ROZDZIAŁ, IDENTYFIKACJA I ANALIZA ILOŚCIOWA CHLOROFILU I KAROTENU METODĄ SPEKTROSKOPII ABSORPCYJNEJ

Transkrypt

1 ROZDZIAŁ, IDENTYFIKACJA I ANALIZA ILOŚCIOWA CHLOROFILU I KAROTENU METODĄ SPEKTROSKOPII ABSORPCYJNEJ Barwniki odpowiedzialne za barwę liści to między innymi chlorofile i karotenoidy. Chlorofile należą do grupy roślinnych barwników porfirynowych. Występują w chloroplastach i mają istotne znaczenie w procesie fotosyntezy u roślin wyższych (chlorofil a i b), glonów i bakterii (bakteriochlorofile). H 2 C CH R H 3 C CH 2 H 3 C H H 2 C C O R 1 N N Mg N N CH 2 H H O C O O H 3 C O R = (odmiana a) CHO (odmiana b) R 1 = fitol Rysunek 1. Wzór strukturalny chlorofilu (R 1 = fitol - reszta 20-węglowego nienasyconego alifatycznego alkoholu o właściwościach hydrofobowych, połączonego wiązaniem estrowym z grupą kwasową). Chlorofile są dosyć nietrwałe. W żywych tkankach występują w formie związanej np. z białkami, fosfolipidami, co powoduje stabilność zielonej barwy. Z kolei zniszczenie żywej tkanki roślinnej oraz struktury chlorofili poprzez np. ogrzewanie, odwadnianie, kontakt z rozpuszczalnikami, enzymami, prowadzi do przemian chlorofili i zmiany barwy. Rozpad chlorofilu przyśpiesza również działanie światła i tlenu. W środowisku kwaśnym następuje przemiana chlorofilu, związana z zastąpieniem jonu magnezu poprzez dwa jony wodoru i powstanie feofityny (oliwkowozielona) lub przy niższym ph, również odszczepienie fitolu i powstanie feoforbidyny (brunatna barwa). Środowisko zasadowe prowadzi do hydrolizy wiązań estrowych, z zachowaniem jonu magnezu w strukturze chlorofilu a produktami reakcji są chlorofiliny (zielona barwa), które pod wpływem enzymu chlorofilazy tracą fitol i przekształcają chlorofilidy. Chlorofile z łatwością ulegają reakcji wymiany jonów magnezu na jony metali dwuwartościowych, takich jak żelazo (barwa szarobrunatna), miedź (zielona barwa) czy cynk (również barwa zielona). Barwniki chlorofilowe, jak również ich pochodne, znajdują zastosowanie w przemyśle spożywczym, kosmetycznym i farmaceutycznym. 1

2 Chlorofile zalicza się do grupy związków chelatowych. Szkielet struktury to cykliczny układ czterech połączonych ze sobą, przez mostki metinowe (=CH ), pierścieni pirolowych oraz centralnie położonego dwuwartościowego jonu magnezu połączonego z atomami azotu pierścieni pirolowych a także podstawników charakterystycznych dla danej odmiany chlorofilu (Rysunek 1). Z uwagi na obecność podwójnych wiązań sprzężonych chlorofile są efektywnymi fotoreceptorami. Charakterystyczną cechą takich związków jest bardzo silna absorpcja w zakresie światła widzialnego wyrażona poprzez wysokie molowe współczynniki absorpcji, jedne z najwyższych, jakie znane są dla związków organicznych (rysunki poniżej). Molowy współczynnik absorpcji Chlorofil a w eterze dietylowym Długość fali, nm 2

3 Molowy współczynnik absorpcji Chlorofil b w eterze dietylowym Długość fali, nm Metaloporfiryny podobnie jak porfiryny charakteryzują się obecnością dwóch pasm absorpcji w zakresie UV-vis. Pierwsze, to dość ostre pasmo, zwane pasmem Soreta (nazwisko francuskiego fizyka Charlesa Soreta) znajduje się w zakresie nm a molowy współczynnik absorpcji ε jest rzędu Drugie pasmo Q, składające się z czterech części składowych (wolne porfiryny) jest około 10 razy słabsze i leży w zakresie nm. W przypadku metalopochodnych porfiryny ilość pasm Q ulega zmniejszeniu z czterech do dwóch lub trzech, natomiast pasmo Soreta przesunięciu wraz ze zmianą molowego współczynnika absorpcji. Karoten jest naturalnie występującym barwnikiem z grupy karotenoidów. Karotenoidy występują w liściach, lecz ich żółto-pomarańczowa barwa jest zwykle maskowana przez intensywną, zieloną barwę chlorofilu. Odpowiedzialne są za piękną barwę wielu owoców (ananas, owoce cytrusowe, pomidory, papryka), kwiatów (narcyz, pozłotka) oraz upierzenie Widmo elektronowe ß -karotenu Absorbancja Długość fali, nm 3

4 ptaków (flaming, ibis, kanarek) czy barwa owadów (biedronka), skorupiaków, ryb (łosoś) i żółtka jaj. Karotenoidy zbudowane są z ośmiu jednostek izoprenowych (40 atomów węgla) i należą do grupy tetraterpenów. Należą do nich karoteny i ksantofile. Warto tu wspomnieć o ß- karotenie, który stanowi około 80 % wszystkich karotenów, z uwagi na fakt, że jest prekursorem witaminy A (rysynek poniżej). Karoten występuje między innymi w korzeniu marchwi, stąd jego nazwa. Zawartość chlorofilu oraz karotenu oznacza się metodą spektrofotometryczną, z uwagi na wspomniane wysokie molowe współczynniki absorpcji. Wartości molowych współczynników absorpcji podano w Załączniku 1, 2 i 3, na końcu opisu ćwiczenia. ß -karoten CH 2 OH retinol (witamina A) 4

5 Rysunek 2. Widmo absorpcji chlorofilu a i b. Absorbancja Długość fali, nm Widmo absorpcji zarówno chlorofilu a jak i odmiany b, składa się z dwóch pasm absorpcji (Rysunek 2), maksimum absorpcji chlorofilu a wynosi λ około 430 i 662 nm, natomiast chlorofilu b λ około 452 i 642 nm. Przykładowe widmo barwników wyekstrahowanych z brokułów przedstawiono na Rysunku 3. 3,00E+00 2,50E+00 absorbancja 2,00E+00 1,50E+00 1,00E+00 karoten chlorofile 5,00E-01 0,00E długość fali, nm Rysunek 3. Widmo z zakresie widzialnym po rozdziale chromatograficznym chlorofili oraz karotenu w ekstrakcie eterowym uzyskanym z brokułów. 5

6 Opis wykonania ćwiczenia: Odczynniki: - eter naftowy, eter dietylowy - żel krzemionkowy (około 4g) - 70 g próbka materiału roślinnego (np. szpinak, natka pietruszki, brokuły) Sprzęt: - moździerz - kolumna szklana (30 ml, średnica 2.5 cm) - zlewki - lejek szklany - cylinder miarowy (50ml) - pipety Pasteura - kolbki miarowe (25 ml) - wata, bibuła filtracyjna Wykonanie ćwiczenia: 1) Przygotowanie kolumny chromatograficznej Kolumnę umocować w pozycji pionowej na statywie. W dolnej części kolumny umieścić niewielką ilość waty. W zlewce przygotować zawiesinę żelu krzemionkowego w eterze naftowym (w stosunku 1:5). Zawiesinę żelu dodawać porcjami przez lejek, dobrze mieszając i ubijając bagietką, tak aby nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza oraz szczelin wewnątrz złoża. Na warstwie żelu krzemionkowego można umieścić odpowiednio dopasowany krążek bibuły. UWAGA! W czasie przygotowania kolumny i rozdziału chromatograficznego nigdy nie należy dopuścić do wysuszenia złoża krzemionkowego. Poziom cieczy powinien być zawsze nad powierzchnią adsorbenta. 6

7 2) Przygotowanie ekstraktu Materiał roślinny rozdrobnić i umieścić w moździerzu, dodając 50 ml eteru naftowego. Ucierać mieszaninę do momentu, aż roztwór stanie się intensywnie zielony (kilka minut). Ostrożnie zdekantować ciecz i przenieść do kolbki okrągłodennej. Ekstrakt odparować na wyparce próżniowej do objętości około 1-2 ml. 3) Rozdział chromatograficzny Ekstrakt eterowy wprowadzić ostrożnie za pomocą pipety bezpośrednio na adsorbent, starając się aby roztwór nie spływał po ściankach kolumny. Odczekać, aż ekstrakt wsiąknie w powierzchnię żelu krzemionkowego, a następnie dodać eluent (eter naftowy). Gdy poziom rozpuszczalnika obniży się w kolumnie do poziomu adsorbenta, należy dodać następną porcję eluentu. Czynność dodawania kolejnych porcji rozpuszczalnika powtarzać do momentu rozdziału barwników. Żółte pasmo pochodzące od β-karotenu powinno wędrować pierwsze, podczas gdy zielone pasmo (nierozdzielone chlorofile a i b) pozostaje dłużej na szczycie warstwy adsorbenta. W momencie pojawienia się na dnie kolumny pierwszego składnika ekstraktu (karoten), należy zebrać frakcję do fiolki i ją opisać. Aby przyspieszyć zbieranie następnych frakcji, można zwiększyć polarność eluentu poprzez dodatek niewielkiej ilości eteru etylowego do eteru naftowego (ok. 5%). Zebrane frakcje przenieść (ilościowo) do kolbek miarowych o objętości 25 ml, dopełnić do kreski eterem naftowym i dokładnie wymieszać. 7

8 Wykonać widma UV-vis otrzymanych roztworów, stosując eter naftowy jako roztwór odniesienia. Opisać widma i przeprowadzić interpretację. Następnie oznaczyć ilościowo zawartość chlorofilu a i b. Sprawozdanie z ćwiczenia powinno obejmować następujące punkty: 1) Analiza widm absorpcyjnych opisać pasma absorpcji charakterystyczne dla barwników porfirynowych i karotenu, wyznaczyć λ max pasm i wartości absorbancji. 8

9 2) Obliczyć zawartości chlorofilu a i b w badanej próbce, z wykorzystaniem podanych wartości molowych współczynników absorpcji (Załącznik 1 i 2). W tym celu należy odczytać molowe współczynniki absorpcji dla λ max pasm absorpcji chlorofilu a i b. Następnie ułożyć układ równań (prawo addytywności absorbancji) i obliczyć stężenie molowe chlorofilu a i b. 3) Na podstawie stężeń molowych wyznaczyć stosunek wagowy chlorofilu a do chlorofilu b w próbce. 4) Obliczyć zawartość karotenu w badanej próbce, korzystając z podanych wartości molowych współczynników absorpcji (Załącznik 3). Masy molowe barwników: M chlorofil a = M chlorofil b = M karoten = Zagadnienia teoretyczne: Barwniki porfirynowe. Chlorofil a i b. Karotenoidy. Karoten. Budowa chemiczna, występowanie, właściwości fizyko-chemiczne, zastosowanie chlorofilu i karotenu. Spektrofotometria. Prawa absorpcji. Interpretacja widm Abs=f(λ). Schemat budowy spektrofotometru. Bibliografia: 1) L. Stryer, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa ) J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa ) B. D. Hames, N. M. Hooper, J. D. Houghton, Krótkie wykłady Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa ) A. I. Vogel, Preparatyka organiczna, WNT 2006 lub wcześniejsze wydania 5) W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa, ) D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, S. R. Crouch, Podstawy chemii analitycznej, T. 2, PWN, Warszawa, ) M. Dżugan, Zeszyty Naukowe, URz, 7, 27, ) 7) 8) 9) J. Dargiewicz-Nowicka, S. Radzki, Acta Bio-Opt. Inf. Med. 2, 119,

10 ZAŁĄCZNIK 1. Molowy współczynnik absorpcji chlorofilu a w eterze dietylowym The molar extinction coefficient of Chlorophyll a, diethyl ether dissolved in diethyl ether based on the absorbance measurements made by Junzhong Li on 12/11/97 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Corkan, J. S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry," Photochemistry and Photobiology, 68, , 1998]. The absorbance data was normalized to have an extinction coefficient of at nm [H. H. Strain, M. R. Thomas, and J. J. Katz, "Spectral absorption properties of ordinary and fully deuteriated chlorophylls a and b," Biochim. Biophys. Acta, 75, , 1963]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption coefficient in (cm -1 ), multiply by the molar concentration and lambda Extinction nm cm-1/m lambda Extinction nm cm-1/m

11 ZAŁĄCZNIK 2. Molowy współczynnik absorpcji chlorofilu b w eterze dietylowym The molar extinction coefficient of Chlorophyll b dissolved in diethyl ether based on the absorbance measurements made by Junzhong Li on 12/11/97 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Corkan, J. S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry," Photochemistry and Photobiology, 68, , 1998]. The absorbance data was normalized to have an extinction coefficient of at nm [L. P. Vernon and G. R. Seely, The chlorophylls, Academic Press, 1966]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption coefficient in (cm -1 ), multiply by the molar concentration and lambda Extinction nm cm-1/m lambda Extinction nm cm-1/m

12 ZAŁĄCZNIK 3. Molowy współczynnik absorpcji beta-karotenu w heksanie The molar extinction coefficient of Beta-carotene dissolved in hexane based on the absorbance measurements made by R. A. Fuh on summer, 95 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Corkan, J. S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry," Photochemistry and Photobiology, 68, , 1998]. The absorbance data was normalized to have an extinction coefficient of at 451 nm [L. Zechmeister, cis-trans Isomeric carotenoids vitamins A and arylpolyenes, Springer-Verlag, 1962]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption coefficient in (cm -1 ), multiply by the molar concentration and lambda Extinction nm cm-1/m lambda Extinction nm cm-1/m