Otwarte seminaria 2014 Instytut Ekologii Terenów Uprzemysłowionych w Katowicach Test mikrojądrowy w badaniach środowiskowych mgr Ewa Błaszczyk Zakład Zarządzania Środowiskowego Zespół Analiz Ryzyka Środowiskowego Katowice, 18 września 2014
Co to są mikrojądra? Mikrojądra są to struktury zawierające jądrowe DNA występujące w cytoplazmie, utworzone przez całe chromosomy lub acentryczne fragmenty chromosomów, czy też chromatyd. W mikroskopie obserwowane są jako mniejsze struktury zlokalizowane w pobliżu jądra komórkowego. Kabalar i wsp. 2012.
Mechanizm powstawania mikrojąder Bezpośrednie zaburzenia Złamania chromosomów błędy w naprawie pęknięć DNA; brak naprawy pęknięć DNA. Dysfunkcje aparatu mitotycznego zaburzenia struktury centromeru; uszkodzenia włókien wrzeciona kariokinetycznego; zmniejszona produkcja tubuliny. SKUTEK - Opóźnienie ruchu chromatyd i/lub chromosomów podczas anafazy, a następnie tworzenie się mikrojąder
Możliwe konsekwencje powstawania mikrojąder 1) Utrata fragmentów chromosomów z jądra komórkowego zwiększa prawdopodobieństwo przetasowania genów, co może prowadzić po ich transpozycji lub amplifikacji do zmiany ekspresji genów i np. aktywacji różnych onkogenów. 2) Utrata całych chromosomów prowadzi do zmian liczbowych (aneuploidii) będącej wspólną cechą wielu nowotworów. Diler i Celik, 2011.
Test mikrojądrowy Test mikrojądrowy metoda służąca do oceny częstości występowania mikrojąder oraz innych zmian cytogenetycznych w warunkach in vitro, in vivo lub in situ, wykorzystywana w badaniach podstawowych oraz monitoringu biologicznym środowiska i ludzi. Pozwala na ocenę: uszkodzeń chromosomów i niestabilności genomu; zaburzeń procesów cytokinezy; zaburzeń potencjału proliferacyjnego; procesów śmierci komórkowej.
Materiał do badań Komórki człowieka Linie komórkowe Komórki gryzoni TEST MIKROJĄDROWY Komórki roślinne Komórki ryb Komórki mięczaków
Podstawowe etapy testu mikrojądrowego 1. Przygotowanie materiału 2. Wykonanie preparatów mikroskopowych 3. Utrwalanie materiału 4. Barwienie 5. Analiza mikroskopowa W zależności od metody i materiału poszczególne etapy mogą się znacznie różnić!
Test mikrojądrowy na liniach komórkowych Materiał do badań: linie komórkowe gryzoni-cho, V79, CHL; ludzkie linie komórkowe BEAS-2B, A549, GM38; linie nowotworowe (ludzkie i zwierzęce) HeLa, HepG2, Caco-2, TK6 i L5178Y, L41784. Zastosowanie: ocena właściwości genotoksycznych substancji chemicznych lub ich mieszanin, produktów farmaceutycznych (w tym leków), promieniowania, próbek środowiskowych.
Test mikrojądrowy na liniach komórkowych Ograniczenia: możliwość prowadzenia doświadczenia tylko na dostępnych liniach komórkowych; możliwość prowadzenia badań in vitro tylko na stabilnych genetycznie liniach komórkowych; wymaga stosowania aktywacji metabolicznej w komórkach nie produkujących enzymów I i II-fazy; stosowanie wariantu z cytochalazyną B może wpływać na uzyskiwane wyniki.
Test mikrojądrowy na liniach komórkowych Protokoły metodyczne: Fenech M. The in vitro micronucleus technigue. Mutation Reserach 455: 81-95, 2000. Kirsch-Volders M. i wsp. Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research 540: 153-163, 2003. OECD Guideline for the Testing of Chemicals 487. In vitro mammalian cell micronucleus test, 2010. Mosesso P. i wsp. In vitro cytogenetic assays: Chromosomal aberrations and micronucleus tests. Methods in Molecular Biology 1044: 123-146, 2013.
Test mikrojądrowy w limfocytach człowieka Materiał do badań- limfocyty krwi obwodowej człowieka. Zastosowanie: ocena narażenia zawodowego (metale, WWA, pyły, itp.); ocena narażenia środowiskowego (zanieczyszczenia wody, gleby, powietrza, tj. radon, arsen, pestycydy, metale, formaldehyd, itp.); ocena wpływu diety, palenia tytoniu, spożywania alkoholu i narkotyków, leków i metod leczenia; ocena trwałych skutków działania promieniowania (tzw. dozymetria biologiczna); badania osób chorych z zespołami niestabilności genetycznej (np. zespół Blooma).
Test mikrojądrowy w limfocytach człowieka Ograniczenia: wymagana jest zgoda Komisji Bioetycznej na badania; konieczność poboru próbki krwi od badanego; konieczność wprowadzenia i namnożenia limfocytów w kulturze in vitro; stosowanie wariantu z cytochalazyną B może wpływać na uzyskiwane wyniki. www.massey.ac.nz
Test mikrojądrowy w limfocytach człowieka Standaryzacja testu: Projekt HUMN (ang. International HUman MicroNucleus Project): powstał w 1997 r. i dotyczy koordynacji działań światowych zmierzających do zastosowania testu mikrojądrowego w badaniach populacyjnych ludzi; główne cele projektu: wyznaczenie poziomu referencyjnego częstości mikrojąder, ustalenie czynników wpływających na zmienność wyników, opracowanie wystandaryzowanego protokołu metodycznego, wykazanie powiązań między, występowaniem mikrojąder, a chorobami; koncentruje się na teście mikrojądrowym w limfocytach krwi obwodowej człowieka. www.humn.org
Test mikrojądrowy w limfocytach człowieka Protokoły metodyczne: Fenech M. The in vitro micronucleus technigue. Mutation Reserach 455: 81-95, 2000. Fenech M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols 2: 1084-1104, 2007. OECD Guideline for the Testing of Chemicals 487. In vitro mammalian cell micronucleus test, 2010. Thomas P. i wsp. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay in lymphocytes. Methods in Molecular Biology 682: 217-234, 2011. Johannes C. i wsp. Chromosomal aberration test in human lymphocytes. Methods in Molecular Biology 1044: 165-178, 2013. Bolognesi C. i wsp. Micronucleus assay in human cells: lymphocytes and buccal cells. Methods in Molecular Biology 1044: 191-207, 2013.
Test mikrojądrowy w komórkach nabłonkowych człowieka Materiał do badań - komórki nabłonkowe z jamy ustnej, jamy nosowej, dróg moczowych, pochwy, itp. Komórka urotelialna Komórki nabłonkowe z jamy ustnej Fot. E. Błaszczyk Salvadori D.M.F. i wsp. 2013.
Test mikrojądrowy w komórkach nabłonkowych człowieka Zastosowanie: ocena narażenia na czynniki związane ze stylem życia palenie tytoniu, picie alkoholu, dieta, higiena jamy ustnej, promieniowanie elektromagnetyczne; ocena narażenia na czynniki obecne w środowisku (WWA, metale, pestycydy, itd.); ocena narażenia zawodowego (WWA, benzen, arsen, pyły, anestetyki, itd.); ocena metod leczenia radioterapia, chemioterapia i diagnostyką lekarską RTG; badania osób chorych na nowotwory, z zespołami niestabilności genetycznej (zespół Blooma) i przedwczesnego starzenia (zespół Downa, choroba Alzheimera).
Test mikrojądrowy w komórkach nabłonkowych człowieka Ograniczenia: wymagana jest zgoda Komisji Bioetycznej na badania; ilość i jakość uzyskiwanego materiału; mieszanina różnego typu komórek w pobranej próbce; ograniczenia metodyczne - trwałość komórek, czas i warunki przechowywania próbki.
Test mikrojądrowy w komórkach nabłonkowych człowieka Standaryzacja testu: Projekt HUMNXL (HUman MicroNucleus project on exfoliated buccal cells): kontynuacja projektu HUMN dotycząca standaryzacji testu mikrojądrowego w komórkach nabłonkowych z jamy ustnej; główne cele projektu: wyznaczenie poziomu referencyjnego, ustalenie czynników wpływających na zmienność, opracowanie protokołu metodycznego, wykazanie powiązań między, występowaniem mikrojąder, a chorobami; wyzwania na przyszłość: określenie czynników genetycznych wpływających na zmienność występowania mikrojąder, walidacja systemów do automatycznej analizy wyników, standaryzacja metod w innych komórkach, badania prospektywne związane z chorobami.
Test mikrojądrowy w komórkach nabłonkowych człowieka Protokoły metodyczne w komórkach nabłonkowych z jamy ustnej: Thomas P. i wsp. Buccal micronucleus cytome assay. Nature Protocols 4: 825-837, 2009. Thomas P. i wsp. Buccal micronucleuscytomeassay. Methods in Molecular Biology 682: 235-248, 2011. Bolognesi C. i wsp. The HUMNXL scoring criteria for different cell types and nuclear anomalies in the buccal mictonucleus cytome assay An update and expanded photogallery. Mutation Research 753: 100-113, 2013. Bolognesi C. i wsp. Micronucleus assay in human cells: lymphocytes and buccal cells. Methods in Molecular Biology 1044: 191-207, 2013.
Test mikrojądrowy w komórkach gryzoni Materiał do badań głównie komórki szpiku kostnego i erytrocyty krwi obwodowej myszy lub szczurów. Zastosowanie: ocena toksyczności i mutagenności substancji chemicznych, związków lub ich mieszanin stosowanych w rolnictwie, przemyśle oraz farmaceutyków i dodatków do żywności; badania in vivo z zakresu metabolizmu, farmakokinetyki, toksokinetyki oraz procesów naprawy DNA; kolejny etap badań po testach in vitro. Shabbar I.M.S. i wsp. 2006.
Test mikrojądrowy w komórkach gryzoni Ograniczenia: wymagana jest zgoda Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach; pobór komórek szpiku kostnego oraz z innych narządów wymaga uśmiercenia zwierzęcia; w przypadku badań z wykorzystaniem dojrzałych erytrocytów, które utraciły jądro komórkowe, należy potwierdzić niezdolność śledziony do usuwania erytrocytów zawierających mikrojądra; brak zastosowania w stosunku do substancji, które nie docierają do szpiku kostnego (bariera krew-mózg).
Test mikrojądrowy w komórkach gryzoni Protokoły metodyczne: OECD Guideline for the Testing of Chemicals 474. Mammalian erytrocyte micronucleus test, 1997; (2013 draft). Krishna G. i wsp. In vitro rodent micronucleus assay: protocol, conduct and data interpretation. Mutation Research 455: 155-166, 2000. Kasamoto S. i wsp. In vitro micronucleus assay in mouse bone marrow and peripheral blood. Methods in Molecular Biology 1044: 179-190, 2013.
Test mikrojądrowy w komórkach ryb Materiał do badań: głównie erytrocyty krwi obwodowej, ale również komórkiskrzeli, nerek, wątroby i płetw; pozyskiwany od różnych gatunków ryb, w tym karasia, karpia, troci, pstrąga tęczowego, tilapii nilowej. Kreitsberg R. i wsp. 2012. Różne typy uszkodzeń w erytrocytach ryb
Test mikrojądrowy w komórkach ryb Zastosowanie: ocena w warunkach laboratoryjnych oraz in situ, a także badania biomonitoringowe z wykorzystaniem rodzimych gatunków ryb; badania wód zanieczyszczonych przez przemysł, sektor komunalny i rolnictwo (produkty petrochemiczne, WWA, metale ciężkie, pestycydy, toksyny, chlorowane węglowodory, pierwiastki promieniotwórcze, itd.).
Test mikrojądrowy w komórkach ryb Ograniczenia: wymagana jest zgoda Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach; uzyskanie erytrocytów lub innych komórek (skrzela, nerki, wątroba) wymaga uśmiercenia ryby; w przypadku komórek wątroby (hepatocytów) ograniczeniem jest niski indeks mitotyczny; różnice wyników związane ze zmienność międzygatunkową; wpływ temperatury, zasolenia, ph oraz dostępności pokarmu na częstość występowania mikrojąder. Protokoły metodyczne brak wystandaryzowanego protokołu metodycznego.
Test mikrojądrowy w komórkach mięczaków Materiał do badań hemolimfa i komórki skrzeli małż, główne z rodzaju Mytilus (omułki). Zastosowanie: biomonitoring środowiska wodnego; ocena wpływu zanieczyszczeń organicznych i nieorganicznych pochodzących z przemysłu, sektora komunalnego oraz rolnictwa, itd.; ocena wpływu bioakumulacji zanieczyszczeń; badania w warunkach laboratoryjnych oraz in situ; ocena skutków katastrof i uwolnienia substancji szkodliwych do środowiska wodnego.
Test mikrojądrowy w komórkach mięczaków Ograniczenia: dużą zmienność wyników badań in situ; sezonowa i geograficzna zmienność występowania mikrojąder w komórkach mięczaków (temperatura, zasolenie, ph, dostępność pokarmu); heterogenność komórek uzyskiwanych ze skrzeli; mniejsza czułość granulocytów obecnych w hemolimfie w porównaniu do agranulocytów. Protokół metodyczny: Bolognesi C. i wsp. Mussel micronucleus cytome assay. Nature Protocols 7: 1125-1137, 2012.
Test mikrojądrowy w komórkach mięczaków Pobór hemolimfy Bolognesi C. i wsp. 2012. Różne typy komórek uzyskiwane ze skrzeli
Test mikrojądrowy w komórkach roślin Materiał do badań: komórki stożka wzrostu korzeni cebuli (Allium cepa); komórki stożka wzrostu korzeni bobu (Vicia faba); komórki ziaren pyłku (tetrady) trzykrotki (Tradescantia). Fot. E. Błaszczyk Mišík M. i wsp. 2011.
Test mikrojądrowy w komórkach roślin Zastosowanie: ocena wpływu substancji i/lub związków oraz mieszanin występujących w glebie, powietrzu, wodzie (metale, pierwiastki promieniotwórcze, pestycydy, herbicydy, nanocząstki, itd.); badania próbek wód powierzchniowych i opadowych, wody do spożycia, wód rzecznych, ścieków, odcieków, osadów, śniegu i gleby oraz powietrza atmosferycznego i pyłów; możliwość stosowania różnych wariantów doświadczeń.
Test mikrojądrowy w komórkach roślin Ekspozycja w glebie Ekspozycja łodyg w roztworze Ekspozycja na gazy Ekspozycja in situ Ekspozycja na pływających tratwach Mišík M. i wsp. 2013.
Test mikrojądrowy w komórkach roślin Ograniczenia: brak dostępności dobrze kiełkujących bulw cebuli (Allium capa) przez cały rok kalendarzowy; czasochłonność analizy mikroskopowej; zmienność uzyskiwanych wyników; brak silnej korelacji pomiędzy wynikami testu mikrojądrowego uzyskanymi na roślinach i zwierzętach.
Test mikrojądrowy w komórkach roślin Protokoły metodyczne: Mišík M. i wsp. Micronucleus assay with tetrad cells of Tradescantia. Methods in Molecular Biology 1044: 405-415, 2013. ISO 29200:2013. Assessment of genotoxic effects on higher plants- Vicia faba micronucleus test. Tedesco S. i wsp. Bioindicator of genotoxicity: The Allium cepa test. Environmental Contamination 137-156, 2012. Standaryzacja testu - w ramach międzynarodowego programu International Program on Plant Bioassays przy udziale Programu Ochrony Środowiska Narodów Zjednoczonych.
Podsumowanie Stosunkowo prosta i uniwersalna metoda badawcza. Duża dostępność wystandaryzowanych protokołów metodycznych. Szerokie zastosowanie testu mikrojądrowego. Możliwość badania wszystkich elementów środowiska.
Otwarte seminaria 2014 Dziękujęza uwagę mgr Ewa Błaszczyk e-mail: blaszczyk@ietu.katowice.pl Katowice, 18 września 2014
Otwarte seminaria 2014 Instytut Ekologii Terenów Uprzemysłowionych w Katowicach Seminarium było transmitowane on-line przy wykorzystaniu systemu wideokonferencyjnego zakupionego w projekcie Rozbudowa infrastruktury informatycznej gromadzenia, przetwarzania i analizy danych środowiskowych in2in. Projekt realizowany w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka i współfinansowany przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego