) zewnątrzkomórkowe lipidy grupa metylenowa - 1,5 ppm 5. Ct - karnityna - 2,13 ppm 6. Cr - kreatyna - Cr1-3,0 ppm; Cr2-3,9 ppm 7. TMA kompleks trimethylamin - 3,2 ppm 8. GLc - glukoza - Glc1-3,4 ppm; Glc2-3,8 ppm 9. Tau - tauryna - 3,5 ppm 10. Lac - mleczany - 4,1 ppm Specyficzną cechą protonowego widma spektroskopowego mięśni szkieletowych jest możliwość rozróżniania sygnałów rezonansowych pochodzących od lipidów wewnątrzkomórkowych (IMCL - intramyocellular lipids) jak i lipidów zewnątrzkomórkowych (EMCL - extramyocellular lipids) [1,2]. Różnica przesunięcia chemicznego lipidów IMCL i EMCL wynosi około 0,2 ppm i spowodowana jest efektem podatności magnetycznej objętościowej. Efekt ten dodaje się do przesunięcia chemicznego na widmie 1HMRS i zależy od orientacji mięśnia szkieletowego w stosunku do zewnętrznego pola magnetycznego (tab. II). Zależność sygnałów rezonansowych w widmie od orientacji Rycina1 Widmo 1HMRS z mięśnia piszczelowego przedniego (TA) - praca własna. 1HMR spectrum from Tibialis Anterior muscle (TA) - own work. Rycina 2 Widmo 1HMRS z mięśnia płaszczkowatego (SOL) - praca własna. 1HMR spectrum from Soleus muscle (SOL) - own work. Przegląd Lekarski 2013 / 70 / 5 287

mięśnia w stosunku do zewnętrznego pola magnetycznego związane jest z różną budową/strukturą lipidów wewnątrz i zewnątrzkomórkowych [4]. Zmiana położenia lipidów IMCL, które w mięśniach zlokalizowane są wewnątrz cytoplazmy i mają kształt kulisty, nie powoduje zmiany namagnesowania a tym samym częstości rezonansowej. W przypadku zmiany położenia lipidów EMCL, które znajdują się w warstwach pomiędzy wiązkami włókien mięśniowych i mają kształt zbliżony do walca, pociąga to za sobą zmianę namagnesowania i częstości rezonansowej. W wyniku zmiany częstości rezonansowej dochodzi do przesunięcia i rozszczepienia linii rezonansowych na widmie spektroskopowym [3]. Efekt jest minimalny, jeżeli włókna mięśniowe i tym samym warstwy EMCL są zorientowane równolegle do zewnętrznego pola magnetycznego. Kąt pomiędzy włóknami mięśniowymi a główną osią kończyny nazywany jest kątem pinnate. Dla mięśnia piszczelowego przedniego podudzia (kąt pinnate jest bliski 0), który składa się głównie z szybko kurczliwych włókien typu II zorientowanych wzdłuż osi kończyny, obserwujemy na widmie spektroskopowym maksymalnie rozdzielone sygnały od lipidów wewnątrz i zewnątrzkomórkowych. Mięsień płaszczkowaty, zbudowany z wolno kurczliwych włókien typu I charakteryzuje się nachyleniem włókien w stosunku do osi głównej kończyny (kąt pinnate różny od 0) i dlatego trudno jest oddzielić sygnały rezonansowe IMCL i EMCL (ryc. 3). Podobną zależność obserwujemy dla kreatyny. W widmie spektroskopowym wyróżniają się dwie linie rezonansowe kreatyny. To rozszczepienie (bez przesunięcia linii rezonansowych) na dwie grupy związane jest z sprzężeniem dipolowym i zmniejsza się szybko wraz z kątem pomiędzy stałym polem magnetycznym a mięśniem szkieletowym. Aby całkowicie zaniknąć dla tzw. magicznego kąta ( magic angle ), który wynosi 54.78 0 (tab. II) (ryc. 4) [2]. Ponadto kompleks TMA, mleczany i inne metabolity wykazują podobną zależność. Zależność sprzężenia dipolowego od orientacji mięśnia w stosunku do pola magnetycznego można wykorzystać do określenia orientacji włókien mięśniowych. Oznaczenie ilościowe lipidów przy zastosowaniu spektroskopii protonowej ma kilka wad [15]. Najważniejsza to zależność linii rezonansowych w widmie od orientacji mięśnia w stosunku do pola magnetycznego. Stężenie lipidów wewnątrzkomórkowych zależy również od diety, wagi i wytrenowania mięśnia. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania protokołu badania mięśni w technice protonowej spektroskopii MR. Celem pracy było określenie zmian w widmie 1HMRS z mięśnia piszczelowego przedniego (TA - Tibialis Anterior) i płaszczkowatego (SOL Soleus) podudzia u zdrowych ochotników przed oraz po krótkim, intensywnym wysiłku fizycznym. Materiał i metoda W badaniu wzięło udział 30 ochotników (średnia wieku 25 lat) w tym 12 kobiet w wieku od 20 do 54 lat (średnia wieku 27 lat) oraz 18 mężczyzn w wieku od 24 do 36 lat (średnia wieku 24 lata). Ochotnikami były osoby prowadzące zdrowy tryb życia, bez nadwagi. Każda osoba deklarowała uprawianie sportów rekreacyjnych. Średni wskaźnik masy ciała wynosił 23 (Body Max Index - BMI) w grupie kobiet wahał się od 17 do 26 (wartość średnia 22), w grupie mężczyzn jego wartość wahała się pomiędzy 18 do 30 (średnia wartość 23). Ochotnikami były osoby w większości niepalące (22 osób niepalących i 8 osób palących od 3-10 papierosów dziennie) Rycina 3 Porównanie widm 1HMRS mięśnia piszczelowego przedniego (TA) zielona linia; oraz mięśnia płaszczkowatego (SOL) czerwona linia. Dla mięśnia TA w widmie obserwowane jest maksymalne rozdzielone linie rezonansowe od lipidów IMCL i EMCL (kat pinnate bliski 0). Dla mięśnia SOL brak rozdzielenia linii rezonansowych od lipidów EMCL (kąt pinnate różny od 0) - praca własna. Comparison of the spectra 1HMRS tibialis anterior muscle (TA) - green line, and soleus muscle (SOL) - red line. The TA muscle is observed in the spectrum of resonances separated peak of IMCL and EMCL lipid (pinnata angle close to 0). For the SOL muscle, lack of separation of resonances from EMCL lipids (pinnata angle different from 0) - own work. Rycina 4 Efekt podatności magnetycznej objętościowej i sprzężenia dipolowego dla mięśnia piszczelowego przedniego (A) i mięśnia płaszczkowatego (B). Zmiana widma 1HMRS [3]. Bulk magnetic susceptibility effect and dipolar coupling in tibialis anterior and soleus muscle. Change 1HMRS spectrum [3]. 288 P. Karcz, A. Urbanik

Rycina 5 Lokalizacja VOI - A mięsień piszczelowy przedni (TA), B mięsień płaszczkowaty (SOL). VOI localization - A tibialis anterior (TA), B soleus muszle (SOL). Rycina 6 Unieruchomienie kończyny w trakcie badania. The immobilization of the lower leg during the study. oraz bez cukrzycy i miażdżycy w wywiadzie. Projekt uzyskał pozytywną opinie Komisji Bioetycznej UJCM. Badanie składało się z trzech części: 1. Badanie spektroskopowe MR mięśni kończyn dolnych w spoczynku. 2. Wysiłek fizyczny krótki i intensywny trening na steperze urządzeniu imitującym ruch/wysiłek wchodzenia na stopnie. Czas wysiłku zależny był od naturalnych predyspozycji ochotników i trwał do subiektywnego zmęczenia mięśnia podudzia. Średni czas trwania wysiłku wynosił 22,43 minut (wahał się w granicach 20-40 minut). Badacze przed przystąpieniem do badań poprosili 10 ochotników o intensywne i energiczne ćwiczenie na steperze. Każdy z ochotników miał ćwiczyć do subiektywnego zmęczenia mięśnia podudzia. Średni czas trwania wysiłku wynosił 20 minut. W związku z tym badacze przyjęli, że minimalny czas trwania wysiłku w badaniu głównym winien wynosić 20 minut. 3. Badanie spektroskopowe MR mięśni kończyn dolnych po intensywnym wysiłku fizycznym. Badania MR zostały wykonane przy użyciu systemu MR 1,5T (HDxt, GEMS) przy zastosowaniu kwadraturowej cewki nadawczo-odbiorczej do kończyn firmy Invivo Corporation. Protokół badania składał się z sekwencji T2 - zależnej w płaszczyźnie poprzecznej do zlokalizowania mięśni podudzia i zaplanowania VOI (Volume of Interest - objętości mięśnia w postaci sześcianu, z którego uzyskiwano widmo spektroskopowe) oraz z sekwencji spektroskopowej 1HMRS przed i po wysiłku fizycznym. VOI o wymiarach dostosowanych każdorazowo do wielkości struktury anatomicznej umieszczano zawsze w mięśniu piszczelowym przednim (TA - Tibialis Anterior) oraz mięśniu płaszczkowatym (SOL Soleus), przy jednoczesnym ominięciu dużych naczyń, ścięgien oraz otaczającej włókna mięśniowe tkanki tłuszczowej (ryc. 5). W niniejszej pracy średnia objętość VOI dla mięśnia TA przed wysiłkiem wynosiła 4,46cm 3 (wahała się pomiędzy 2,3-8 cm 3 ), po wysiłku 4,65cm 3 (1,37-8 cm 3 ). Dla Tabela III. Tendencja zmian w stężeniu poszczególnych metabolitów liczonych do sumy całkowitej kreatyny po wysiłku dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA) dla całej grupy badanej. Tendency of changes in concentrations each metabolites calculated for the total amount of creatine in the tibial anterior (TA) muscle after exercise. Metabolit Średnia Cr1 + Cr2 Przed wysiłkiem Po wysiłku mięśnia SOL średnia objętość VOI przed wysiłkiem wynosiła 6,30cm 3 (3,71-8,72cm 3 ) a po wysiłku 4,07 cm 3 (1,52-8cm 3 ). W badaniach 1HMRS użyto techniki PRESS (The Point-Resolved Spectroscopy Sequence) o następujących parametrach: - TR (czas repetycji) 1500ms, - TE (czas echa) 35ms, - liczba akwizycji - 64 - NEX (number of exitation) 8 Do wybiórczego tłumienia sygnału cząsteczek wody, przed nieselektywnym wzbudzeniem całego zakresu częstotliwości, użyto techniki CHESS (CHemical Selective Suppression). Czas sekwencji 1HMRS wynosił 2 minuty i 12 sekund. Projektując eksperyment badawczy autorzy wzięli pod uwagę zależność widma 1HMRS mięśnia szkieletowego od orientacji w stosunku do stałego zewnętrznego pola magnetycznego. W związku z tym każdy z ochotników miał umieszczaną badaną kończynę w odpowiedniej prowadnicy tak, aby jej ułożenie było powtarzalne przed i po wysiłku fizycznym (ryc. 6). Otrzymane surowe dane spektroskopowe zostały poddane analizie jakościowej i ilościowej przy zastosowaniu firmowego oprogramowania SAGE 7.0 (Spectroscopy Analysis by GE). Analizie statystycznej poddano względne stosunki stężeń (WSS) poszczególnych metabolitów. Biorąc pod uwagę zależność sygnałów rezonansowych na widmach 1HMRS od orientacji mięśnia w stosunku do zewnętrznego pola magnetycznego analizie zostały poddane metabolity: - dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA): lipidy wewnątrzkomórkowe IMCL(- CH 3 ) - 0,9ppm oraz IMCL(-CH 2 ) - 1,3ppm, lipidy zewnątrzkomórkowe EMCL(-CH 3 ) - 1,1ppm oraz EMCL(-CH 2 ) - 1,5ppm, karnityna Ct - 2,13ppm, kreatyna Cr1-3,0ppm oraz Cr2-3,9ppm, kompleks trimethylamin p Tendencja IMCL(-CH3) 0,52198 0,48274 0,695689 EMCL(-CH3) 1,41211 1,35085 0,794097 IMCL(-CH2) 5,11159 4,44998 0,413121 EMCL(-CH2) 12,73863 12,88169 0,912765 Ct 0,61779 048982 0,078276 TMA 0,43658 0,49666 0,155164 Glc1 3,4 ppm 0,16424 0,11455 0,315102 Tau 0,23059 0,23874 0,740577 Glc2 3,8 ppm 0,20239 0,18497 0,638040 Lac 0,17933 0,22667 0,356432 Przegląd Lekarski 2013 / 70 / 5 289

TMA - 3,2ppm, glukoza Glc1-3,4ppm oraz Glc2-3,8ppm, tauryna Tau - 3,5ppm, mleczany Lac - 4,1ppm (ryc. 1). - dla mięśnia płaszkowatego (SOL): lipidy wewnątrzkomórkowe IMCL(-CH 3 ) - 0,9ppm oraz IMCL(-CH 2 ) - 1,3ppm, karnityna Ct - 2,13ppm, kreatyna Cr1-3,0ppm, kompleks trimethylamin TMA - 3,2ppm (ryc. 2). Ponieważ dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA) była możliwość oznaczenia dwóch linii rezonansowych kreatyny (Cr1-3,0ppm oraz Cr2-3,9ppm) oraz glukozy (Glc1-3,4ppm oraz Glc2-3,8ppm) liczono względne stosunki stężeń zarówno do sumy całkowitej kreatyny (tj. Cr1-3,0 ppm + Cr2-3,9 ppm) jak i sumy całkowitej glukozy (tj. Glc1-3,4 ppm + Glc2-3,8 ppm). W przypadku mięśnia płaszczkowatego (SOL) WSS liczone były tylko do kreatyny, ponieważ była możliwość oznaczenia wyłącznie jednej linii rezonansowej kreatyny (Cr1-3,0ppm). Wybrano kreatynę jako wzorzec wewnętrzny ze względu na stabilność metabolitu - brak zmian w stężeniu skorelowany z wysiłkiem fizycznym, otyłością czy chorobami [13]. Średnie wartości względne opisano przez średnią arytmetyczną i odchylenie standardowe. Ocenę różnic WSS przed i po wysiłku fizycznym weryfikowano testem t-studenta. Wyniki Dokonano analizy względnych stosunków stężeń (WSS) wybranych metabolitów dla całej grupy badanej przed i po wysiłku fizycznym. Na podstawie przeprowadzonej analizy statystycznej wyników nie można stwierdzić istotnej różnicy statystycznej (p<0,05) pomiędzy WSS ocenianych metabolitów przed i po wysiłku zarówno dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA) jak i mięśnia płaszczkowatego (SOL). Stwierdzono jedynie tendencje zmian stężeń metabolitów po wysiłku - wyniki zestawiono w tabelach III, IV i V. Dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA) zauważono tendencje: Tabela IV. Tendencja zmian w stężeniu poszczególnych metabolitów liczonych do sumy całkowitej glukozy po wysiłku dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA) dla całej grupy badanej. Tendency of changes in concentrations each metabolites calculated for the total amount of glucose in the tibial anterior (TA) muscle after exercise. Metabolit Średnia Glc1 + Glc2 Przed wysiłkiem Po wysiłku p Tendencja IMCL(-CH3) 2,03342 1,79270 0,640354 EMCL(-CH3) 5,34762 6,97315 0,418859 IMCL(-CH2) 18,36752 18,79576 0,920463 EMCL(-CH2) 49,52808 61,28946 0,424285 Ct 2,25655 2,11654 0,757113 Cr1 3,0 ppm 3,44460 4,34299 0,318040 TMA 1,50835 1,87169 0,197064 Tau 0,84847 1,17795 0,347764 Cr2 3,9 ppm 0,23026 0,24630 0,865162 Lac 0,65302 0,94339 0,196849 Tabela V. Tendencja zmian w stężeniu poszczególnych metabolitów liczonych do kreatyny po wysiłku dla mięśnia płaszczkowatego (SOL) dla całej grupy badanej. Tendency of changes in concentrations each metabolites calculated for creatine in the soleus (SOL) muscle after exercise. Metabolit Średnia p Tendencja Cr Przed wysiłkiem Po wysiłku IMCL(-CH3) 16,47284 18,79840 0,107706 IMCL(-CH2) 0,73668 0,93748 0,199693 Ct 0,73603 0,73653 0,996422 TMA 1,17771 1,17795 0,997293 Rycina 7 Porównanie stężenia kompleksu TMA przed i po wysiłku w podgrupie mężczyzn dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA). Comparison of concentrations of TMA complex before and after exercise in subgroups of men for the tibialis anterior muscle (TA). Rycina 8 Porównanie stężenia Ct przed i po wysiłku w podgrupie osób, których czas wysiłku wynosił dokładnie 20 minut dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA). Comparison of Ct concentrations before and after exercise in the subgroup of volunteers who have exercise time was exactly 20 minutes for tibialis anterior muscle (TA). 290 P. Karcz, A. Urbanik

Rycina 9 Porównanie stężenia kompleksu TMA przed i po wysiłku w podgrupie osób uprawiających sport 2-3 razy w tygodniu dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA). Comparison of concentrations of TMA complex before and after exercise in a subgroup of volunteers whom doing sport occasionally for the tibialis anterior muscle (TA). Rycina 10 Porównanie stężenia kompleksu TMA przed i po wysiłku w podgrupie niepalących osób dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA). Comparison of concentrations of TMA complex before and after exercise in a subgroup of non smoking volunteers for the tibialis anterior muscle (TA). Rycina 11 Porównanie stężenia IMCL(CH2) przed i po wysiłku w podgrupie osób, u których czas wysiłku wynosił dokładnie 20 minut dla mięśnia płaszczkowatego (SOL). Comparison of IMCL(CH2) concentrations before and after exercise in the subgroup of volunteers who have exercise time was exactly 20 minutes for the soleus muscle (SOL). Rycina 12 Porównanie stężenia IMCL(CH2) przed i po wysiłku w podgrupie osób intensywnie uprawiający sport dla mięśnia płaszczkowatego (SOL). Comparison of concentrations of IMCL(CH2) before and after exercise in a subgroup of volunteers doing sports professionally for soleus muscle (SOL). 1. wzrostu stężenia po wysiłku dla metabolitu: - EMCL(-CH 2 ), kompleksu TMA, Tau, Lac - WSS liczone do sumy całkowitej kreatyny - IMCL(-CH 3 ), EMCL(-CH 3 ), EMCL(- CH 2 ), Cr1, kompleks TMA, Tau, Cr2, Lac - WSS liczone do sumy całkowitej glukozy 2. spadku stężenia po wysiłku dla metabolitu: - IMCL(-CH 3 ), EMCL(-CH 3 ), IMCL(-CH 2 ), Ct, Glc1, Glc2 - WSS liczone do sumy całkowitej kreatyny - IMCL(-CH 2 ), Ct - WSS liczone do sumy całkowitej glukozy. W przypadku mięśnia płaszczkowatego zauważono tendencję wzrostową stężenia po wysiłku dla IMCL(-CH 3 ), IMCL(-CH 2 ), Ct oraz kompleksu TMA - WSS liczone do kreatyny. Dodatkowo grupa badana została podzielona na następujące podgrupy zależne od: 1. płci: - kobiety (K), - mężczyźni (M) 2. wytrenowania : - ochotnicy (17 osób) okazjonalnie uprawiający sport (około 2-3 razy w miesiącu przed około 1 godzinę); - ochotnicy (8 osób) uprawiający sport około 2-3 razy w tygodniu przez około 1 godzinę; - ochotnicy (5 osób) intensywnie uprawiający sport - codziennie minimum 1 godzina. 3. czasu trwania wysiłku w czasie eksperymentu - ochotnicy (19 osób), u których czas wysiłku pomiędzy dwoma seriami spektroskopowymi wynosił dokładnie 20 minut - czyli minimum czasu przyjętego przez badaczy. - ochotnicy (11 osób), u których czas wysiłku pomiędzy dwoma seriami spektroskopowymi był dłuższy niż 20 minut. Do tej grupy zostali dołączeni ochotnicy, których czas wysiłku był dłuższy niż wymagane minimum 20 minut. 4. palenia tytoniu: - niepalący (22 osób) - palący (8 osób; od 3 do 10 papierosów dziennie) Stwierdzono następujące różnice statystyczne (p<0,05) dla względnych stosunków stężeń WSS ocenianych metabolitów po wysiłku fizycznym: Dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA): - w podgrupie mężczyzn wzrost TMA liczonego do sumy całkowitej kreatyny (ryc. 7) - w podgrupie osób, których czas wysiłku wynosił dokładnie 20 minut spadek Ct liczonego do sumy całkowitej kreatyny (ryc. 8) - w podgrupie osób uprawiających sport 2-3 razy w tygodniu wzrost TMA liczonego do sumy całkowitej kreatyny (ryc. 9) - w podgrupie osób niepalących wzrost TMA liczonego do sumy całkowitej kreatyny (ryc. 10) 2. Dla mięśnia płaszczkowatego (SOL): Przegląd Lekarski 2013 / 70 / 5 291

Rycina 13 Porównanie stężenia IMCL(CH2) przed i po wysiłku w podgrupie osób niepalących dla mięśnia płaszczkowatego (SOL). Comparison of concentrations of IMCL(CH2) before and after exercise in the subgroup of non smoking volunteers for the soleus muscle (SOL). których czas wysiłku był równy 20 minut, związany jest zarówno z rolą tych metabolitów jak stopniem wytrenowania ochotników. Karnityna pełni rolę w transporcie kwasów tłuszczowych z cytozolu do mitochondriów, gdzie ulegają przemianom, w wyniku których powstaje energia niezbędna do prawidłowego funkcjonowania komórek. W pierwszych minutach pracy mięśni szkieletowych źródłem energii są lipidy wewnątrzkomórkowe, stąd wzrost ich stężenia przy jednoczesnym spadku stężenia karnityna, która bierze udział w ich transporcie. Wnioski Podsumowując, protonowa spektroskopia MR (1HMRS) mięśni szkieletowych jest techniką, która daje możliwość bezinwazyjnego określenia stężeń istotnych fizjologicznie metabolitów takich jak: glikogen, lipidy wewnątrzkomórkowe, kreatyna oraz mleczany. Ocena 1HMRS mięsni szkieletowych dodana do rutynowych badań MR może w istotny sposób polepszyć diagnostykę układu mięśniowego poprzez określenie zmian w jego metabolizmie. W niedalekiej przyszłości może zastąpić wykonywanie biopsji mięśni. - w podgrupie osób, u których czas wysiłku wynosił dokładnie 20 minut wzrost IMCL(CH2) liczony do kreatyny (ryc. 11) - w podgrupie osób intensywnie uprawiających sport wzrost Ct liczony do kreatyny (ryc. 12) - w podgrupie osób niepalących wzrost IMCL(CH2) liczony do kreatyny (ryc. 13). Dyskusja Bezpośrednim źró dłem energii niezbędnej do skurczu mięśni szkieletowych jest adenozynotrifosforan (ATP) [7]. Zapasy wewnątrzmięśniowego ATP są niewielkie i w ciągu 2 sekund po rozpoczęciu wysiłku o maksymalnej intensywności ulegają wyczerpaniu. Związku z tym potrzebna jest cykliczna jego resynteza. W począt kowej fazie wysiłku fizycznego dominują przemiany bez tlenowe, natomiast w miarę jego przedłużania wzrasta zna czenie procesów tlenowych. Substratami energetycznymi w komórkach mięśniowych są między innymi lipidy wewnętrzne. Analiza komórek mięśniowych za pomocą mikroskopu elektronowego wykazała, że lipidy wewnątrzkomórkowe (IMCL) w postaci kropli znajdują się w pobliżu mitochondriów [6]. Oznacza to, że są łatwo dostępnym magazynem paliwa podczas wysiłku fizycznego. W prezentowanym badaniu wykazano istotny statystycznie (p<0,05) wzrost lipidów wewnątrzkomórkowych IMCL(CH2) liczonych do kreatyny w mięśniu płaszczkowatym (SOL) w podgrupie osób uprawiających sport 2-3 razy w tygodniu oraz niepalących. Dodatkowo zauważono tendencję spadkową (nieistotną statystycznie) stężenia IMCL(CH2) dla mięśnia piszczelowego przedniego (TA) oraz tendencję wzrostową dla mięśnia płaszczkowatego (SOL). Wyniki uzyskane m. in. przez zespół Kreis a donoszą o spadku poziomu lipidów wewnątrzkomórkowych po wysiłku fizycznym [5]. Należy podkreślić, że analiza stężenia IMCL w większości przytaczanych badań była przeprowadzana po długim i intensywnym wysiłku fizycznym np. po maratonie (42km), półmaratonie (21km) lub całodziennej wędrówce po górach (5-6 godzin marszu) [5,8]. Autorzy prezentowanej pracy przeprowadzili analizę stężenia IMCL po krótkim i intensywnym wysiłku i otrzymali takie same wyniki jak zespół Loom a, który badał stężenie IMCL po około 30 minutowym wysiłku [6]. Można stwierdzić, że rozbieżność w literaturze jest związana z niejednorodnością w protokołach badaczy, która dotyczy m. in. np. trybu, czasu i intensywności treningu, wybranej populacji oraz definicji stopnia wytrenowania. W prezentowanej pracy obserwowany jest wzrost stężenia Ct w mięśniu płaszczkowatym (SOL). Otrzymane rezultaty korelują z wynikami zespołu Kreis a [5], które donoszą o wzroście stężenia karnityny (Ct) zarówno w czasie wysiłku jak również w ciągu kilku pierwszych minut po jego zakończeniu. Powrót stężenia Ct do poziomu wyjściowego może trwać nawet 30 minut. Czas ten wydłuża się po długim, ciężkim i intensywnym treningu. Wraz ze wzrostem stężenia Ct obserwowany jest wzrost stężenia kompleksu TMA [6]. Należy zaznaczyć, że wzrost stężenia TMA jest obserwowany sporadycznie. Jednakże intensywny wzrost amplitudy linii rezonansowej kompleksu TMA może dodatkowo tłumić sygnał pochodzący od karnityny. W widmie 1HMRS mięsni ma to odzwierciedlenie w spadku intensywności linii rezonansowej Ct a tym samym spadku stężenia tego metabolitu [5]. Tłumaczy to prezentowane w niniejszej pracy tendencje spadkowe (nieistotne statystycznie) stężenia Ct przy tendencji wzrostowej stężenia kompleksu TMA (również nieistotne statystycznie) dla mięśnia TA i SOL liczonego zarówno do kreatyny i glukozy. Obserwowany w prezentowanej pracy statystycznie istotny wzrost stężenia IMCL(CH 2 ) przy równoczesnym spadku stężenia Ct dla grupy ochotników, Piśmiennictwo 1. Bosch C.: Musculoskeletal spectroscopy. J. Magn. Reson. Imaging. 2007, 25, 321. 2. Boesch C., Machann J., Vermathen P. et al.: Role of proton MR for the study of muscle lipid metabolism. NMR Biomed. 2006, 19, 968. 3. Boesch C., Slotboom J., Hoppeler H., et al.: In vivo determination of intra-myocellular lipids in human muscle by means of localized H-1-MRspectroscopy. Magn. Reson. Med. 1997, 37, 484. 4. Chu S., Balschi J., Springer C.: Bulk magnetic susceptibility shifts in NMR studies of compartmentalized samples: use of paramagnetic reagents. Magn. Reson. Med. 1990, 13, 239. 5. Kreis R., Jung B., Rotman S. et al.: Non-invasive observation of acetyl-group buffering by 1H-MR spectroscopy in exercising human muscle. NMR Biomed. 1999, 12, 471. 6. Loon L. J.: Use of intramuscular triacylglycerol as a substrate source during exercise in humans. J. Appl. Physiol. 2004, 97, 1170. 7. Łukaszuk B., Chabowski A.: Rola mitochondrialnych transporterów kwasów tłuszczowych w patogenezie insulinooporności komórek mięśniowych. Postępy Hig. Med. Dośw. 2010, 64, 31. 8. Machana J., Stefan N., Schick F.: 1H MR spectroscopy of skeletal muscle, liver and bone marrow. Eur. J. Radiol. 2008, 67, 275. 9. Pipinos I., Shepard A., Anagnostopoulos P. et al.: Phosphorus 31 nuclear magnetic resonance spectroscopy suggests a mitochondrial defect in claudicating skeletal muscle. J. Vasc. Surg. 2000, 31, 944. 10. Salibi N., Brown M.: Clinical MR spectroscopy. First Principles. Wiley-Liss, Wilmington 1998. 11. Schirmer T.: Hardware and requirements for multinuclear spectroscopy. Advanced MR spectroscopy training class, Textbook, Course, Santa Cruz de Tenerife 2011. 12. Sobiecka B., Urbanik A.: The role of choline (Cho) in the diagnostics and differentiation of brain tumours with HMRS technique. Pol. J. Radiol. 2009, 74, 7. 13. Stueckle C.A., Claeys L., Haegele K., et al.: Diagnostic value of proton MR spectroscopy in peripheral arterial occlusive disease: A prospective evaluation. AJR 2006, 187, 1322. 14. Szczepaniak L., Babcock E., Schick F., et al.: Measurement of intracellular triglyceride stores by H spectroscopy: validation in vivo. Am. J. Physiol. 1999, 276, 977. 15. Torriani M.: Measuring muscle lipids with 1H-MR spectroscopy. Skeletal Radiol. 2007, 36, 607. 16. Urbanik A.: Diagnostyka otępienia przy pomocy protonowej spektroskopii MR. Przegl. Lek. 2010, 67, 237. 292 P. Karcz, A. Urbanik