Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych

Aleksandra Kruk 1, Agnieszka Gadomska-Gajadhur 2, Paweł Ruśkowski 3 Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych 1. Wstęp W ostatniej dekadzie nastąpił szybki rozwój inżynierii tkankowej, interdyscyplinarnej dziedziny, łączącej nowoczesne technologie biomateriałów oraz nauki biologiczne. Głównym celem inżynierii tkankowej jest poszukiwanie metod pozwalających na szybką, wydajną i skuteczną regenerację uszkodzonych trudnoodnawiających się tkanek. Obiecującym zagadnieniem w tej kwestii są rusztowania komórkowe (ang. Scaffolds). Są to przestrzenne struktury służące do prowadzenia hodowli tkankowych. Najczęściej mają formę membran półprzepuszczalnych, która zapewnia dostarczanie komórkom składników odżywczych oraz wyprowadzanie metabolitów na zewnątrz rusztowania. Składniki odżywcze i czynniki wzrostu są niezbędne komórkom do proliferacji, natomiast nagromadzenie metabolitów może wywołać efekt toksyczny i w konsekwencji doprowadzić do śmierci komórki [1 6]. Do wytwarzania membran, które mają być stosowane w inżynierii tkankowej stosuje się głównie polimery, zarówno naturalne jak i syntetyczne. Naturalnymi polimerami używanymi w inżynierii tkankowej są przede wszystkim polisacharydy oraz białka. Są nie tylko materiałem budującym rusztowanie, ale też składnikami odżywczymi dla komórek. Mimo, że wykazują wiele zalet nie są najlepszymi materiałami do otrzymywania rusztowań. Zwykle są niestabilne w różnych warunkach temperatury i odczynu środowiska, co znacznie utrudnia znalezienie odpowiedniej metody wytwarzania rusztowań i jest poważnym ograniczeniem technologicznym. Dodatkowo, rusztowania wykonane z polimerów naturalnych mają zwykle słabszą wytrzymałość mechaniczną 1 akruk@ch.pw.edu.pl, Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny, Politechnika Warszawska 2 agadomska@ch.pw.edu.pl, Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny, Politechnika Warszawska 3 pawel.ruskowski@ch.pw.edu.pl, Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny, Politechnika Warszawska 106

Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych niż wykonane z syntetycznych. Dlatego często stosuje się materiały będące mieszaninami polimerów naturalnych i syntetycznych [7 9]. Polimery syntetyczne w porównaniu do naturalnych, charakteryzują się lepszą wytrzymałością mechaniczną oraz trwałością w różnych warunkach. W ostatnich latach szczególnym zainteresowaniem cieszą się polimery biodegradowalne takie jak polilaktyd (PLA), poli-ε-kaprolakton (PCL), poliglikolid (PGA) oraz ich kopolimery. Charakteryzują się biozgodnością oraz biodegradowalnością. Są one dobrze tolerowane przez organizm. Ważną zaletą jest to, ze związki te oraz produkty ich rozpadu nie są toksyczne wobec komórek organizmu. Ponadto, ulegają w organizmach hydrolitycznemu rozkładowi, najpierw do kwasu mlekowego bądź jego oligomerów, a następnie do ditlenku węgla i wody, które jako produkty fizjologicznej przemiany materii, są z łatwością wydalane z ustroju [9]. Wśród poliestrów biodegradowalnych, na szczególną uwagę zasługuje polilaktyd podwójnie zielony alifatyczny poliester. Określenie to wynika z dwóch przyczyn. Po pierwsze surowce produkcji PLA mogą być pozyskiwane ze źródeł odnawialnych (np. kukurydza, trzcina cukrowa). Natomiast drugą przyczyną jest fakt, że polimer ten ulega biodegradacji. PLA zbudowany jest z liniowo połączonych ze sobą cząsteczek kwasu mlekowego (Rysunek 1), który może występować w formie dwóch enancjomerów. Z tej przyczyny, mogą powstawać polimery różniące się ułożeniem centrów chiralnych o różnej konfiguracji w łańcuchu, a co za tym idzie właściwościami fizycznymi. PLA zbudowany jedynie z cząsteczek kwasu L- lub D-mlekowego (PLLA, PDLA) charakteryzuje się wysoką wytrzymałością mechaniczną oraz długim czasem biodegradacji. Natomiast polilaktyd zawierający w strukturze oba enancjomery kwasu mlekowego, jest bardziej elastyczny oraz ulega szybszej degradacji [10 13]. H 3 C H H CH 3 HO OH HO OH O kwas D-mlekowy O kwas L-mlekowy Rysunek 10. Enancjomery kwasu mlekowego 107

Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski Jak już wspomniano, poliestry są łatwe w przetwórstwie, dzięki czemu są często i chętnie stosowane w medycynie, farmacji oraz innych gałęziach przemysłu. Jednak w przypadku otrzymywania poliestrowych rusztowań komórkowych pojawiają się pewne problemy. Membrany poliestrowe charakteryzują się małymi (rzędu 10 µm), praktycznie nie połączonymi ze sobą porami występującymi we wnętrzu rusztowania. Dodatkową wadą jest to, że powierzchnie zewnętrzne tych membran charakteryzują obecnością nielicznych, małych porów (kilka µm). Taka budowa rusztowań praktycznie eliminuje możliwość wniknięcia komórek do środka membrany oraz stwarza poważne trudności w migracji składników odżywczych i metabolitów. Mimo wszystko, poliestry wykazują wiele korzystnych cech tj. biodegradowalność, bioresorbowalność, czy dobra wytrzymałość mechaniczna. Z tej przyczyny poszukuje się metod oraz ich modyfikacji, pozwalających otrzymać membrany o morfologii umożliwiającej prowadzenie hodowli komórkowych [9, 14]. Istnieje wiele technik otrzymywania membran polimerowych. Jedną z nich jest metoda mokrej inwersji faz. Charakteryzuje się ona prostotą wykonania oraz brakiem konieczności stosowania skomplikowanej aparatury. W pierwszej kolejności sporządza się roztwór polimeru w rozpuszczalniku organicznym, a następnie wylewa się go na obojętny podkład (np. płytkę szklaną). Uformowaną membranę zanurza się w kąpieli żelującej, składającej się substancji, w której nie rozpuszcza się polimer (nie rozpuszczalnika). Konieczne jest aby rozpuszczalnik i nieroz-puszczalnik mieszały się ze sobą. Po skoagulowaniu polimeru, membranę wyjmuje się z kąpieli żelującej i suszy się. Metodę tą można zmodyfikować poprzez zastosowanie dodatku prekursora porów. W tym celu stosuje się głównie inne polimery (np. poliwinylopirolidon, poli(glikol etylenowy) lub sole nieorganiczne o odpowiedniej średnicy kryształów. Prekursor porów dodaje się do roztworu membranotwórczego, a następnie usuwa się ze struktury skoagulowanej membrany poprzez wypłukanie. Usunięcie prekursora porów, zachodzi jeszcze w kąpieli żelującej lub dodatkowej kąpiel płuczącej, w zależności od rozpuszczalności stosowanego prekursora [15 17]. Znane metody otrzymywania membran poliestrowych nie zawsze dają ściśle pożądane efekty, dlatego też poszukuje się technik pozwalających na modyfikacje gotowych już produktów. Do podstawowych modyfikacji membran zalicza się przede wszystkim: trawienie plazmowe lub promieniami UV oraz trawienie roztworami elektrolitów lub słabych rozpuszczalników organicznych. Metody te, przynoszą odmienne efekty, które w dużej mierze zależną od materiału membranotwórczego. Trawienie plazmowe oraz promieniami UV nadtapia powierzchnie membran, prowadząc częściowo do jej wygładzenia oraz do powiększenia porów już istniejących. Natomiast trawienie roztworami elektrolitów oraz słabych 108

Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych rozpuszczalników rozpuszcza warstwę naskórkową prowadząc do odsłonięcia porów powierzchniowych [15, 18]. 2. Cel pracy Celem pracy było opracowanie metody otrzymywania polilaktydowych membran półprzepuszczalnych. Kolejnym krokiem była modyfikacja powierzchni otrzymanych membran przy użyciu roztworów kwasów, zasad lub soli. Celem tej modyfikacji było usunięcie warstwy naskórkowej, przykrywającej pory występujące na powierzchniach membran. Odsłonięcie porów przyczynia się do wzrostu porowatości, a tym samym zapewnia lepszy dostęp dla komórek oraz niezbędnych dla nich składników odżywczych do wnętrza membrany [14, 17]. 3. Materiały i metody Do otrzymywania membran użyto poli-l-laktyd (PLLA) o M n 86 000 g/mol Nature Works NW 2003D oraz poliwinylopirolidon (PVP) o M n 10 000 g/mol Sigma Aldrich. Użytymi rozpuszczalnikami były: chloroform, etanol i metanol cz. d. a. produkcji POCh SA. Stosowane kwasy: H 2 SO 4, HCl, CH 3 COOH, sole: NaHCO 3, Na 2 CO 3, zasady: NH 4 OH oraz bufor fosforanowy ph 7,2 były produkcji POCh SA. Ultraczystą wodę (Mili-Q)o oporności 18,2 MΏ cm otrzymano za pomocą urządzenia Millipore. 3.1. Otrzymanie roztworów Roztwory PLLA w chloroformie o stężeniu 6% wag otrzymano poprzez rozpuszczanie polimeru przez 24 h w rozpuszczalniku organicznym, zapewniając ciągłe mieszanie przy użyciu mieszadła magnetycznego bez grzania. Po całkowitym rozpuszczeniu PLLA dodano PVP w stosunku wagowym 1:1 do poli-l-laktydu. Następnie mieszanie kontynuowano przez kolejne 24 h. 3.2. Otrzymanie membran polilaktydowych Membrany otrzymano metodą inwersji faz. Sporządzone roztwory wylano na szklany podkład, a następnie rozprowadzono po jego całej powierzchni. Po uformowaniu roztworu membranę żelowano w metanolu przez 24 h. Prekursor porów (poliwinylopirolidon) usunięto jednocześnie w kąpieli żelującej, gdyż polimer ten rozpuszcza się w metanolu. Po wyżelowaniu polimeru membranotwórczego i usunięciu substancji porotwórczych membrany wysuszono na powietrzu. 109

Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski Otrzymano prostokątne membrany o wymiarach 20x10 cm oraz grubości 0,4 mm. Porowatość całkowita wynosiła 64%. 3.3. Trawienie membran w roztworach kwasów, zasad lub soli Sporządzono 0,05 M wodne roztwory kwasów, zasad lub soli o określonym ph (Tabela 2). Użytymi substancjami były: H 2 SO 4, HCl, CH 3 COOH, NaOH, NH 4 OH, Na 2 CO 3, NaHCO 3 oraz bufor fosforanowy. W przygotowanych roztworach umieszczano membrany na 15 lub 30 minut. Po odpowiednim czasie membrany wyjęto z roztworów, a następnie wypłukano w wodzie destylowanej i wysuszono na powietrzu. 3.4. Trawienie membran poprzez dodatek roztworów soli do kąpieli żelującej Po wylaniu roztworów PLLA w chloroformie, uformowane membrany poddano żelowaniu w kąpieli żelującej o określonym składzie. Jedna ze stosowanych kąpieli składała się z metanolu wraz z dodatkiem wodnego 0,1 M roztworu NaHCO 3 w stosunku objętościowym 9:1. Druga zaś z metanolu z dodatkiem wodnego 0,1 M roztworu NaHCO 3 oraz 0,1 M wodnego roztworu Na 2 CO 3 w stosunku objętościowym 85:10:5. Żelowanie prowadzono przez 1 h. Następnie membrany wypłukano w wodzie oraz przełożono do kąpieli żelującej składającej się jedynie z metanolu. Kąpiel kontynuowano przez 24 h. 3.5. Metody analityczne Morfologię otrzymanych membran oraz postęp stosowanych modyfikacji badano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (ang. Scanning Electron Microscopy, SEM) Hitachi TM1000. Próbki membran przed badaniem zanurzono w etanolu, a następnie umieszczono w kąpieli składającej się z ciekłego azotu, gdzie połamano je na kawałki o wymiarach 1x0,5 mm. Po wysuszeniu próbki pokryto warstwą złota 7-10 nm przy użyciu aparatu K550X Sputter Coater. Pokryte złotem próbki badano w powiększeniu 300x pod napięciem przyspieszania 15 kv. Badano powierzchnię I (dolną, znajdującą się w momencie powstawania membrany od strony szklanego podkładu), przełom (wnętrze membrany) oraz powierzchnię II (górną). Dla każdej z powierzchni oraz dla przełomu obszar skanowania wynosił około 10 mm 2. Porowatość wyjściowych membran (otrzymanych bez użycia kąpieli trawiących) zbadano przy użyciu porozymetru rtęciowego Thermo Scientific Pascal Mercury Porosimeters, stosując ciśnienie wtłaczania 60 MPa. Zdecydowano do badania wziąć jedynie membrany wyjściowe gdyż, metoda ta, w przeciwieństwie do skaningowej mikroskopii elektronowej 110

Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych nie pozwala określić jak trawienie wpłynęło na zmianę morofologii jedynie samej powierzchni, co było celem badań. 4. Wyniki Membrany polilaktydowe otrzymywane metodą inwersji faz, charakteryzują się dużym stopniem porowatości występującym we wnętrzu. Problemem jest jednak to, że liczba porów występująca na powierzchniach membran jest zbyt mała, aby zapewnić dobry dostęp komórkom oraz składnikom odżywczym. W większości, powierzchniowe pory są przykryte cienką warstwą naskórkową (Rysunek 2), która utrudnia w znaczny sposób komunikację między środowiskiem zewnętrznym, a wnętrzem wokół membrany. Dodatek substancji porotwórczych tj. poliwinylopirolidon, zwiększa rozmiar porów występujących przełomie membrany, natomiast w niewielkim stopniu wpływa na wielkość porów znajdujących się na obydwu powierzchniach. Membrany otrzymane tą metodą oprócz powyższych cech, wynikających z obserwacji wynikających z obrazów SEM, charakteryzują się porowatością całkowitą wynoszącą ~64%. Największą liczbę porów obserwuje się dla zakresu średnic 0,8-0,4 µm (około 50%), pory o największych średnicach stanowią niewielką część (poniżej 1%) (Wykres 1, Tabela 1). Wynik taki może być spowodowany, tym że znaczna część porów powierzchniowych jest przykryta litą warstwą naskórkową, co obniża porowatość całej próbki. Z tej przyczyny, w niniejszych badaniach zaczęto poszukiwać metod pozwalających na odsłonięcie porów występujących na powierzchniach membran. 111

Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski Wykres 1. Rozkład wielkości porów Tabela 1. Rozkład wielkości porów Zakres średnic porów, µm Objętość względna porów, % porowatość, % 150,00-71,31 0,62 0,39 71,31-33,90 0,92 0,58 33,90-16,12 0,40 0,25 16,12-7,66 0,47 0,30 7,66-3,64 0,07 0,04 3,64-1,73 5,63 3,59 1,73-0,82 21,29 13,57 0,82-0,39 50,52 32,20 0,39-0,19 13,83 8,82 0,19-0,09 4,51 2,88 0,09-0,04 1,49 0,95 0,04-0,02 0,27 0,18 112

Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych porowatość całkowita = porowato ść obj ętość wzgl ędna 100% 64,00 % (1) Powierzchnia I Przełom Powierzchnia II Rysunek 11. Obrazy SEM membran otrzymanych przy użyciu PVP jako prekursora porów Zaznaczona podziałka odpowiada 300 µm dotyczy wszystkich rysunków W pierwszej kolejności posłużono się 0,05 M roztworami kwasów, które w zależności od wartości ph (Tabela 2) miały stopniowo rozpuszczać powierzchnie membran, prowadząc do odsłonięcia porów. Doświadczenie przeprowadzono dla HCl, H 2 SO 4 oraz CH 3 COOH. Membrany umieszczono w roztworach kwasów na 15 lub 30 minut. Dla żadnego ze stosowanych roztworów nie zaobserwowano zmian w strukturze membrany. Powierzchnie membran oraz pory w przełomie pozostały nienaruszone. Ze względu na to, że wyniki dla każdego z kwasów, niezależnie od czasu kąpieli trawiącej były analogiczne, przedstawiono obrazy SEM tylko dla jednego z nich (Rysunek 3). Tabela 2. Stosowane roztwory trawiące, stężenie oraz odpowiadające im ph substancja stężenie ph H 2 SO 4 0,05 M 1,5 HCl 0,05 M 1,8 CH 3 COOH 0,05 M 2,9 Bufor fosforanowy - 7,2 NaHCO 3 0,05 M 8,4 NaHCO 3 0,1 M 8,7 NH 4 OH 0,05 M 10,5 NaCO 3 0,05 M 11,4 113

Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski Na 2 CO 3 0,1 M 11,6 NaOH 0,05 M 13,1 NaOH 0,5 M 13,6 Powierzchnia I Przełom Powierzchnia II Rysunek 12. Obrazy SEM membran poddanych działaniu roztworu HCl przez 30 minut Środowisko kwaśne nie zmieniało struktury membran, dlatego postanowiono zbadać wpływ odczynu obojętnego. W tym celu posłużono się roztworem buforu fosforanowego o ph 7,2. Sytuacja była podobna jak w przypadku roztworów kwasów nie zaobserwowano zmian w strukturze membran (Rysunek 4). Wyniki przy różnych czasach kąpieli były analogiczne. Z tej przyczyny przedstawiono obrazy SEM tylko dla jednego z nich. 114

Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych Powierzchnia I Przełom Powierzchnia II Rysunek 13. Obrazy SEM membran poddanych działaniu roztworu buforu fosforanowego przez 30 minut W kolejnym kroku zbadano wpływ środowiska zasadowego o różnym ph, używając roztworów: NaHCO 3, NH 4 OH, Na 2 CO 3, NaOH (Tabela 2). W przypadku roztworów NaHCO 3, NH 4 OH, Na 2 CO 3 dla różnych czasów kąpieli nie zaobserwowano większych zmian w strukturze membrany. Na Rysunku 5 przedstawiono obrazy SEM dla jednego z badanych roztworów. Istotne różnice zaczęły pojawiać się przypadku najbardziej zasadowego roztworu NaOH o ph 13,1 (Rysunek 6). Zaobserwowano, że po upływie 15 minut zaczęły pojawiać się niewielkie spękania na powierzchni II. Przełom oraz powierzchnia I pozostały nienaruszone. W przypadku 30- minutowej kąpieli, powierzchnia II w znacznym stopniu uległa spękaniu. Podobne zmiany, ale w mniejszym stopniu zaczęły się pojawiać również na powierzchni I. W przełomie membrany, zaobserwowano zerwanie ścianek wewnętrznych niektórych porów, zwłaszcza tych występujących przy powierzchniach. Obserwując istotny wpływ silnie zasadowego roztworu NaOH na strukturę membran, postanowiono badania te rozszerzyć. 115

Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski Powierzchnia I Przełom Powierzchnia II Rysunek 14. Obrazy SEM membran poddanych działaniu roztworu NaHCO 3 przez 30 minut Powierzchnia I Przełom Powierzchnia II A B Rysunek 15. Obrazy SEM membran poddanych działaniu roztworu NaOH przez 15 (A) lub 30 minut (B) 116

Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych W kolejnym etapie badań membrany trawiono roztworem 0,05M NaOH, ale w przepływie trwającym przez 5 minut (Rysunek 7). W tym przypadku praktycznie nie zaobserwowano zmian w morfologii obu powierzchni. Zupełnie inna sytuacja miała miejsce w przełomie, gdzie nastąpiło zaburzenie struktury porów, poprzez zniszczenie ich ścianek wewnętrznych. Ze względu na to, że metoda trawienia w przepływie zmieniała jedynie wnętrze, a nie powierzchnie membran (co było celem prowadzonych badań), zdecydowano z tej techniki zrezygnować. Powierzchnia I Przełom Powierzchnia II Rysunek 16. Obrazy SEM membran poddanych działaniu 0,05M roztworu NaOH przez 5 minut w przepływie Silnie zasadowy roztwór NaOH zmieniał powierzchnie membran dlatego postanowiono zbadać wpływ bardziej zasadowego środowiska (ph 13,6) (Rysunek 8). Zaobserwowano silne spękania powierzchni I oraz usunięcie warstwy naskórkowej z powierzchni II. W przełomie znaczna część ścianek wewnętrznych porów uległa zerwaniu. Spowodowało to powstanie wzajemnych połączeń między porami. Efekt ten jest korzystny z punktu widzenia zastosowania membran jako rusztowań komórkowych. Jednak, w wyniku działania silnej zasady właściwości użytkowe membrany znaczenie się pogorszyły stała się ona krucha i łamliwa. 117

Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski Powierzchnia I Przełom Powierzchnia II Rysunek 17. Obrazy SEM membran poddanych działaniu roztworu 0,05M NaOH przez 15 minut Obserwując wpływ środowiska zasadowego na strukturę membran postanowiono dodać lekko zasadowy roztwór NaHCO 3 do kąpieli żelującej, tak aby trawienie powierzchni nastąpiło powoli, w momencie formowania się membrany. Założono wówczas, że dodatek ten usunie warstwę naskórkową przykrywającą pory w trakcie jej powstawania. Po przeprowadzeniu doświadczenia, zaobserwowano silne pofałdowanie powierzchni II, przy jednoczesnym braku zmian w stopniu porowatości. Postanowiono dodać do kąpieli żelującej oprócz roztworu NaHCO 3 także bardziej zasadowy roztwór Na 2 CO 3. Podobnie jak w poprzednim przypadku zauważono pofałdowanie powierzchni II, a także niewielki wzrost jej porowatości. Pozostała struktura membrany pozostała bez zmian w stosunku do sytuacji wyjściowej. Ze względu na niewielki wpływ dodatku zasadowych roztworów do kąpieli żelującej na zwiększenie porowatości, przy jednoczesnym fałdowaniu powierzchni (co jest bardzo niekorzystne), postanowiono odrzucić metodę. 118

Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych Powierzchnia I Przełom Powierzchnia II A B Rysunek 18. Obrazy SEM membran żelowanych w metanolu z dodatkiem roztworów: 0,1M NaHCO 3 (A) oraz 0,1M NaHCO 3 z 0,1 M Na 2 CO 3 (B) 5. Podsumowanie i wnioski Na podstawie powyższych badań stwierdzono, że odczyn kwaśny nie wpływa na modyfikację struktury membran polilaktydowych nie obserwuje się zmian zarówno na powierzchniach jak i w przełomie. W przypadku odczynu obojętnego sytuacja jest bardzo podobna. Środowisko lekko zasadowe również nie powoduje istotnych zmian strukturalnych. Modyfikację powierzchni membran obserwuje się dopiero po zastosowaniu silnie zasadowego roztworu NaOH (ph 13,6). Powstają wtedy zmiany, które w zależności od czasu kąpieli trawiącej dotyczą jednej powierzchni lub obu, a także i przełomu. Zastosowanie przepływu zasadowego roztworu przez membranę zmienia jedynie przełom membrany, nie wpływając na jej powierzchnie. Silnie zasadowe roztwory przy krótkim czasie trawienia skutecznie usuwają warstwę naskórkową pokrywającą powierzchniowe pory. Dodatkowo roztwór ten sprzyja powstawaniu wzajemnych połączeń miedzy porami we wnętrzu membrany, poprzez zrywanie ścianek wewnętrznych. Efekty tych modyfikacji, zapewniają 119

Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski możliwość wniknięcia komórek do wnętrza membrany oraz pozwalają na migracje składników odżywczych i metabolitów. Pomimo tych korzystnych cech, roztwór ten obniża właściwości użytkowe membrany poprzez spadek wytrzymałości mechanicznej membrana staje się krucha i łamliwa. Wedle danych literaturowych stwierdzono, że trawienie membran substancjami powodującymi stopniowe rozpuszczanie materiału, powoduje zwiększenie porowatości od kilku do nawet kilkunastu razy. Dane te jednak nic nie mówią o wpływie trawienia na wytrzymałość badanego materiału [19, 20]. Widoczny wpływ środowiska zasadowego na modyfikację struktury membran, wynika z faktu że hydroliza polilaktydu zachodzi szybciej w środowisku zasadowym niż kwaśnym, co zostało udowodnione we wcześniejszych badaniach prowadzonych w zespole. Dodatek czynników trawiących do kąpieli żelującej, powoduje nierówność jednej powierzchni, a jednocześnie nie wywołuje pożądanych zmian w porowatości. Nieregularnie nierówna powierzchnia nie jest korzystna w stosowaniu rusztowań jako implantów, gdyż wyrób medyczny powinien mieć ściśle zdefiniowaną strukturę. Na podstawie powyższych wniosków stwierdzono, że odsłonięcie porów występujących na powierzchniach membran może nastąpić w przypadku działania na membrany roztworami silnie zasadowymi. Obniża to jednak wytrzymałość mechaniczną membrany oraz jakość jej właściwości użytkowych. Mimo tej wady, zważając na wysoką skuteczność modyfikacji powierzchni, badania nad zastosowaniem silnie zasadowych roztworów dalej trwają. Literatura 1. Loh Q. L., Choong C. Three-Dimensional Scaffolds for Tissue Engineering Applications: Role of Porosity and Pore Size, Tissue Engineering Part B; 19 (2013), s. 485-502 2. Mikos A., Temenoff J. Formation of highly porous biodegradable scaffolds for tissue engineering, Electronic Journal of Biotechnolgy, 3 (2000), s. 3-23 3. Kaźnica A., Joachimiak R., Drewa T., Rawo T., Deszczyński J. New trends in tissue engineering; Arthroscopy and Joint Surgery, 3 (2007), s. 11-16 4. Ma P. X. Scaffolds for tissue fabrication, Materials Today, 7 (2004), s. 30-40 5. Ko H. F., Sfeir C., Kumta P. N. Novel synthesis strategies for natural polymer and composite biomaterials as potential scaffolds for tissue engineering, Philosophical Translations of the Royal Society A: Mathematical, Physical & Engineering Sciences, 368 (2009), s. 1981-1997 6. Kawazoe N. Creation of novel materials for tissue regeneration as next generation medical technology, National Institute for Materials Science, online (2012) 120

Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych 7. Kim H. J., Kim K. K., Park I. K. Hybrid Scaffolds Composed of Hyaluronic Acid and Collagen for Cartilage Regeneration, Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 9 (2012), s. 57-62 8. Gadomska-Gajadhur A., Kruk A., Ruśkowski P., Synoradzki L. Wpływ dodatku porofora na morfologię skafoldów polilaktydowych. TEMPO s.c., (2015), s. 294-297 9. Kruk A., Gadomska-Gajadhur A., Ruśkowski P. Zastosowanie bioresorbowalnych rusztowań w inżynierii tkankowej, Wydawnictwo Naukowe Tygiel (2015), s. 91-102 10. Kruk A., Gadomska-Gajadhur A., Ruśkowski P., Przybysz A., Bijak V., Synoradzki L. Optymalizacja otrzymywania sfer poliaktydowych zawierających neomycynę z wykorzystaniem matematycznych metod planowania doświadczeń, Przemysł Chemiczny, 95 (2016), w druku 11. Gupta A.P., Kumar V. New emerging trends in synthetic biodegradable polymers Polylactide: a critique, European Polymer Journal, 43 (2007), s. 4053-4074 12. Nowak B., Pająk J. Biodegradacja polilaktydu (PLA), Archiwum Gospodarki Odpadami i Ochrony Środowiska, 12 (2010), s. 1-10 13. Duda A., Penczek S. Polilaktyd [poli(kwas mlekowy)]: synteza, właściwości i zastosowania, Polimery, 48 (2003), s. 16-27 14. Gunatillake P. A., Adhikari R. Biodegradable synthetic polymers for tissue engineering, European Cells and Materials, 5 (2003), s. 1-16 15. Chwojnowski A. Półprzepuszczalne membrany polisulfonowe. Warszawa: Zespół Wydawniczo-Poligraficzny IBIB PAN, 2011 16. Wen Y., Lian F., Ren Y., Guan H. Enhanced electrochemical properties of a novel polyvinyl formal membrane supporting gel polymer electrolyte by Al2O3 modification, J. B Polymer Physics, 52 (2014), s.572-577 17. Lan Levengood S., Zhang M. Chitosan-based scaffolds for bone tissue engineering, Journal of Materials Chemistry B, 2 (2014), s. 3161-3184. 18. Castro Vidaurre E. F., Achete C. A., Gallo F., Garcia D., Simão R., Habert A. C. Surface Modification of Polymeric Materials by Plasma Treatment, Materials Research, 5 (2002), s. 37-41 19. Qin J.J., Wong F. S., Ly Y., Liu Y. T. Hypochlorite treatment of hydrophilic hollow fiber ultrafiltration membranes for high fluxes, Desilination, 146 (2002), s. 307-309 20. Wojciechowski C., Chwojnowski A., Dudziński K., Łukowska E. Wpływ trawienia podchlorynem sodu na właściwości transportowo-separacyjne polisulfonowych membran kapilarnych., Monografie Komitetu Inżynierii Środowiska PAN Membrany i procesy membranowe w ochronie środowiska, 49 (2008), s. 31-36 121

Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski Modyfikacja powierzchni membran półprzepuszczalnych Streszczenie Rusztowania komórkowe (ang. Scaffolds) są przestrzennymi strukturami służącymi do prowadzenia hodowli komórkowych. Najczęściej mają formę membran półprzepuszczalnych, która zapewnia migracje składników odżywczych i metabolitów, co jest niezbędne do prowadzenia wydajnych hodowli tkankowych. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki otrzymywania oraz modyfikacji powierzchni polilaktydowych membran półprzepuszczalnych. Celem modyfikacji było odsłonięcie powierzchniowych porów, przykrytych przez cienką warstwę naskórkową. Zbadano wpływ roztworów kwasów, zasad i soli o różnym ph na powierzchnię membran. Wykazano, że tylko silnie zasadowe środowisko usuwa litą warstwę przykrywającą. Słowa kluczowe: rusztowania komórkowe, membrany półprzepuszczalne, metoda inwersji faz, biodegradowalne poliestry, polilaktyd The modification of surfaces of semi-permeable membranes for cell cultures Abstract Scaffolds are spatial structures used to cell cultures. There are often in form of semi-permeable membranes, which allows for migration nutrients and metabolites. It is necessary for the efficient tissue culture. Experimental results of the preparation and modification of semi-permeable membranes for cell cultures were presented. The aim of modification was exposing pores which are capped by a thin skin layer. The influence of solutions of acids, bases and salts with different ph on the surface of the membranes. It has shown that only highly alkaline environment removes the solid covering layer. Keywords: scaffolds, semi-permeable membranes, inversion phase method, biodegradable polyesters, polylactide 122