Dr hab. inż. Regina Borek-Wojciechowska, prof. nadzw. UTH Katedra Towaroznawstwa i Nauk o Jakości Uniwersytet Technologiczno-Humanistyczny w Radomiu Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Katarzyny Marchwińskiej p.t. Projektowanie dodatków paszowych z wykorzystaniem bakterii fermentacji mlekowej przedstawiona Radzie Wydziału Towaroznawstwa Uniwersytetu Ekonomicznego w Poznaniu Przedstawiona do recenzji praca dysertacyjna na stopień doktora nauk ekonomicznych w zakresie towaroznawstwa została wykonana pod kierunkiem dr hab. inż. Danieli Gwiazdowskiej w Katedrze Przyrodniczych Podstaw Jakości. Tematyka pracy Antybiotyki zaczęto dodawać do pasz w drugiej połowie dwudziestego wieku jako antybiotykowe promotory wzrostu. Stwierdzono bowiem, że powodowały one lepsze wykorzystanie przez zwierzęta składników paszy i w efekcie obniżenie kosztów produkcji. W 1997 roku Europejska Federacja Zdrowia Zwierząt opublikowała dane dotyczące sprzedaży antybiotyków w Unii Europejskiej i Szwajcarii. Wynikało z nich, że 5 460 000 kg antybiotyków sprzedano na potrzeby leczenia ludzi, 3 465 000 kg na potrzeby medycyny weterynaryjnej a 1 575 000 kg jako zwierzęce promotory wzrostu (K. Śliżewska i wsp. 2006). Tak duże wykorzystanie antybiotyków, także w paszach stwarzało niebezpieczeństwo występowania pozostałości antybiotyków w mięsie a także budziło potwierdzone badaniami naukowymi, obawy dotyczące wzrostu antybiotykoodporności bakterii bytujących w organizmie człowieka. W efekcie w Rozporządzeniu Parlamentu i Rady (WE) nr 1831/2003 z dnia 22 sierpnia 2003 roku zawarto zapis, z którego wynika, że stosowanie, jako stymulatorów wzrostu, środków 1
antybakteryjnych należących do kategorii, które są lub mogą być wykorzystywane w medycynie lub weterynarii (to znaczy w przypadku istnienia ryzyka selekcji oporności krzyżowej na środki stosowane w leczeniu infekcji bakteryjnych), powinno być jak najszybciej wycofane i ostatecznie zakazane. Od 1 stycznia 2006 roku zaczął obowiązywać we wszystkich krajach Unii Europejskiej zakaz stosowania w tuczu zwierząt rzeźnych antybiotyków, w tym antybiotykowych stymulatorów wzrostu. Decyzja ta spowodowała jednak także negatywne konsekwencje, zaobserwowano bowiem po wprowadzeniu zakazu stosowania antybiotyków wzrost śmiertelności prosiąt po odsadzeniu, wydłużył się również czas odchowu prosiąt przy lochach a jednocześnie ze względu na wzrost zachorowań na biegunki, wzrosło zużycie antybiotyków w celach terapeutycznych. W związku z tym zintensyfikowano poszukiwania dodatków do pasz, które pozwoliłyby uzyskać efekty porównywalne z efektami uzyskiwanymi w wyniku zastosowania antybiotyków. Uwagę skierowano między innymi na mikroflorę jelit. Wśród dodatków paszowych, które wymienione zostały w Rozporządzeniu nr 1831/2003 znalazły się dodatki zootechniczne a więc... wszystkie dodatki stosowane, aby wpłynąć korzystnie na cechy użytkowe ze względu na dobry stan zdrowia zwierząt lub korzystnie wpłynąć na środowisko. Do tej kategorii zaliczono także probiotyki. Wyniki badań wskazują na wielokierunkowy chociaż dotychczas nie w pełni poznany, mechanizm działania probiotyków w przewodzie pokarmowym. Probiotyki oddziałują korzystnie na układ immunologiczny, poprawiają trawienie i wchłanianie składników pokarmowych. Cechy te sprawiły, że wykorzystuje się je w preparatach stosowanych w żywieniu zwierząt jako alternatywę antybiotykowych stymulatorów wzrostu. Co więcej zaleca się stosowanie probiotyków już od pierwszych chwil życia zwierząt. Celem badań przeprowadzonych przez Panią mgr inż. Katarzynę Marchwińską było opracowanie i przetestowanie w warunkach laboratoryjnych dodatku paszowego, który można będzie zastosować w żywieniu trzody chlewnej i drobiu jako alternatywę dla antybiotyków. Autorka rozprawy nie komponuje preparatu ze szczepów bakterii oferowanych przez firmy biotechnologiczne. ale przygotowuje dodatek wykorzystując wyizolowane przez siebie z mikrobiomu jelit świń i drobiu rzeźnego bakterie fermentacji mlekowej spełniające ściśle określone wymagania.. Wyniki realizowanego w USA od 2009 roku potężnego projektu badawczego Human Microbiome Project wskazują na osobnicze właściwości mikrobiomu. Z czego wynika, że najbardziej pożądane byłoby aby bakterie wykorzystywane do produkcji preparatów probiotycznych pochodziły od przedstawicieli gatunku dla którego preparat jest przygotowywany. Wskazania te dotyczą także preparatów dla zwierząt. Autorka pracy uwzględnia to podejście - poddaje szczegółowym testom technologicznym i przechowalni- 2
czym bakterie wyizolowane z kału i śluzówki jelit trzody chlewnej i kurzych brojlerów dzięki czemu uzyskuje preparat dostosowany do warunków panujących w przewodzie pokarmowym świń oraz drobiu, co więcej podejmuje próbę wykorzystania bakterii fermentacji mlekowej jako potencjalnych bakterii probiotycznych mimo, że jak napisała w pracy aktualnie, nieliczne bakterie fermentacji mlekowej zaliczane są do grupy mikroorganizmów probiotycznych. W związku z powyższym uważam, że tematyka recenzowanej przeze mnie rozprawy doktorskiej przygotowanej przez Panią Katarzynę Marchwińską jest jak najbardziej aktualna i wpisuje się w obecnie obserwowane tendencje dotyczące kształtowania jakości pasz dla zwierząt hodowlanych a w konsekwencji również mięsa pozyskanego ze zwierząt hodowlanych. Ocena strony redakcyjnej i merytorycznej pracy Przedstawiona do recenzji praca obejmuje 180 stron maszynopisu, zawiera: 22 tabele, 7 rysunków, 27 fotografii, 19 wykresów. Spis literatury obejmuje 318 właściwie dobranych, związanych z tematyką pracy, cytowanych w tekście, głównie anglojęzycznych pozycji literaturowych. Do pracy dołączony jest 63-stronicowy elektroniczny Załącznik zawierający odpowiednio zaprezentowane wyniki badań. Temat pracy został sformułowany prawidłowo a plan pracy koresponduje z tematem i przyjętym celem. Podsumowanie wyników odnosi się do weryfikacji hipotez badawczych a wnioski przedstawione w sposób syntetyczny stanowią cenne uzupełnienie Posumowania. Konstrukcja pracy nie budzi zastrzeżeń chociaż, moim zdaniem, odbiór pracy poprawiłoby konkretniejsze wyodrębnienie rozdziałów. Pod względem językowym i graficznym praca przygotowana jest bardzo starannie. Odnoszę wrażenie, że Doktorantka jest pasjonatką problematyki poruszanej w pracy co sprawiło, ze czytałam pracę z zainteresowaniem ale również z przyjemnością. Wartości pracy nie umniejszają drobne literówki, w wykazie skrótów brakuje rozwinięcia skrótu FCR. Praca składa się z części literaturowej (rozdziały 1-6) i części doświadczalnej (rozdziały 7-10). Stanowiąca ¼ część pracy część literaturowa, przygotowana na bardzo dobrym poziomie naukowym, prezentuje zagadnienia dotyczące bezpieczeństwa zdrowotnego żywności i pasz, naświetla problem probiotyków traktując je jako alternatywę dla antybiotyków, przedstawia bakterie fermentacji mlekowej w kontekście możliwości ich wykorzystania jako probiotyków, zawiera rozdział dotyczący zastosowania probiotyków w żywieniu zwierząt z odniesieniem do zastosowania probiotyków w hodowli drobiu i trzody chlewnej, ujmuje rów- 3
nież regulacje prawne dotyczące prezentowanej w pracy problematyki.. Cennym uzupełnieniem części literaturowej w perspektywie praktycznego zastosowania otrzymanych przez Autorkę dodatków paszowych jest analiza stanu obecnego i perspektywy rozwoju rynku dodatków probiotycznych. Korespondujące z danymi literaturowymi założenia badawcze zawarto w ostatnim rozdziale części teoretycznej. Cel pracy którym było opracowanie i kompozycja nowych preparatów zawierających w swoim składzie odpowiednio wyselekcjonowane szczepy bakterii fermentacji mlekowej, o wielokierunkowym działaniu ze szczególnym uwzględnieniem antagonizmu wobec bakterii chorobotwórczych jest logiczną konsekwencją przeprowadzonych przez Autorkę studiów literaturowych. Cel główny został uzupełniony czterema prawidłowo sformułowanymi, korespondującymi z celem głównym celami szczegółowymi. Teza pracy koresponduje z tematem pracy, celem głównym i trzema hipotezami pracy. Bardzo dobrym uzupełnieniem tekstu dotyczącego zakresu pracy są schematy na których przedstawiono elementy poszczególnych (w sumie 4) etapów badań. Część doświadczalną otwiera rozdział zatytułowany Materiały, w którym przedstawiono materiał badawczy, przedmiot badań, mikroorganizmy wskaźnikowe, gotowe podłoża suche jak również w oparciu o dane literaturowe samodzielnie przygotowane przez Doktorantkę pożywki, metodykę badawczą uwzględniającą wytyczne FAO/WHO. Metody badań zostały właściwie opisane i dobrane pod kątem realizacji celów badawczych. Zastosowana metodyka jest nowoczesna i w pełni adekwatna do założonego celu badań. Część doświadczalna pracy, w której Autorka prezentuje, analizuje, dyskutuje wyniki badań (R.9.) została podporządkowana czterem etapom badawczym. W pierwszym Doktorantka dokonała izolacji bakterii z materiału uzyskanego od zwierząt wchodzących w skład próby badawczej (łącznie 700 izolatów) dzięki czemu uzyskała izolaty..od przedstawicieli gatunku u którego miałyby być one zastosowane w formie dodatków paszowych (s.73). W drugim etapie badań przeprowadziła selekcję izolatów pod kątem aktywności antybakteryjnej (ocenę taką przeprowadzoniła po izolacji bakterii ale również po półtorarocznym przechowywaniu w warunkach głębokiego zamrożenia), wrażliwości na określone antybiotyki, hydrofobowości, profilu kwasów organicznych wytwarzanych przez badane kultury, pod kątem właściwości amylolitycznych, proteolitycznych, lipolitycznych istotnych z punktu widzenia przydatności w trawieniu składników paszy a także pod kątem odporności na niskie ph soku żołądkowego i soli żółciowych. Uwzględniła więc, a nawet znacznie poszerzyła zakres wymagań stawianych bakteriom probiotycznym. Wybrane w wyniku selekcji 30 izolaty bakterii poddała w kolejnym trzecim etapie identyfikacji na podstawie sekwencjonowania genu kodu- 4
jącego 16sRNA, co pozwoliło wyodrębnić po 5 izolatów pochodzących z mikrobiomu jelit prosiąt i kurcząt. W oparciu o te dziesięć izolatów, podczas realizacji czwartego etapu pracy, Pani Katarzyna Marchwińska opracowała skład dwóch preparatów spełniających wymagania odnośnie liofilizacji i przechowywania w warunkach chłodniczych i w postaci zamrożonej, przetestowanych w symulowanych układach pokarmowych trzody chlewnej i drobiu, przeznaczone docelowo dla prosiąt i kurzych brojlerów. Szczegółową charakterystykę szczepów bakterii fermentacji mlekowej wykorzystanych do kompozycji dodatków paszowych zawarła w rozdziale 10. pracy. Również tą cześć pracy oceniam bardzo wysoko. Szczegółowa, perfekcyjna analiza wyników badań, wzbogacona o wyjaśnienia oparte na własnych przemyśleniach oraz literaturze, dotyczące tendencji oraz mechanizmów obserwowanych zjawisk, jak również przeprowadzona nad nimi dyskusja świadczą ponownie o doskonałej znajomości przez Doktorantkę przedmiotu badań. Niemniej jednak sugeruję pewne kwestie dotyczące części badawczej, w niczym nie umniejszając wartości pracy, które moim zdaniem wymagają uściślenia i uwzględnienia w przyszłości. - Materiał badawczy stanowiły: próbki treści jelit 10 prosiąt ssących..., próbki treści jelit 10 prosiąt odsadzonych..., próbki jelit 10 brojlerów-kurcząt rzeźnyh w wieku 12 tygodni (s.43). Czym kierowała się Pani ustalając wiek kurcząt wchodzących w skład próby badawczej? Chów brojlerów kurzych trwa do 5-7 tygodni ich życia a najintensywniejszym tempem wzrostu odznaczają się brojlery między 1. a 4. tygodniem życia. Skład mikroflory zmienia się wraz z wiekiem ptaków. - izolację bakterii fermentacji mlekowej przeprowadzano z kału prosiąt i jelit kurcząt (s.58). Dlaczego w przypadku prosiąt jest to kał a w przypadku kurcząt jelita, jeśli mikroflora przewodu pokarmowego jest zmienna tak w warstwie śluzu jelitowego jak również w treści jelita? - w badaniach nie ujmowano doświadczeń związanych z symulacją jelita grubego (s.70). Dlaczego? Z danych literaturowych wynika, że liczba bakterii zwiększa się stopniowo w kolejnym odcinku jelita i np. w dwunastnicy szacowana jest na 10 3 /g a w okrężnicy osiąga liczbę 10 12 /g. - jest to cecha kodowana chromosomalnie i nie ulegająca transformacji (s.94). Proszę o wyjaśnienie. - w przypadku kurcząt zaleca się podawanie bakterii kwasu mlekowego już w pierwszym dniu po wykluciu a nawet poprzez wstrzyknięcie ich wprost do komory powietrznej w 12-tym dniu inkubacji, w przypadku prosiąt często zaleca się dwukrotne podawanie probiotyku za pomocą dozowników indywidualnie: tuż po urodzeniu i przy odsadzaniu. Czy Pani zdaniem będzie 5
możliwe również takie aplikowanie otrzymanych przez Panią izolatów, co znacznie rozszerzyłoby możliwość ich zastosowania w hodowli wymienionych przez Panią zwierząt monogastrycznych? Wyniki badań przyniosły szereg interesujących obserwacji. - Izolaty bakterii wykazywały (52%) zależną od pochodzenia izolatów aktywność antybakteryjną-najsilniejsze oddziaływanie antybakteryjne wykazywały izolaty pochodzące z kału prosiąt ssących Po 18. miesiącach przechowywania większość izolatów zachowała swoją aktywność. - Również od pochodzenia izolatu zależała odporność bakterii fermentacji mlekowej na testowane antybiotyki, wszystkie badane izolaty wykazywały odporność na wankomycynę, antybiotyk stosowany m.in. w leczeniu trzody chlewnej. - Wszystkie badane izolaty wykazywały właściwości proteolityczne-powodowały rozkład kazeiny, niecałe 52% wykazywało właściowsci amylolityczne-rozkadały skrobię, żaden nie wykazywał właściwości lipolitycznych. - Analiza właściwości oraz identyfikacja genetyczna poszczególnych izolatów bakterii fermentacji mlekowej pozwoliła skomponować preparaty paszowe, w których wykorzystano wyselekcjonowane szczepy o cechach uzupełniających się wzajemnie. - Liczebność populacji bakterii utrzymywała się na wysokim poziomie w gotowych preparatach podczas procesu liofilizacji i przechowywania (temp. 4C i -20C) przez 30 dni. -Bakterie w zaprojektowanych preparatach wykazywały wysoką odporność na warunki w symulowanych przewodach świń i drobiu. Wniosek końcowy Praca doktorska Pani mgr inż. Katarzyny Marchwińskiej w pełni spełnia wszystkie wymagania stawiane rozprawom na stopień naukowy doktora i stanowi wartościowy, oryginalny dorobek naukowy. Rozprawa jest uwieńczeniem zrealizowanego przez Doktorantkę bardzo ambitnego programu badań dotyczących wykorzystania bakterii fermentacji mlekowej w celu zaprojektowania dodatków paszowych przeznaczonych dla trzody chlewnej i drobiu. Sposób przedstawienia wyników badań, ich analiza jak również dyskusja świadczą o doskonałej znajomości zagadnień stanowiących przedmiot badań jak również o dojrzałości naukowej Doktorantki i pozytywnie wyróżniają recenzowaną pracę. Na uwagę zasługuje wysoki poziom warsztatu naukowego jak również perfekcja edytorskiego przygotowania rozprawy. 6