gibereliny naturalna : GA 3 (kwas giberelowy) Miejsce wytwarzania: w dojrzewających nasionach, owocach, zielonych częściach rośliny, w wierzchołkach wzrostu pędu, korzeniach i pręcikach. Biosynteza w plastydach (chloroplastach). Działanie: wydłużają łodygi roślin karłowatych, indukują kwitnienie, wpływają na płeć kwiatów, pobudzają zawiązywanie owoców, przyspieszają wychodzenie nasion ze stanu spoczynku, w kulturach in vitro wywołują efekt podobny do działania auksyn: - indukcja formowania kalusa, - hamują powstawanie pędów przybyszowych i korzeni. 1
Retardanty (antygibereliny) syntetyczne : ancymidol, chlorek chloromekwatu (CCC), daminozyd (SADH), paklobutrazol Działanie hamują wzrost komórek, zwiększają zawartość białek, chlorofilu i soli mineralnych, hamują wydłużanie się międzywęźli, pobudzają tworzenie kwiatów i owoców, opóźniają starzenie roślin, podnoszą odporność na stresy, zwiększa się pobieranie substancji pokarmowych i tempo wzrostu asymilatów, blokują syntezę giberelin i etylenu, upośledzają transport auksyn, a zwiększają poziom cytokinin. 2
kwas abscysynowy (ABA) Miejsce wytwarzania: przez dojrzałe liście, nasiona, korzenie, pąki i owoce. Działanie hamuje wzrost i kiełkowanie, przyspiesza dojrzewanie, tworzenie nasion i starzenie się - inhibitor wzrostu i rozwoju, uruchamia mechanizmy obronne w warunkach stresu hormon stresu, hamuje formowanie i proliferację kalusa, inhibitor przedwczesnego kiełkowania. 3
etylen Etylen - postać gazowa Miejsce wytwarzania: we wszystkich komórkach. Działanie stymuluje kiełkowanie, stymuluje starzenie się kwiatów i liści, przyspiesza dojrzewanie i starzenie się owoców, zrzucanie liści, tworzenie korzeni przybyszowych, hamuje wydłużanie się łodyg, wzrost liści, pąków wierzchołkowych i korzeni, in vitro nie jest dodawany, gromadzi się w naczyniu, efekt podobny do działania auksyn. 4
Substancje organiczne DODATKI POCHODZENIA NATURALNEGO ekstrakty drożdżowe ekstrakty z bulw ziemniaczanych z bananowca i pomidora woda kokosowa mleczko kokosowe i kukurydziane wyciągi z siewek źródło: aminokwasów, witamin, fitohormonów 5
Substancje zestalające agar naturalny ekstrakt z krasnorostów agaroza gerlit phytagel sporadycznie skrobia, żelatyna, karraginian Dodane w odpowiednim stężeniu 0,8-1% umożliwiają dyfuzję składników odżywczych zawartych w pożywce do komórek roślinnych. Zbyt duże stężenie utrudnia dyfuzję, a zatem zmniejsza dostępność substancji odżywczych dla komórek. Zbyt małe stężenie, ułatwiające przemieszanie się substancji odżywczych w pożywce, sprzyja występowaniu zjawiska szklistości eksplantatów. Agar w pożywkach rozpuszcza się w czasie autoklawowania. 6
ph POŻYWKI Większość komórek toleruje odczyn w zakresie ph 4,0-7,2, ale znacznie lepiej znosi środowisko lekko kwaśne. Najczęściej ph wynosi 5,5-5,8 ułatwione utrzymanie fosforanów w formie rozpuszczonej. Kwasowość pożywki wzrasta po autoklawowaniu oraz w miarę upływu czasu trwania kultury, z uwagi na pobieranie jonów z pożywki przez komórki. Ustalenie odczynu pożywki na odpowiednim poziomie zapobiega zniszczeniu błon biologicznych, umożliwia zbuforowanie odczynu cytoplazmy, wpływa na różnicowanie i morfogenezę. Sterylizacja pożywek odbywa się w autoklawie lub poprzez filtrację. 7
Kultury roślinne bioreaktorowe 1. Niezróżnicowane - kultura zawiesinowa (przypomina kulturę mikroorganizmów). Kultura zawiesinowa populacja komórek roślinnych rosnących w formie wolno pływających, pojedynczych komórek i niewielkich agregatów komórkowych. 8
Większość linii komórkowych wykazuje tendencję do tworzenia agregatów. Jest to cecha uwarunkowana genetycznie i zależy od obecności polisacharydów i proteoglikanów budujących ściany komórkowe, bądź ulegających sekrecji. 9
Aby ograniczyć agregację komórek stosuje się: - szybsze mieszanie pożywki, - dodaje się enzymy pektynolityczne i celulolityczne, sorbitol, detergenty, - zmniejsza się stężenie cytokinin. Agregacja komórek zwiększa szybkość ich sedymentacji, co utrudnia utrzymanie homogennych warunków kultury w bioreaktorze. W celu poprawy sedymentacji stosuje się kultury o dużej gęstości, wykazujące zwiększoną lepkość. 10
Kultury roślinne bioreaktorowe 2. Zróżnicowane A. Kultury zarodków służą do produkcji nasion somatycznych (sztuczne nasiona). Atutem jest możliwość otrzymania dowolnej ilości zdrowego, wyrównanego materiału siewnego, niezależnie od warunków pogodowych i w dowolnym terminie. Embriogeneza somatyczna 11
Kultury roślinne bioreaktorowe 2. Zróżnicowane B. Kultury korzeniowe służą do produkcji metabolitów komórkowych. Można je otrzymać poprzez odcięcie stożków wzrostu korzeni i przeniesienie, po dezynfekcji, do specjalnych pożywek o zmniejszonej zawartości soli mineralnych (uprawa w ciemności, bez intensywnego mieszania). 12
Kultury roślinne bioreaktorowe sposoby prowadzenia kultury Kultura okresowa jednorazowe wprowadzenie pożywki do naczynia, inokulacja i prowadzenie kultury do momentu uzyskania maksymalnej gęstości komórek lub max stężenia metabolitu. Kultura okresowo-dolewowa uzupełnianie brakujących składników (dolewanie pożywki). Początek kultury odbywa się przy częściowo wypełnionym bioreaktorze, a porcja dodatkowej pożywki jest wprowadzana w czasie spowolnienia wzrostu lub zahamowania produkcji metabolitu. Kultura ciągła ciągła wymiana części zużytej pożywki wraz z komórkami na świeżą. Dla komórek roślinnych (powolny wzrost) stosuje się bioreaktory, w których komórki są zatrzymywane: - system z zawracaniem komórek w bioreaktorach membranowych, - kultury immobilizowane - unieruchomienie komórek poprzez ich związanie z powierzchnią nośnika lub uwięzienie w jego wnętrzu. 13