ANALIZA I ROZDZIAŁ MIESZANINY NATURALNYCH BARWNIKÓW ORGANICZNYCH Cel ćwiczenia i wprowadzenie Celem ćwiczenia jest potwierdzenie przydatności chromatografii kolumnowej do rozdziału barwników zawartych w liściach roślin, a następnie ich identyfikacji i analizie ilościowej metodą spektroskopii absorbcyjnej. Chlorofil jest barwnikiem obecnym we wszystkich roślinach zielonych, algach (glonach) i bakteriach fotosyntetycznych, którego zadaniem jest generowanie pod wpływem światła widzialnego wolnych elektronów, które są następnie spoŝytkowywane w dalszych etapach fotosyntezy. Zielony kolor chlorofilu spowodowany jest bardzo niską absorpcją w "zielonej" części spektrum światła. Inne barwniki, które bardzo często znajdują się w roślinach to karotenoidy (np. luteina, wiolaksantyna, neoksantyna itp.). Stosunki ilościowe chlorofili w roślinach zaleŝą między innymi od warunków siedliskowych: rośliny cieniolubne mają więcej chlorofilu b, światłolubne chlorofilu a. Rysunek 1. Wzór strukturalny chlorofilu Chlorofile są dosyć nietrwałe. W Ŝywych tkankach występują w formie związanej np. z białkami, fosfolipidami, co powoduje stabilność zielonej barwy. Z kolei zniszczenie Ŝywej tkanki roślinnej oraz struktury chlorofili poprzez np. ogrzewanie, odwadnianie, kontakt z rozpuszczalnikami, enzymami, prowadzi do przemian chlorofili i zmiany barwy. Rozpad chlorofilu przyśpiesza równieŝ działanie światła i tlenu. W środowisku kwaśnym następuje przemiana chlorofilu, związana z zastąpieniem jonu magnezu poprzez dwa jony wodoru i powstanie feofityny (oliwkowozielona) lub przy niŝszym ph, równieŝ odszczepienie fitolu i powstanie feoforbidyny (brunatna barwa). Środowisko zasadowe prowadzi do hydrolizy wiązań estrowych, z zachowaniem jonu magnezu w strukturze chlorofilu a produktami reakcji są chlorofiliny (zielona barwa), które pod wpływem enzymu chlorofilazy tracą fitol i przekształcają chlorofilidy. Chlorofile z
łatwością ulegają reakcji wymiany jonów magnezu na jony metali dwuwartościowych, takich jak Ŝelazo (barwa szarobrunatna), miedź (zielona barwa) czy cynk (równieŝ barwa zielona). Barwniki chlorofilowe, jak równieŝ ich pochodne, znajdują zastosowanie w przemyśle spoŝywczym, kosmetycznym i farmaceutycznym. Z uwagi na obecność podwójnych wiązań sprzęŝonych chlorofile są efektywnymi fotoreceptorami. Charakterystyczną cechą takich związków jest bardzo silna absorpcja w zakresie światła widzialnego wyraŝona poprzez wysokie molowe współczynniki absorpcji, jedne z najwyŝszych, jakie znane są dla związków organicznych (rysunki poniŝej). Metaloporfiryny podobnie jak porfiryny charakteryzują się obecnością dwóch pasm absorpcji w zakresie UV-VIS. Pierwsze, to dość ostre pasmo, zwane pasmem Soreta (nazwisko francuskiego fizyka Charlesa Soreta) znajduje się w zakresie 400-500 nm a molowy współczynnik absorpcji jest rzędu 10-100. Drugie pasmo Q, składające się z czterech części składowych (wolne porfiryny) jest około 10 razy słabsze i leŝy w zakresie 500-700 nm. W przypadku metalopochodnych porfiryny ilość pasm Q ulega zmniejszeniu z czterech do dwóch lub trzech, natomiast pasmo Soreta przesunięciu wraz ze zmianą molowego współczynnika absorpcji. Karoten jest naturalnie występującym barwnikiem z grupy karotenoidów. Karotenoidy występują w liściach, lecz ich Ŝółto-pomarańczowa barwa jest zwykle maskowana przez intensywną, zieloną barwę chlorofilu. Odpowiedzialne są za piękną barwę wielu owoców (ananas, owoce cytrusowe, pomidory, papryka), kwiatów (narcyz, pozłotka), skorupiaków, ryb (łosoś) i Ŝółtka jaj. Karotenoidy zbudowane są z ośmiu jednostek izoprenowych (40 atomów węgla) i naleŝą do grupy tetraterpenów. NaleŜą do nich karoteny i ksantofile. Warto tu wspomnieć o ß-karotenie, który stanowi około 80 % wszystkich karotenów, z
uwagi na fakt, Ŝe jest prekursorem witaminy A (rysunek poniŝej). Karoten występuje między innymi w korzeniu marchwi, stąd jego nazwa. Zawartość chlorofilu oraz karotenu oznacza się metodą spektrofotometryczną, z uwagi na wspomniane wysokie molowe współczynniki absorpcji. Wartości molowych współczynników absorpcji podano w Załączniku 1, 2 i 3, na końcu opisu ćwiczenia.
Odczynniki: eter naftowy o t wrz = 40 60 C aceton izopropanol silica gel 60 (Merck) NaCl CaCO 3 Na 2 SO 4 50 g próbka materiału roślinnego (np. szpinak, natka pietruszki, brokuły) Aparatura i szkło: moździerz szklana kolumna chromatograficzna lejek szklany cylinder miarowy (50ml) kapilary (lub pipety Pasteura) kolbki miarowe (25 ml) bibuła filtracyjna, sączki cylinder miarowy 25 ml rozdzielacz 200 ml pipeta 5 ml, 20 ml erlenmajerki 100 ml zlewki 100 oraz 500 ml Wykonanie: Ekstrakcja barwników z liści Porcję świeŝych liści rozciera się w moździerzu z 22 ml acetonu i 3 ml eteru naftowego i niewielką ilością CaCO 3 (ok. 1 g). Po dokładnym roztarciu liści, zabarwiony ekstrakt odsącza się. Ekstrakt przenosi się do rozdzielacza dodaje 20 ml eteru naftowego, a następnie przemywa 20 ml 10% wodnego roztworu NaCl. Całość dokładnie wytrząsa się przez około 5 minut i odstawia do rozdzielenia. Dolną warstwę (wodną) spuszcza się z rozdzielacza, a warstwę organiczną przemywa 4-krotnie za pomocą 10 ml wody destylowanej. Po przemyciu ekstrakt przenosi się do erlenmajerki i suszy za pomocą bezwodnego Na 2 SO 4. Ciecz odsącza się i zatęŝa do objętości 3-5 ml (Uwaga!! NaleŜy bardzo ostroŝnie podgrzewać, ze względu na moŝliwość rozkładu barwników). Przygotowanie eluentów Eluentem jest mieszanina eteru naftowego i acetonu w stosunku 4:1 (v/v). Napełnianie kolumny
Sposób napełniania kolumny ma decydujący wpływ na poprawny rozdział substancji z uŝyciem chromatografii kolumnowej. Czystą i suchą kolumnę umieszcza się na statywie w pozycji pionowej. Przy wylocie kolumny naleŝy umieścić zlewkę do odbierania eluentu. W zlewce przygotować zawiesinę Ŝelu krzemionkowego w eterze naftowym (w stosunku 1:5). Następnie zawiesinę w zlewce naleŝy zamieszać i zdecydowanie, ale niezbyt szybko wlać do kolumny do około 2/3 wysokości. Nie moŝna dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza oraz szczelin wewnątrz złoŝa. Na warstwie Ŝelu krzemionkowego moŝna umieścić odpowiednio dopasowany krąŝek bibuły. W trakcie napełniania kran powinien być nieznacznie otwarty, aby umoŝliwić sączenie się rozpuszczalnika z kolumny. Po napełnieniu pozostawić kran minimalnie otwarty, aby umoŝliwić upakowanie poprawne upakowanie fazy nieruchomej. Pozostawić w kolumnie tyle rozpuszczalnika, aby sięgał kilka mm powyŝej powierzchni piasku. Bardzo waŝne jest, aby nie dopuścić do wysuszenia kolumny, tzn. poziom cieczy nie moŝe obniŝyć się poniŝej powierzchni piasku. Rozdzielanie substancji na kolumnie chromatograficznej Ekstrakt eterowy wprowadzić ostroŝnie za pomocą pipety bezpośrednio na adsorbent, starając się aby roztwór nie spływał po ściankach kolumny. Odczekać, aŝ ekstrakt wsiąknie w powierzchnię Ŝelu krzemionkowego, a następnie dodać eluent (eter naftowy). Gdy poziom rozpuszczalnika obniŝy się w kolumnie do poziomu adsorbenta, naleŝy dodać następną porcję eluentu. Przy uŝyciu pipety 10 ml ekstraktu z liści dodaje się ostroŝnie na warstwę adsorbentu, starając się aby roztwór nie spływał po ściankach kolumny. Odczekać, aŝ ekstrakt wsiąknie w powierzchnię Ŝelu krzemionkowego, a następnie dodać eluent. Następnie eluent dodaje się powoli tak, aby nie spowodować wzajemnego mieszania się. Po dodaniu eluentu naleŝy otworzyć kran. Faza ruchoma zaczyna przepływać przez kolumnę, na cząsteczkach adsorbentu zachodzi rozwijanie chromatogramu. W trakcie przepływu fazy ruchomej następuje rozdział składników ekstraktu. śółte pasmo pochodzące od ß-karotenu powinno wędrować pierwsze, podczas gdy zielone pasmo (nierozdzielone chlorofile a i b) pozostaje dłuŝej na szczycie warstwy adsorbenta. Wypływającą fazę ruchomą naleŝy zbierać, w erlanmajerkach, które naleŝy zmieniać, jeśli następuje zmiana koloru wypływającej fazy ruchomej. Aby przyspieszyć zbieranie następnych frakcji, moŝna zwiększyć polarność eluentu poprzez dodatek niewielkiej ilości np. acetonu do eteru naftowego (ok. 5%). Zebrane frakcje przenieść (ilościowo) do kolbek miarowych o objętości 25 ml, dopełnić do kreski eterem naftowym i dokładnie wymieszać. Wykonać widma UV-vis otrzymanych roztworów, stosując eter naftowy jako roztwór odniesienia. Opisać widma i przeprowadzić interpretację. Następnie oznaczyć ilościowo zawartość chlorofilu a i b.
Wyniki i dyskusja 1) Analiza widm absorpcyjnych opisać pasma absorpcji charakterystyczne dla barwników porfirynowych i karotenu, wyznaczyć λ max pasm i wartości absorbancji. 2) Obliczyć zawartości chlorofilu a i b w badanej próbce, z wykorzystaniem podanych wartości molowych współczynników absorpcji (Załącznik 1 i 2). W tym celu naleŝy odczytać molowe współczynniki absorpcji dla λ max pasm absorpcji chlorofilu a i b. Następnie ułoŝyć układ równań (prawo addytywności absorbancji) i obliczyć stęŝenie molowe chlorofilu a i b. 3) Na podstawie stęŝeń molowych wyznaczyć stosunek wagowy chlorofilu a do chlorofilu b w próbce. 4) Obliczyć zawartość karotenu w badanej próbce, korzystając z podanych wartości molowych współczynników absorpcji (Załącznik 3). Masy molowe barwników: M chlorofil a = 893.5 g/mol M chlorofil b = 907.48 g/mol M karoten = 536.88 g/mol Zagadnienia teoretyczne: Barwniki porfirynowe. Chlorofil a i b. Karotenoidy. Karoten. Budowa chemiczna, występowanie, właściwości fizyko-chemiczne, zastosowanie chlorofilu i karotenu. Spektrofotometria. Prawa absorpcji. Chromatografia cieczowa. Zasada rozdziału substancji metodą chromatografii kolumnowej. Szereg eluotropowy.
ZAŁĄCZNIK 1. Molowy współczynnik absorpcji chlorofilu a w eterze dietylowym The molar extinction coefficient of Chlorophyll a, diethyl ether dissolved in diethyl ether based on the absorbance measurements made by Junzhong Li on 12/11/97 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Co rkan, J. S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry," Photochemistry and Photobiology, 68, 141-142, 1998]. The absorbance data was normalized to have an extinction coefficient of 111700 at 427.75 nm [H. H. Strain, M. R. Thomas, and J. J. Katz, "Spectral absorption properties of ordinary and fully deuteriated chlorophylls a and b," Biochim. Biophys. Acta, 75, 306-311, 1963]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption coefficient in (cm ), multiply by the -1molar concentration and 2.303. 600,06 9179 633,06 8280 667,00 51467 601,00 9571 634,00 8555 667,94 44368 602,13 10121 634,94 8691 669,06 37375 603,06 10660 636,06 8962 670,00 31441 604,00 11069 637,00 9365 670,94 26259 604,94 11355 637,94 9960 672,06 20774 606,06 11773 639,06 10992 673,00 16648 607,00 12214 640,00 12118 673,94 12681 607,94 12516 640,94 12828 675,06 9502 609,06 12778 642,06 14788 676,00 7493 610,00 12803 643,00 15996 676,94 6105 610,94 13152 643,94 17870 678,06 5030 612,06 13079 645,06 20619 679,00 3863 613,00 13177 646,00 23306 679,94 3448 613,94 13301 646,94 26422 681,06 2686 615,06 13150 648,06 30857 682,00 2412 616,00 13147 649,00 33868 682,94 2036 616,94 13108 649,94 37370 684,06 1653 618,06 12769 651,06 42694 685,00 1542 619,00 12536 652,00 48478 685,94 1494 619,94 12277 652,94 53639 687,06 1328 621,06 12016 654,06 60937 688,00 1115 622,00 11597 655,00 66796 688,94 925 622,94 11119 655,94 72129 690,06 863 624,06 10585 657,06 77768 691,00 1003 625,00 9941 658,00 81497 691,94 885 625,94 9860 658,94 83855 693,06 937 627,06 9391 660,06 85266 694,00 854 628,00 9131 661,00 83927 694,94 409 628,94 8769 661,94 81656 696,06 638 630,06 8496 663,06 77375 697,00 704 600,06 9179 664,00 72171 697,94 630 631,00 8572 664,94 66094 699,06 449 631,94 8201 666,06 57884 700,00 450
ZAŁĄCZNIK 2. Molowy współczynnik absorpcji chlorofilu b w eterze dietylowym The molar extinction coefficient of Chlorophyll b dissolved in diethyl ether based on the absorbance measurements made by Junzhong Li on 12/11/97 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Corkan, J. S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry," Photochemistry and Photobiology, 68, 141-142, 1998]. The absorbance data was normalized to have an extinction coefficient of 159100 at 435.8 nm [L. P. Vernon and G. R. Seely, The chlorophylls, Academic Press, 1966]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption coefficient in (cm ), multiply by the molar concentration and 2.303. -1 600,00 10493 635,00 33244 670,00 1795 601,00 10179 636,00 37726 671,00 1701 602,00 9862 637,00 42367 672,00 1589 603,00 9546 638,00 46940 673,00 1526 604,00 9310 639,00 51054 674,00 1455 605,00 9107 640,00 54563 675,00 1391 606,00 8944 641,00 57137 676,00 1364 607,00 8906 642,00 58501 677,00 1299 608,00 8841 643,00 58556 678,00 1262 609,00 8815 644,00 57292 679,00 1194 610,00 8808 645,00 54581 680,00 1131 611,00 8806 646,00 50881 681,00 1069 612,00 8769 647,00 46348 682,00 1009 613,00 8706 648,00 41392 683,00 957 614,00 8618 649,00 36181 684,00 886 615,00 8514 650,00 31067 685,00 835 616,00 8439 651,00 26218 686,00 784 617,00 8349 652,00 21890 687,00 735 618,00 8246 653,00 18120 688,00 689 619,00 8259 654,00 14976 689,00 671 620,00 8313 655,00 11882 690,00 638 621,00 8488 656,00 9493 691,00 592 622,00 8723 657,00 8889 692,00 585 623,00 9115 658,00 7303 693,00 552 624,00 9658 659,00 6030 694,00 538 625,00 10382 660,00 5228 695,00 515 626,00 11278 661,00 4502 696,00 514 627,00 12412 662,00 3974 697,00 508 628,00 13780 663,00 3551 698,00 495 629,00 15411 664,00 3136 699,00 472 630,00 17303 665,00 2797 700,00 473 631,00 19561 666,00 2500 632,00 22295 667,00 2307 633,00 25376 668,00 2120 634,00 29094 669,00 1947
ZAŁĄCZNIK 3. Molowy współczynnik absorpcji beta-karotenu w heksanie The molar extinction coefficient of Beta-carotene dissolved in hexane based on the absorbance measurements made by R. A. Fuh on summer, 95 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Corkan, J. S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry," Photochemistry and Photobiology, 68, 141-142, 1998]. The absorbance data was normalized to have an extinction coefficient of 139500 at 451 nm [L. Zechmeister, cis-trans Isomeric carotenoids vitamins A and arylpolyenes, Springer-Verlag, 1962]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption coefficient in (cm ), multiply by the molar concentration and 2.303. 400.00 58312 434.00 110004 468.00 108432 401.00 61186 435.00 111436 469.00 107608 402.00 62303 436.00 113197 470.00 108427 403.00 62920 437.00 114129 471.00 109283 404.00 63627 438.00 116147 472.00 109198 405.00 66127 439.00 117944 473.00 110148 406.00 66631 440.00 120966 474.00 111409 407.00 68117 441.00 123367 475.00 112395 408.00 68189 442.00 126781 476.00 111765 409.00 70135 443.00 127835 477.00 110405 410.00 73202 444.00 130510 478.00 112368 411.00 75463 445.00 132087 479.00 110711 412.00 76634 446.00 135095 480.00 110769 413.00 78693 447.00 135383 481.00 108409 414.00 80427 448.00 136271 482.00 106765 415.00 82224 449.00 136699 483.00 104356 416.00 86390 450.00 138730 433.00 109801 417.00 88259 451.00 139500 485.00 96758 418.00 91673 452.00 137401 486.00 95114 419.00 94790 453.00 137572 487.00 89497 420.00 97375 454.00 135550 488.00 85048 421.00 99496 455.00 133122 489.00 80611 422.00 100442 456.00 130983 490.00 76107 423.00 103176 457.00 129479 491.00 71000 424.00 103338 458.00 126808 492.00 66888 425.00 105923 459.00 124367 493.00 62996 426.00 106094 460.00 121174 494.00 58560 427.00 105775 461.00 118336 495.00 52736 428.00 106824 462.00 116273 496.00 49926 429.00 107216 463.00 113535 497.00 45332 430.00 106824 464.00 112332 498.00 40459 431.00 107572 465.00 110148 499.00 36338 432.00 109040 466.00 110161 500.00 32662 484.00 100163 467.00 107995 700.00 1437