S ł u p s k i e P r a c e B i o l o g i c z n e 3 2006 WPŁYW OŁOWIU NA ROZWÓJ ROŚLIN POMIDORA LYCOPERSICON SP. OKREŚLONY W WARUNKACH IN VITRO THE EFFECTS OF LEAD ON GROWING TOMATO PLANTS LYCOPERSI- CON SP. DETERMINED IN VITRO CULTURES Tomasz Furmanek, Małgorzata Andrzejewska-Ponomarev Akademia Pomorska Zakład Biologii Eksperymentalnej i Ochrony Środowiska ul. Arciszewskiego 22b, 76-200 Słupsk e-mail: furmanek@pap.edu.pl ABSTRACT Anthropogenic pollutions, especially those caused by heavy metals are very toxic for the environment. Lead is dangerous for plants because it removes magnesium from chlorophyll particles, perturbs water-mineral economy and participates in creating reactive oxygen forms. It is very important, for a researcher, to understand the defense tactic of plants against stress. Our aim is to study effects of Pb on in vitro cultures. The obtained results permit to state the inhibitory effect of Pb on the growth and development of plants (especially roots). Reactions of tomato forms on Pb pollution were different. A greater malondialdehyde (MDA) concentration was observed in roots. There are some mechanisms in that plant preventing the MDA distribution to the above-ground parts. Słowa kluczowe: pomidor, skażenie, ołów, stres, dialdehyd malonowy Key words: tomato, lead, stress, malondialdehyde WPROWADZENIE Naturalne środowisko przyrodnicze charakteryzuje równowaga ekologiczna. Jest to całokształt oddziaływań między atmosferą, litosferą, hydrosferą i biosferą. Człowiek jako specyficzny element biosfery zmienia tę równowagę doprowadzając często do niekorzystnych zmian. Jednym z najbardziej szkodliwych dla roślin i człowieka czynników antropogenicznych są metale ciężkie, a wśród nich ołów. Szkodliwy wpływ ołowiu wynika z jego dużego powinowactwa z makromolekułami, szczególnie zaś z białkami. W przypadku roślin oddziałuje on na morfologię i anatomię roślin. Objawia się to głównie zahamowaniem wzrostu. Ołów hamuje podziały komórkowe oraz osłabia procesy metaboliczne. Zaburzając pobieranie 5
wody i pierwiastków śladowych opóźnia proces kiełkowania nasion (Rapacz 1994). Przy ph kwaśnym ołów przyspiesza powstawanie niedostępnych form fosforu (Burzyński i Buczek 1994). Ołów inaktywuje podstawowe dla metabolizmu enzymy, narusza równowagę elektrolityczną, zaburza transport elektronów w mitochondriach i podczas fotosyntezy. Jest sprawcą stresu oksydacyjnego i powstawania wolnych rodników (Bartosz 1995). Wolne rodniki jako reaktywne formy tlenu prowadzą do zakłóceń wzrostu i rozwoju roślin. Ich duże stężenie powoduje uszkodzenia strukturalne i funkcjonalne komórek. Jednym z następstw stresu oksydacyjnego jest peroksydacja lipidów. Rośliny nie są jednak bezbronne wobec toksycznego działania ołowiu, wytwarzając np. substancje obronne fitochelatyny (Kopcewicz i Lewak 2002), homofitochelatyny, kwasy organiczne i białka metalotioneinopodobne (Górecki i Grzesiuk 2002). Poznano biotransformację ołowiu przeciwdziałającą i ograniczającą jego toksyczność (Zakrzewski 1997). Parametrami charakteryzującymi reakcje obronne są: stężenie kationów w tkankach, stężenie hormonów stresowych i produktów reakcji katalizowanych przez te białka (Małecka i inni 2001). Celem badań była ocena reakcji roślin pomidora na skażenie ołowiem w kulturach in vitro. Pomidor jest rośliną modelową w wielu badaniach z zakresu biotechnologii i transformacji genetycznych. Stąd znalezienie form tolerancyjnych na skażenie gleby ołowiem i ewentualnie genów determinujących tę tolerancję mogłoby być wykorzystane w pracach nad innymi roślinami. Problemem jest bowiem uprawa roślin w pobliżu szlaków komunikacyjnych i możliwość ich wykorzystania. MATERIAŁ I METODY BADAŃ Materiałem badawczym były rośliny dzikich form pomidora: Lycopersicon peruvianum (L.) Mill 12643 i L. hirsutum Humb. et Bonp. LA1392; linii hodowlanej Rm oraz odmian uprawnych: Delta, Alka i Beta. Nasiona form uprawnych otrzymano z firm hodowlanych PH-N L. Legutko i POLAN Kraków, form dzikich z Tomato Genetics Resource Center Department of Vegetable Crops Uniwersytetu Kalifornijskiego w USA. Regenerację roślin wykonano według metody Fari i in. (1991) w modyfikacji własnej. Nasiona sterylizowano kolejno przez 30 minut w 70 etanolu i przez 15 minut w 0,1% NaOCl. Przed założeniem doświadczenia płukano je trzykrotnie w sterylnej wodzie destylowanej. Tak przygotowane nasiona wykładano na pożywkę stałą MS bez witamin i regulatorów wzrostu (Murashige i Skoog 1962). Okres inicjacji kiełkowania nasion trwał 10 dni. Otrzymane siewki dekapitowano powyżej liścieni, a łodyżki z pąkiem wierzchołkowym wykładano na świeżą pożywkę elongacyjną. Po 4 tygodniach trwania kultury fragmenty łodyg z pączkami bocznymi wykładano na pożywkę namnażającą. Z otrzymanych wieloroślinek wycinano pędy (o długości 1,5 cm i 2 liściach) i ukorzeniano na pożywce kontrolnej oraz pożywce z dodatkiem Pb(NO 3 ) 2 w ilości 1mM. dm -3. Dodatek ołowiu ustalono na podstawie danych literaturowych (Zacchini i in. 2003). Po 14 dniach rośliny zważono, zmierzono ich wysokość i długość korzeni oraz policzono liście i korzenie. Wykonano także analizę stężenia dialdehydu malonowego (MDA) w korzeniach i liściach. Pomiary wykonano 4 razy po 60 roślin w każdym wariancie. Oznaczenie MDA wykonano według metody Takahamy i Nashimury w modyfikacji Morkunas i in. (2000). Stężenie MDA obliczano korzystając z prawa Lamberta-Beera, odczytując wartość absorbancji supernatu przy długości fali 532 nm i 600 nm na spektrofotometrze UV/Vis Model U-2001 Hitachi. Otrzymane wyniki badań opracowano statystycznie za pomocą analiz wariancji i najmniejszych istotnych różnic NIR 0,05. 6
WYNIKI I DYSKUSJA Reakcja roślin na ołów jest przedmiotem badań wielu uczonych (Łukasik i in. 2000). Rośliny narażone na działanie ołowiu wykazują zahamowanie wzrostu, spowodowane zaburzeniami w funkcjonowaniu błon biologicznych (Starck i in. 1995). Efektem dysfunkcji błon komórkowych są zaburzenia w pobieraniu ważnych biologicznie pierwiastków (Filek 2000). Na podstawie otrzymanych wyników badań stwierdzono, że rośliny ukorzenione na pożywce z ołowiem charakteryzowały się zahamowanym wzrostem (tab. 1), obserwowano przebarwienia liści i brązowienie korzeni. Rośliny testowe w stosunku do roślin kontrolnych charakteryzowały się niższą o 26% masą. U odmiany uprawnej Alka stwierdzono największe różnice między roślinami testowymi i kontrolnymi, natomiast najmniejsze u formy L. peruvianum. Różnice te były statystycznie udowodnione. Rośliny ukorzenione na pożywce z ołowiem były wyrównane pod względem wysokości 30-34 mm. U roślin z wariantu testowego stwierdzono mniej liści, lecz nie były to różnice statystycznie istotne. Dodatek ołowiu w największym stopniu wpłynął na rozwój systemu korzeniowego. Rośliny w próbie testowej wszystkich badanych form pomidora wykształciły istotnie mniej korzeni. W przypadku form dzikich liczba korzeni prób kontrolnej i testowej nie różniły się statystycznie. Natomiast analizując długość otrzymanych korzeni można stwierdzić, że rośliny testowe wykształciły korzenie krótsze i tylko w przypadku L. hirsutum różnice te nie zostały statystycznie udowodnione. Wyliczone współczynniki zmienności dla masy roślin oraz ich wysokości wskazują, że w obrębie roślin testowych linii hodowlanej oraz form dzikich istnieje duża zmienność tych cech 22-41%. Współczynniki zmienności dla cechy liczba na poziomie 25-36% stwierdzono w grupie roślin testowych odmian uprawnych. Dużą zmienność cechy masa korzeni 30-43% stwierdzono w grupie roślin testowych wszystkich badanych form pomidora. Analizując zmienność liczby korzeni należy wskazać na odmianę Alka (WZ% 33%), natomiast na długość korzeni na formy dzikie (tab. 2). Otrzymane wyniki pozwalają sądzić, że w obrębie każdej formy, 7
8
Formy pomidora Tomato forms Współczynniki zmienności (Wz%) wybranych cech morfologicznych roślin pomidora ukorzenionych in vitro Variability coefficients (Wz%) of selected morphological properties of tomato plants in vitro rooting Masa Weight Wysokość Height Cechy morfologiczne roślin Morphological plant properties Liczba Masa liści korzeni Number Weight of leaves of roots Liczba korzeni Number of roots Długość korzeni Length of roots Pożywka Medium K Pb K Pb K Pb K Pb K Pb K Pb Odmiany Delta 31 23 12 14 12 25 26 36 25 14 14 15 uprawne Beta 14 18 16 17 21 30 22 41 14 17 16 21 Crop Alka 20 11 15 10 15 36 15 30 18 33 22 11 variety Linia hodowlana Breeding 14 25 22 37 10 8 11 41 12 21 22 14 line Rm Tabela 2 Table 2 l. peruvianum l. hirsutum 11 33 18 41 14 12 18 43 14 11 10 33 15 22 10 22 22 24 20 33 8 22 12 29 K pożywka kontrolna control medium Pb pożywka z dodatkiem Pb(NO 3 ) 2 medium with addition of Pb(NO 3 ) 2 a zwłaszcza wśród form dzikich występują genotypy tolerancyjne na niesprzyjające warunki. Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że wzrosło stężenie aldehydu malonowego u roślin pomidora poddanych działaniu ołowiu w pożywce. Zarówno w liściach, jak i w korzeniach obserwowano podwyższony jego poziom. Ale tylko w przypadku korzeni różnice te zostały statystycznie udowodnione (tab. 3). Najwyższy poziom MDA w liściach próby testowej i kontrolnej stwierdzono u roślin odmiany uprawnej Alka, najniższy u formy L. peruvianum. Analizując korzenie otrzymane w warunkach stresowych wykazano, że najwyższym stężeniem MDA wyróżniała się odmiana Beta, najniższym L. hirsutum. Tabela 3 Stężenie MDA [µmol. dm -3 ] w częściach roślin pomidora ukorzenionych in vitro Table 3 MDA concentration [µmol. dm -3 ] in tomato plant fragments in vitro rooting Formy pomidora Tomato forms Liście Leaves Korzenie Roots Pożywka Medium K Pb K Pb Odmiany Delta 2,621 2,689 2,532 3,011* 9
uprawne Crop variety Linia hodowlana Breeding line Rm l. peruvianum Beta 2,683 2,711 2,663 3,155* Alka 2,778 2,822 2,558 3,089* 2,114 2,189 2,010 2,998* 1,514 1,577 1,457 1,998* l. hirsutum 1,611 1,724 1,558 1,897* Średnia Mean 2,247 2,275 2,130 2,691* * różnice statystycznie istotne K pożywka kontrolna control medium Pb pożywka z dodatkiem Pb(NO 3 ) 2 medium with addition of Pb(NO 3 ) 2 Reakcja form naturalnych (dzikich) na skażenie ołowiem była łagodniejsza niż reakcja odmian uprawnych. Ze względu na swoją odrębność genetyczną i dużą ekspresję cech dziedzicznych, formy naturalne są dobrym materiałem w hodowli pomidora (Hassan i in. 1989, Asins i in. 1993). Zgodnie z sugestiami tych autorów wśród gatunków biorących udział w doświadczeniu na uwagę zasługują L. hirsutum i L. peruvianum. Ołów gromadzony jest w roślinach nierównomiernie. Największe jego stężenie obserwuje się w organach bezpośrednio narażonych na kontakt z jego związkami (Kopcewicz i Lewak 2002). W prezentowanych badaniach większy szkodliwy wpływ ołowiu zaobserwowano we wzroście korzeni niż części nadziemnych. Zdaniem Woźnego (1995) ołów jest nieodwracalnie wiązany w ścianach komórkowych lub gromadzony w wakuoli. Zapobiega to więc jego transportowi do pędu, co częściowo łagodzi negatywne skutki jego działania (Harborne 1997, Jędrzejczyk i in. 2002). U roślin ukorzenionych na pożywce z ołowiem największe stężenie MDA stwierdzono w tkankach korzeni (tab. 3). Formy naturalne wyróżniały się niską zawartością MDA zarówno w liściach, jak i w korzeniach. Można więc stwierdzić, że większa koncentracja Pb 2+ w komórkach korzeni wywołała wzmożoną peroksydację lipidów (Starck i in. 1995). 10
Badania wymagają kontynuowania. Dalsze etapy doświadczenia powinny opierać się na większej liczbie badanych form oraz analizach innych parametrów fizjologicznych. WNIOSKI 1. Biorące udział w doświadczeniu formy pomidora charakteryzowały się zróżnicowaną reakcją na skażenie ołowiem. 2. Ołów wpłynął negatywnie na wzrost roślin. Rośliny testujące tolerancję miały mniejszą masę i wysokość. Mniejszy negatywny wpływ na te cechy stwierdzono u Lycopersicon peruvianum 12643 i L. hirsutum LA1392. 3. Rośliny ukorzenione w obecności ołowiu charakteryzowały się istotnie krótszymi korzeniami i mniejszą masą. 4. W warunkach stresowych istotnie wyższe stężenie MDA stwierdzono w korzeniach roślin wszystkich badanych form pomidora. LITERATURA Asins M. J., Breto M. P., Carbonell E. A. 1993. Salt tolerance in Lycopersicon species. II Genetic effects and a search for associated traits. Theor. Appl. Genet., 86: 769-774. Bartosz G. 1995. Druga twarz tlenu. PWN. Warszawa. Burzyński M., Buczek J. 1994. The influence of Cd, Pb, Cu and Ni on NO 3 - uptake by cucumber seedlings II. In vitro and in vivo effects of Cd, Cu, Pb and Ni on the plasmalemma ATPase and oxidoreductase from cucumber seedlings roots. Acta Physiol. Plant., 16: 297-303. Fari M., Banki-Peredi A., Tóth-Csanyi 1991. Highly efficient in vitro shoot regeneration system in tomato and eggplant via seedling decapitation method. Acta Horticulturae, 289: 111. Filek M. 2000. Wykorzystanie kultur in vitro w fizykochemicznych badaniach błon komórkowych. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol., 473. Górecki R. J., Grzesiuk S. 2002. Fizjologia plonowania roślin. WUWM. Harborne J. B. 1997. Ekologia biochemiczna. PWN. Warszawa. Hassan A. A., Al.-Afifi Mahmoud A., Matsuda K., Koto A., Itani S. 1989. Sources of salinity tolerance in Lycopersicon species. Bulletin of Faculty of Agriculture University of Cairo, 40: 605-621. Jędrzejczyk M., Rostański A., Małkowski E. 2002. Accumulation of zinc and lead in selected taxa of the genus Viola L. Acta Biol. Cracov. Bot., 44: 49-55. Kopcewicz J., Lewak S. 2002. Fizjologia roślin. PWN. Warszawa. Łukasik I., Palowski B., Kimsa T., Ciepał R. 2000. Effect of road traffic on heavy metal concentration in soil and plants. Acta Biol. Sil., 34: 50-63. Małecka A., Jarmuszkiewicz W., Tomaszewska B. 2001. Antioxidative defense to lead stress in subcellular compartments of pea root cells. Acta Biochim. Pol., 3: 687-698. 11
Murashige T., Skoog E. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: 473-497. Morkunas I., Waplak S., Bednarski W., Ratajczak L., Garnczarska M. 2000. The effect carbohydrate nutrition on free radical formation in pea embryo axes cultivated in vitro. Plant Physiol. Bioch., 38: 132. Rapacz M. 1994. Wpływ jonów Pb 2+ na wzrost oraz dystrybucję ołowiu w różnych organach siewek rzepaku ozimego (Brassica napus ssp. oleifera). Ogólnopolska Konf: Zastosowanie kultur in vitro w fizjologii roślin. ZFR PAN. Kraków: 325-330. Starck Z., Chołuj D., Niemyska B. 1995. Fizjologiczne reakcje roślin na niekorzystne czynniki środowiska. SGGW. Warszawa. Woźny A. 1995. Ołów w komórkach roślinnych: pobieranie, reakcje, odporność. Sorus. Poznań. Zacchini M., Rea E., Tullio M., Agazio M. 2003. Increased antioxidative capacity in maize calli during and after oxidative stress induced by a long lead treatment. Plant Physiol. Bioch., 41: 49-54. Zakrzewski S. F. 1997. Podstawy toksykologii środowiska. PWN. Warszawa. 12