Mikroorganizmy jelitowe człowieka

Mikroorganizmy jelitowe człowieka The intestinal microbiota of humans Adriana Nowak, Zdzisława Libudzisz Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka Streszczenie W artykule omówiono zespół mikroorganizmów jelitowych człowieka, który stanowi jeden z najbogatszych gatunkowo ekosystemów na Ziemi. Zmienność warunków fizycznych i chemicznych w poszczególnych odcinkach przewodu pokarmowego determinuje specyficzny układ mikroorganizmów. Szczególną uwagę zwrócono na jelito grube, gdyż warunki tam panujące są najbardziej korzystne, a więc występuje tu najbogatsza biocenoza bakteryjna. Omówiono najważniejsze funkcje, jakie pełnią mikroorganizmy jelitowe w organizmie człowieka, a także zwrócono uwagę na czynniki, które mogą zaburzać równowagę w zespole mikroorganizmów jelitowych (np. dieta, leki, czas pasażu jelitowego). Może to z kolei prowadzić do dominacji tych gatunków, które powodują zaburzenia w funkcjonowaniu przewodu pokarmowego lub które w wyniku aktywności enzymatycznej biorą udział w wytwarzaniu związków toksycznych i rakotwórczych, w ten sposób przyczyniając się do rozwoju wielu chorób. Abstract In the article, the intestinal microbiota of humans, which harbors a huge amount of species on earth, was discussed. The changeable physical and chemical conditions in human gastrointestinal tract are determining specific quality and quantity of microorganisms in each part of that. The most conducive conditions are present in colon, so it is inhabited by the largest biocenosis of microorganisms. The most important functions of intestinal microbiota in human body and most common factors that perturb the homeostasis (e.g. diet, transit time) were also discussed. For that reason it can lead to domination of some bacterial species, which can contribute to malfunctions in gastrointestinal tract or, thus faecal enzymes activity, to producing different toxic and carcinogenic substances, responsible for many diseases. Słowa kluczowe: mikroorganizmy przewodu pokarmowego jelito grube człowieka Key words: gastrointestinal microbiota human colon Wstęp Zasadniczą rolę w prawidłowym funkcjonowaniu jelit, a tym samym całego organizmu człowieka odgrywają mikroorganizmy jelitowe. Ten bogaty zespół mikroorganizmów spełnia szereg dobroczynnych funkcji w organizmie. Jednakże aktywność niektórych grup może prowadzić do nagromadzenia produktów toksycznych, bądź mutagennych i rakotwórczych, co z kolei może powodować rozwój wielu chorób. Mikroorganizmy jelitowe Zespół mikroorganizmów jelitowych człowieka liczy około 10 14 komórek i stanowi jeden z najbogatszych gatunkowo ekosystemów na Ziemi, w skład którego wchodzi 17 rodzin, 45 rodzajów i ponad 1000 gatun- 372 standardy medyczne/pediatria 2008 T. 5 372 379 www.standardy.pl/pediatria

Jama ustna (10 8 jtk/g) sp. Peptococcus sp. Staphylococcus sp. Bifidobacterium sp. Lactobacillus sp. Fusobacterium sp. Jelito kręte (10 7 10 8 jtk/g) ph 7,3 7,7 Bacteroides Clostridium Enterobacteriaceae Enterococcus Lactobacillus Veillonella Jelito grube (10 10 10 11 jtk/g) ph 5,7 6,8 Bacteroides Bacillus Bifidobacterium Clostridium Enterococcus Eubacterium Fusobacterium Peptostreptococcus Ruminococcus Methanobrevibacter Przełyk Mikroorganizmy z pokarmu oraz z jamy ustnej Żołądek (10 4 jtk/g) Candida albicans Helicobacter pylori Lactobacillus Dwunastnica (10 3 10 4 jtk/g) ph 5,7 6,4 Bacteroides Candida albicans Lactobacillus Jelito czcze (10 5 10 7 jtk/g) ph 5,9 6,8 Bacteroides Candida albicans Lactobacillus Odbytnica (10 10 10 12 jtk/g) ph 6,6 6,8 Rysunek 1. Mikroorganizmy w przewodzie pokarmowym człowieka 5. ków. Mikroorganizmy te kolonizują blisko 200 400 m 2 powierzchni nabłonka jelitowego 1. W przewodzie pokarmowym wykryto przedstawicieli wszystkich trzech domen życia (Archeony, Bakterie, Eukarya), główną grupą są jednak Bakterie. Gatunki bakterii jelitowych należą do 8 z 25 znanych typów (działów, Phylum), z których główne to Firmicutes (gramdodatnie o niskiej zawartości G+C jest to procentowy udział zasad azotowych w DNA), Bacteroidetes (gramujemne o niskiej zawartości G+C) i Actinobacteria (gramdodatnie o wysokiej zawartości G+C) oraz Proteobacteria (gramujemne) 2, 3, 4. Około 80% stanowią mikroorganizmy niehodowlane, są one jednak zmienne i występują w różnej liczebności, zależnie od człowieka (geny kodujące hydrolazę oraz β-glukanazę są wskaźnikiem obecności). Przewód pokarmowy jest złożonym ekosystemem, w którym obserwuje się wzajemne oddziaływanie mikroorganizmów, komórek gospodarza oraz cząstek pożywienia 1. Termin mikroflora jest nieścisły, ponieważ odnosi się do świata roślin, podczas gdy dla bakterii, wirusów, drożdży i pierwotniaków powinno się używać raczej terminu mikrobiota 5. Bogactwo mikroorganizmów jelitowych jest ciągle odkrywane dzięki nowoczesnym metodom analitycznym, których znaczny postęp obserwuje się w ostatniej dekadzie. Wyłaniający się www.standardy.pl/pediatria standardy medyczne/pediatria 2008 T. 5 372 379 373

kierunek nowoczesnej mikrobiologii metagenomika może zrewolucjonizować zrozumienie i postrzeganie złożoności ekosystemu jelitowego 6. Projekt ten ma na celu poznanie nowych, jeszcze nie odkrytych gatunków mikroorganizmów. Tradycyjne metody badań mikroorganizmów jelitowych to metody hodowlane, czyli badanie pojedynczych rodzajów takich mikroorganizmów, które mogą być hodowane w laboratorium (izolacja bakterii z kału, hodowla na pożywkach selektywnych) i testowane pod mikroskopem. Te metody są pracochłonne i nie pozwalają na rozróżnienie wielu rodzajów bakterii 7. Bakterie zdolne do wzrostu w warunkach laboratoryjnych stanowią niewiele ponad 1%. Większość ważnych funkcji pełnionych przez mikroorganizmy jest widoczna wtedy, gdy występują one w złożonych grupach, a nie ma możliwości, aby warunki te odtworzono w laboratorium. Środowisko w obrębie przewodu pokarmowego jest zmienne, dlatego skład mikroorganizmów w różnych jego częściach okazuje się różnorodny. W jamie ustnej wykryto 700 gatunków z 9 typów (Phylum) Bakterii i 1 z typu Archeonów. Liczebnie dominuje rodzaj z typu Firmicutes. Cechą charakterystyczną jest zdolność adherencji do różnych powierzchni (zębów, błony śluzowej jamy ustnej, języka). W przełyku zidentyfikowano 95 gatunków z 6 typów, z których większość jest identyczna z tymi w jamie ustnej 8. W górnym odcinku przewodu pokarmowego ma miejsce szybki przepływ treści pokarmowej oraz aktywność sekrecyjna żołądka, dwunastnicy i wątroby, co nie sprzyja bytowaniu tu większej ilości bakterii, gdyż powoduje to ich wymywanie. Tak więc szansę zasiedlenia jelita krętego mają te mikroorganizmy, które są zdolne do adherencji do jego ścian 5. W żołądku, ze względu na kwaśne ph, bezsprzecznie dominuje Helicobacter pylori. Analiza 16S rrna potwierdziła obecność 128 gatunków bakterii z 8 typów, które reprezentują mikroorganizmy, także połknięte wraz z pokarmem 8. W dolnych odcinkach przewodu pokarmowego pasaż jelitowy jest wolniejszy, środowisko bardziej korzystne, a więc występuje tu najbogatsza biocenoza bakteryjna, z dominującymi bakteriami względnie i bezwzględnie beztlenowymi (Rysunek 1.). Obserwuje się także znaczne różnice pomiędzy zespołem mikroorganizmów w świetle jelit, a tymi związanymi z nabłonkiem jelitowym. W śluzie jelitowym stwierdzono obecność tlenu pochodzącego z tkanek, co stwarza środowisko korzystne dla mikroaerofili. Ponadto komórki Penetha wydzielają substancje antybakteryjne (lizozym i defensyny), enterocyty transportują przeciwciała IgA z blaszki właściwej śluzówki do światła jelita, co sprawia, że układ mikroorganizmów w nabłonku jest całkiem inny od tego w świetle jelita. Dlatego w obrębie tego samego gatunku bakterii mogą występować różne szczepy 5. W jelicie grubym wykryto 800 gatunków z 9 typów Bakterii i 1 z typu Archeonów. Liczba bakterii względnie beztlenowych zmniejsza się z 25 do 1% 8. Metody genetyczne pozwalają na wykrycie tylko 80 90% bakterii występujących w kale (z powodu m.in. braku sond i pożywek selektywnych). Analiza genów kodujących 16S rrna wykazała, że układ mikroorganizmów jelitowych u osób dorosłych jest stabilny i specyficzny, a więc jest cechą osobniczą organizmu. Wykryto, iż wśród mikroorganizmów kałowych należące do Firmicutes stanowią 46 58%, do Bacteroidetes i Actinobacteria 8 17%, a do Proteobacteria 10 30% 1 (Rysunek 2.). Istnieje kilka dominujących rodzajów bakterii w układzie mikroorganizmów jelitowych. Są to Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium (C. leptum, C. coccoides) i Eubacterium (E. rectale). O wiele mniej liczna jest grupa Atopobium oraz rodzaje Lactobacillus, Escherichia, Enterococcus, i Klebsiella 9, 10. Dane te nie dotyczą dzieci karmionych piersią, u których dominujące są bakterie z rodzaju Bifidobacterium (60 90%) oraz Bacteroides, podczas gdy Lactobacillus są nieliczne (poniżej 1%). Oprócz gatunków bakterii dominujących, stanowiących około 30% mikroorganizmów jelitowych, które są obecne u każdego człowieka, pozostałe mikroorganizmy każdego z nas są unikatowe. Zmiana w układzie mikroorganizmów jelitowych wraz z wiekiem Układ mikroorganizmów jelitowych zależy od wielu czynników, m.in.: produktów wydzielania wewnętrznego (kwas żołądkowy, kwasy żółciowe), perystaltyki, czasu pasażu jelitowego, genotypu gospodarza oraz od czynników środowiskowych, m.in.: diety, struktury i lepkości pożywienia, przyjmowanych leków 3. Układ mikroorganizmów jelitowych nie jest taki sam przez całe życie człowieka. Przewód pokarmowy noworodka jest jałowy, a jego kolonizacja rozpoczyna się natychmiast po urodzeniu i do 2 4 roku życia jest bardzo niestabilna, tak samo jak podczas starzenia się organizmu. Do czynników wpływających na kształtowanie się zespołu mikroorganizmów jelitowych 374 standardy medyczne/pediatria 2008 T. 5 372 379 www.standardy.pl/pediatria

dziecka można zaliczyć: stres podczas ciąży i porodu, rodzaj porodu, ekspozycja na drobnoustroje podczas porodu, hospitalizacja, sposób karmienia (piersią, czy mieszankami sztucznymi), dietę, mikroorganizmy matki, antybiotyki, leki, otoczenie dziecka, czynniki genetyczne i wiele innych 11, 12. Bakterie zasiedlają jelita noworodków tuż po urodzeniu i obserwuje się szybki, regularny wzrost ich liczby podczas pierwszego tygodnia życia. Zespół bakterii jelitowych w tym okresie jest heterogenny i może następować wiele zmian w jego składzie. Większość mikroorganizmów kałowych stanowią bifidobakterie, natomiast Escherichia coli, rodzaje Bacteroides i Clostridium występują w mniejszej ilości. Znaczny wpływ na układ mikroorganizmów jelitowych noworodków ma sposób karmienia piersią lub mieszankami mlecznymi. U dzieci karmionych piersią występuje znacznie mniej bakterii z rodzajów Clostridium i Escherichia, natomiast dominują rodzaje Bifidobacterium i Lactobacillus. Wraz z wiekiem, co związane jest z odstawieniem dziecka od piersi i wprowadzaniem do diety pokarmu stałego, następuje dalsza sukcesja rodzajów bakterii. Zwiększa się liczba mikroorganizmów z typów Bacteroidetes oraz Firmicutes i w okolicach 24 miesiąca życia zespół mikroorganizmów upodabnia się do tego, który występuje u dorosłego człowieka 12. Wraz ze starzeniem się organizmu obserwuje się zmiany w układzie mikroorganizmów jelitowych. Zwiększa się liczba bakterii z rodzajów Lactobacillus, Fusobacterium, Clostridium i Eubacterium, podczas gdy obniża się liczba gatunków z rodzajów Bacteroides i Bifidobacterium. Bakterie z rodzaju Bacteroides wykazują głównie aktywność amylolityczną. W związku z obecnością Fusobacterium sp., Clostridium sp. i Propionibacterium sp. zaczynają dominować w jelicie procesy proteolityczne, prowadzące do wytworzenia wielu toksycznych substancji, w tym amoniaku, związków fenolowych i indolowych oraz skatoli 13, 14. Mikroorganizmy te biorą udział w syntezie i aktywacji związków karcynogennych 15, 16. Funkcje mikroorganizmów jelitowych Badania prowadzone na zwierzętach z jałowym przewodem pokarmowym (tzw. germ-free animals) wykazały, że kolonizacja układu pokarmowego nie jest warunkiem koniecznym do przeżycia. Jednak- Rysunek 2. Drzewo filogenetyczne głównych grup bakterii kałowych 1, 9, 13. Atopobium (3,1 11,9%) Fusobacterium Enterobakterie (0,1 0,2%) Bacteroides/Prevotella (8,5 28%) Porphyromonas Bacteroides distasonis Bifidobacterium (4,4 4,8%) Lactobacillus/Enterococcus (<0,1 1,8%) Lactococcus Leuconostoc Staphylococcus Grupa Eubacterium cylindroides (1,1 1,4%) Grupa Clostridium histolyticum Grupa Clostridium lituseburense Eubacterium sensu stricto Grupa Clostridium coccoides/eubacterium rectale (22,7 28%) 10% Grupa Clostridium leptum (21,1 25,2%) Veilonella (<0,1 1,8%) www.standardy.pl/pediatria standardy medyczne/pediatria 2008 T. 5 372 379 375

Tabela 1. Substraty docierające do jelita grubego, podatne na fermentację 3. Substrat Rodzaj Produkty fermentacji n odporna skrobia n niestrawione polisacharydy n oligosacharydy (fruktoligosacharydy, galaktooligosacharydy, inulina) korzystne dla zdrowia: SCFA, kwas Sacharydy n monosacharydy (cukry, poliole) mlekowy n mucyny n syntetyczne sacharydy (laktuloza, modyfikowana celuloza) n pochodzące z pokarmu Białka n endogenne (np. enzymy jelitowe i inne) związki toksyczne (zapalenia jelit) n komórki nabłonkowe i rakotwórcze: amoniak, związki fenolowe i indolowe, skatole, siarkowodór, n związki azotowe niebiałkowe (mocznik, azotany) Inne kwasy żółciowe n kwasy organiczne, lipidy, bakterie że zwierzęta gnotobiotyczne są bardziej podatne na różnego rodzaju infekcje, co związane jest ze zmniejszoną aktywnością układu immunologicznego oraz brakiem oporności kolonizacyjnej. Badania te dowodzą, że kolonizacja układu pokarmowego przez mikroorganizmy ma znaczący wpływ na organizm gospodarza 10. Mikroorganizmy zasiedlające przewód pokarmowy można podzielić na: n wpływające korzystnie na zdrowie gospodarza (autochtoniczne), niezbędne do prawidłowego funkcjonowania jelit, a tym samym wpływające na homeostazę całego organizmu; n działające szkodliwie na zdrowie gospodarza (allochtoniczne), do których zalicza się drobnoustroje patogenne i toksynotwórcze. a) KORZYSTNE Mikroorganizmy jelitowe odgrywają bardzo ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu jelit, co ma związek ze zdrowiem całego organizmu gospodarza. Dzięki bogatej florze bakteryjnej zasiedlającej jelito grube możliwe jest trawienie resztek pokarmowych, które nie uległy degradacji w jelicie cienkim 13. Mikroorganizmy jelitowe na drodze fermentacji ułatwiają trawienie substratów docierających do jelita grubego takich, jak włóknik oraz tzw. odporna skrobi (tj. nie ulegająca trawieniu przez enzymy glikolityczne w początkowych odcinkach układu pokarmowego) (Tabela 1.). Produktami tych przemian są gazy (wodór, dwutlenek węgla, metan), krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA short chain fatty acids) oraz kwasy tłuszczowe o rozgałęzionych łańcuchach (BCFA branched chain fatty acids), będące źródłem dodatkowej energii dla organizmu (ilość energii uzyskiwanej w ten sposób wynosi 7 10% całkowitej energii pochodzącej z pokarmu). SCFA stymulują proliferację oraz różnicowanie enterocytów jelitowych, obniżają ph jelita, a także stymulują rozwój tkanki nabłonka jelitowego (kwas masłowy), hepatocytów (kwas propionowy) oraz tkanek obwodowych (kwas octowy) 10, 13, 18. Produkty fermentacji regulują metabolizm glukozy i lipidów. SCFA wpływają na gospodarkę mineralną, pobudzając absorpcję z jelita grubego jonów wapnia, magnezu i żelaza 10, 13. Mikroorganizmy jelitowe wpływają na uwalnianie biologicznie aktywnych peptydów i tym samym przyczyniają się do regulacji wydzielniczych jelitowych komórek endokrynowych, a także mają wpływ na strukturę komórek nabłonkowych. Mikroorganizmy jelitowe stanowią naturalną barierę zabezpieczającą przed kolonizacją przez egzogenne bakterie patogenne i chorobotwórcze, dzięki współzawodnictwu o przestrzeń życiową, o obecne w ograniczonej ilości substancje odżywcze, jak również dzięki produkcji bakteriocyn oraz kwasów organicznych, zabójczych dla niektórych mikroorganizmów patogennych lub hamujących ich wzrost 10. Ponadto mikroorganizmy jelitowe poprzez obniżanie ph, stwarzają nieprzyjazne środowisko życia dla innych drobnoustrojów. Właściwość tę wykazują zwłaszcza bakterie fermentacji mlekowej. Niektóre mikroorganizmy jelita grubego wpływają ponadto korzystnie na zdrowie gospodarza poprzez syntezę niektórych witamin z grupy B (B 1, B 2, B 6, a głównie B 12 ) oraz witaminy K 10, 13, a także poprzez obniżanie poziomu cholesterolu 19, 20 oraz stymulację układu immunologicznego gospodarza do stałego wytwarzania przeciwciał, co pozwala na szybszą odpowiedź immunologiczną w przypadku zakażenia drobnoustrojami z zewnątrz 13. 376 standardy medyczne/pediatria 2008 T. 5 372 379 www.standardy.pl/pediatria

b) NEGATYWNE Mimo że zespół mikroorganizmów jelitowych człowieka jest swoisty i dość stabilny, równowaga ta może zostać zaburzona w wyniku działania wielu czynników zarówno egzogennych, jak i endogennych. Nadmierne namnożenie bakterii zaliczanych do grupy neutralnej jelita grubego, może powodować zaburzenia w funkcjonowaniu organizmu człowieka. Gatunki bakterii, takie jak Enterococcus,, Bacteroides i Escherichia coli, naturalnie bytujące w jelicie grubym, mogą stanowić źródło choroby, wtedy gdy staną się mikroorganizmami dominującymi 13. Do czynników powodujących niekorzystne zmiany w składzie i aktywności zespołu mikroorganizmów jelitowych należą 21 : operacje chirurgiczne żołądka i jelita cienkiego, zaburzenia perystaltyki, zapalenie jelita grubego, choroby nerek i wątroby, nowotwory, zaburzenia w funkcjonowaniu systemu odpornościowego, radioterapia, antybiotykoterapia, starzenie się, nieodpowiednia dieta, stres. Najczęściej zaburzenia w składzie mikroorganizmów jelitowych spowodowane są podawaniem antybiotyków, co może prowadzić do nadmiernego namnożenia mikroorganizmów opornych na dany antybiotyk i ułatwienia transferu materiału genetycznego między bakteriami. Na skutek zbyt intensywnego namnożenia drobnoustrojów opornych może dojść do rozwoju wielu chorób, takich jak zatrucia pokarmowe oraz biegunki, które towarzyszą wszelkim zmianom w zespole mikroorganizmów jelitowych. Stwierdzono, że enterotoksyczne szczepy Escherichia coli są odpowiedzialne za biegunki u dzieci z krajów rozwijających oraz u osób podróżujących (tzw. biegunka podróżnych). Zbyt duże namnożenie bakterii może także prowadzić do rozprzestrzenienia się drobnoustrojów poza układ pokarmowy 22. Najczęściej są to baterie należące do rodzaju Escherichia, Proteus i Klebsiella. Mikroorganizmy jelitowe mogą przyczynić się do powstawania nowotworów nerek, wątroby, jajników oraz przewodu pokarmowego, w szczególności jelita grubego. Wskazują na to następujące fakty 23 : n z kału ludzkiego wyizolowano wiele mutagennych, genotoksycznych substancji (zdolnych do wiązania się z DNA komórki i naruszania jego struktury) pochodzenia bakteryjnego; n bakterie jelitowe potrafią przekształcać substancje pokarmowe w związki genotoksyczne, karcynogenne, o aktywności promującej powstawanie i rozwój nowotworów (tzw. promotory); n mikroorganizmy jelitowe mogą aktywować prokarcynogeny (związki rakotwórcze wymagające wstępnej aktywacji metabolicznej i działające pośrednio poprzez ich aktywne metabolity), powodując powstawanie reaktywnych adduktów DNA; n u gnotobiotycznych szczurów (z jałowym przewodem pokarmowym), karmionych pożywieniem takim, jakie spożywają ludzie, stwierdzono niższy poziom karcynogenów w tkankach, niż u gryzoni z konwencjonalnym zespołem mikroorganizmów. W wyniku aktywności tzw. enzymów fekalnych mikroorganizmów jelitowych generowanych jest wiele produktów genotoksycznych, mutagennych i rakotwórczych niebezpiecznych dla zdrowia człowieka (Tabela 2.). Sprzyja temu dieta bogata w białka i tłuszcze zwierzęce, co w efekcie, obok wielu innych czynników (np. środowiskowych) może prowadzić do rozwoju nowotworów jelita grubego (tab. 1.) 23. Zespól mikroorganizmów jelitowych czło wie ka może być całkowicie zachwiany w stanach chorobowych. Na przykład w zapaleniu zbiornika kałowego (pouchitis) obserwuje się zmniejszoną liczbę bakterii z rodzajów Bifidobacterium i Lactobacillus, a większą liczbę Clostridium sp. Powoduje to mniejszą produkcję SCFA i podwyższenie ph, co wyklucza efekt bariery i sprawia, że nabłonek jelitowy jest bardziej podatny na zapalenia 24. Niekorzystne zmiany w układzie mikroorganizmów jelitowych są podłożem dla choroby Leśniowskiego-Crohna. Nie wiadomo jednak, czy przyczyniają się one do tej choroby, czy są jej wynikiem. Zaobserwowano, iż różnorodność w obrębie typu Firmicutes u osób z chorobą Leśniowskiego-Crohna ulega redukcji (43 gatunki wykryto Tabela 2. Mikroorganizmy jelitowe o aktywności β-glikozydaz 17. Enzym Rodzaje lub gatunki bakterii Bacteroides uniformis β-glukozydaza Bacteroides ovatus Enterococcus faecalis Bacteroides fragilis Bacteroides vulgatus Bacteroides thetaiotaomicron Eubacterium eligens β-glukuronidaza Peptostreptococcus sp. Escherichia coli Staphylococcus sp. Clostridium sp. Escherichia coli β-galaktozydaza Bacteroides distasonis www.standardy.pl/pediatria standardy medyczne/pediatria 2008 T. 5 372 379 377

u zdrowych, a tylko 13 gatunków u chorych) 25. We wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego (ulcerative colitis) również obserwuje się mniejszą różnorodność zespołu mikroorganizmów jelitowych i jest on mniej stabilny. Generalnie występuje mniej Bifidobacterium sp., natomiast więcej bakterii z rodziny Enterobacteriaceae w porównaniu do osób zdrowych. Zmiany w zespole mikroorganizmów jelitowych indukują nieprawidłową reakcję immunologiczną na antygeny zewnętrzne (alergeny, patogeny), a nawet własne bakterie jelitowe. U pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit obserwuje się większą ilość bakterii adherujących na powierzchni nabłonka jelitowego, niż u osób zdrowych. Najwięcej spośród nich należy do rodzaju Bacteroides sp. Może to powodować, w zależności od predyspozycji genetycznych, wzmożoną aktywację limfocytów Th1 lub Th2, co doprowadza do rozwoju przewlekłych chorób zapalnych i autoimmunologicznych oraz chorób alergicznych. Do nieswoistych zapaleń jelit mogą przyczynić się także produkty fermentacji mikroorganizmów, takie jak wodór, amoniak, związki fenolowe, indolowe i siarkowodór (tab. 1.) 22, 26. Podsumowanie Tradycyjne metody badań mikroorganizmów jelitowych to metody hodowlane, czyli izolacja szczepów bakterii z kału (w tych próbach reprezentowane są jednak głównie mikroorganizmy światła esicy), hodowla na pożywkach selektywnych (około 60% mikroorganizmów nie można hodować w warunkach laboratoryjnych) oraz metody mikroskopowe. Są one pracochłonne i nie pozwalają na rozróżnienie wielu rodzajów bakterii. Do nowoczesnych metod badań mikroorganizmów jelitowych należą niehodowlane metody genetyczne. Uważa się, że obecnie około 80 90% bakterii występujących w kale można wykryć metodami genetycznymi, takimi jak: PCR (polymerase chain reaction reakcja łańcuchowa polimerazy), połączona z amplifikacją genów rybosomalnego RNA (16S rrna), nie większych, niż 400bp lub z DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis elektroforeza na żelach z gradientem czynnika denaturującego) albo z trflp (terminal restriction fragments length polymorphism polimorfizm długości terminalnych fragmentów restrykcyjnych). Odmiany PCR, takie jak qpcr (quantitative polymerase chain reaction ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy) oraz real-time PCR (PCR w czasie rzeczywistym) oraz system Taq-Man (z zastosowaniem oligonukleotydowych sond hybrydyzacyjnych). Ponadto stosuje się także metodę FISH (fluorescent in situ hybridization hybrydyzacja fluorescencyjna in situ), w której wykorzystuje się specyficzne komplementarne sondy 16S rrna znakowane fluorescencyjnie, wykrywające niektóre rodzaje, a także gatunki bakterii oraz hybrydyzację membranową i cytometrię przepływową, co pozwala na zliczanie komórek mikroorganizmów i szybką analizę większej ilości prób. Innymi metodami są hybrydyzacja dot-blot, w której wykorzystuje się znakowane (enzymatycznie lub fluorochromami) sondy DNA, następnie sekwencjonowanie genów 16S rrna, co pozwala na identyfikację mikroorganizmów do poziomu szczepu oraz fingerprinting (tzw. metoda odcisków palców) polegająca na amplifikacji DNA z użyciem 8 10-nukleotydowych starterów i rozdziale otrzymanych produktów w denaturującym żelu poliakryloamidowym. Rozwój tych metod jest obiecujący i pozwoli w przyszłości na determinację mikroorganizmów jelitowych człowieka zdrowego, jak i w stanach chorobowych przewodu pokarmowego. n dr Adriana Nowak prof. dr hab. Zdzisława Libudzisz Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka ul. Wólczańska 171/173, 90-924 Łódź tel (042) 636 36 39 ** adriana.nowak@p.lodz.pl Piśmiennictwo 1 Zoetendal EG, Vaughan EE, de Vos WM. A microbial world within us. Mol Microbiol 2006;59:1639 1650. 2 Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN i wsp. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 2005;380:1635 1638. 3 Egert M, de Graaf AA, Smidt H i wsp. Beyond diversity: functional microbiomics of the human colon. Trends Microbiol 2006;14:86 91. 4 Louis P, Scott KP, Duncan SH i wsp. Understanding the effects of diet on bacterial metabolism in the large intestine. J Appl Microbiol 2007;102:1197 1208. 5 Isolauri E. Probiotics. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2004;18:299 313. 6 Gill SR, Pop M, DeBoy R i wsp. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science 2006;2:1355 1359. 7 Furrie E. A molecular revolution in the study of intestinal microflora. Gut 2006;55:141 143. 8 Dethlefsen L, Eckburg PB, Bik EM i wsp. Assembly of the human intestinal microbiota. Trends Ecol Evol 2006;21:517 523. 9 Walker WA, Goulet O, Morelli L. i wsp. Progress in the science of probiotics: from cellular microbiology and applied immunology to clinical nutrition. Eur J Nutr 2006;45(1S):1 18. 378 standardy medyczne/pediatria 2008 T. 5 372 379 www.standardy.pl/pediatria

10 O Hara AM, Shanahan F. Gut microbiota: mining for therapeutic potential. Clin Gastroenterol Hepatol 2007;5:274 284. 11 Salminen S, Isolauri E. Intestinal colonization, microbiota and probiotics. J Pediatr 2006;149:115 120. 12 de la Cochetière MF, Rougé C, Darmaun D i wsp. Intestinal microbiota in neonates and preterm infants: a review. Curr Pediatr Rev 2007;3:21 34. 13 Blaut M, Marteau P, Miller GD. Probiotics and the intestinal Microflora: what impact on the immune system, infections and aging? Curr Nutr Food Sci 2006;2:79 95. 14 Woodmansey EJ. Intestinal bacteria and ageing. J Appl Microbiol 2007;102: 1178 1186. 15 Nowak A, Libudzisz Z. Mutagenne i karcynogenne metabolity tworzone przez mikroflorę jelita grubego człowieka. Post Mikrobiol 2004;43(3):321 339. 16 Nowak A. Rozkład karcynogennych metabolitów przez jelitowe bakterie z rodzaju Lactobacillus. Praca doktorska, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka 2008. 17 Chadwick RW, George E, Claxton LD. Role of intestinal mucosa and microflora in the bioactivation of dietary and environmental mutagens or carcinogens. Drug Metab Rev 1992;24:425 492. 18 Blaut M, Clavel T. Metabolic diversity of the intestinal microbiota: implications for health and disease. J Nutr 2007;137:751 755. 19 Kapila S, Sinha PR. Antioxidative and hypocholesterolemic effect of Lactobacillus casei ssp. casei (biodefensive properties of lactobacilli). Indian J Med Sci 2006;60:361 370. 20 Liong MT, Shah NP. Effects of Lactobacillus casei synbiotic on serum lipoprotein, intestinal microflora, and organic acids in rats. J Dairy Sci 2006; 89:1390 1399. 21 Mitsuoka T. Intestinal flora and human health. Asia Pacific J Clin Nutr 1996; 5:2 9. 22 Guarner F, Malagelada J. Gut flora in health and disease. The Lancet 2003; 360:512 519. 23 Burns AJ, Rowland IR. Anti carcinogenicity of probiotics and prebiotics. Curr Issues Intest Microbiol 2000;1:13 24. 24 Limdi JK, O Neill C. Do probiotics have a therapeutic role in gastroenterology? World J Gastroenterol 2006;12(34):5447 5457. 25 Gut microbiota in health and disease. Report of the 2nd International Workshop in Amsterdam. April 26 28, 2007. www.isapp.net/docs/report_gutmicrobiota_2007.pdf 26 Van Nuenen M, Venema K, Van der Woude J i wsp. The metabolic activity of faecal microbiota from healthy individual and patients with inflammatory bowel disease. Dig Dis Sci 2004;49:485 491. standardy medyczne/pediatria 2008 T. 5 372 379