Opomosc na ciprofloksacyn? szczepow Neisseria gonorrhoeae izolowanych w Polsce w latach

MED. DOSW. MIKROBIOL., 2014, 66: 99-104 Opomosc na ciprofloksacyn? szczepow Neisseria gonorrhoeae izolowanych w Polsce w latach 2012-2013 Resistance to ciprofloxacin of Neisseria gonorrhoeae strains isolated in Poland in 2012-2013 Beata Mfynarczyk-Bonikowska', Marlena Kujawc^, Grazyna Mfynarczyk', Magdalena Malejczyk', Slawomir Majewski' 'Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii Warszawski Uniwersytet Medyczny w Warszawie ^Katedra i Zaktad Mikrobiologii Lekarskiej Warszawski Uniwersytet Medyczny w Warszawie Ciprofloksacyna jest powszechnie stosowanym lekiem przeciwbakteryjnym stosowanym mi^dzy innyini w leczeniu zakazen drog moczowych w tym cz^sto w empirycznym leczeniu zapalenia cewki moczowej. Celem pracy byla ocena wrazliwosci na ciprofloksacyna szczepow Neisseria gonorrhoeae izolowanych od chorych z rzez^czkq na przetomie 2012 i 2013 roku. Wykazano, ze tylko 38,5"/o szczepow bylo wrazliwych na ciprofloksacyn^. Slowa kluczowe: Neisseria gonorrhoeae, ciprofloksacyna, opornosc ABSTRACT Introduction: Ciprofloxacin is cotninonly used in Poland specially for the treatment of urinary tract infections including urethritis. Patients are often treated without pathogen identification and antimicrobial resistance tests. Neisseria gonorrhoeae infection is one of the most common causes of urethritis in Poland. The resistance of bacteria to a wide range of antibiotics including ciprofloxacine makes the therapy of gonorrhoea more difficult. The mechanism of ciprofloxacine action depends on inactivation of bacterial topoisomerase II (gyrase) and topoisomerase IV. A resistance to ciprofloxacine occurring in Neisseria gonorrhoeae is mainly due to mutations in bacterial gyhcencoding topoisomerase II) and/or parc (encoding topoisomerase IV )genes. High level resistance is an effect of combination of three or four mutations. Another, less important mechanism of ciprofloxacin resistance, that can coexist with mutations in gyra and parc genes related to the overproduction of membrane pumps proteins. Material and methods: 65 Neisseria gonorrhoeae strains isolated from patients of Department of Dermatology and Wenereology in Warsaw in the second half of 2012 and first

100 B. Mlynarczyk-Bonikowska i inni Nr2 of 2013 was investigated. The strains were cultured on chocolate agar plates in a 5% C02 atmosphere at 37 C and identified by colony morphology. Gram stain and oxidase reaction, followed by carbohydrate utilization test. Ciprofloxacin susceptibility was determined by E-Tests (biomerieux). Bacteria were incubated at 35 C in 5% C02 for 24 h on chocolate agar plates. Tests were performed according to producers recommendations. The results (sensitive or resistant) were interpreted according to EUCAST recommendations. Results: The MIC (Minimal inhibitory concentration) of Ciprofloxacin in investigated strains ranged from 0,002 to >32 mg/l, MIC5 =8 mg/l, MIC, =>32 mg/l. It was shown that only 38.5% of the strains were sensitive to ciprofloxacin according to EUCAST criteria from 2013 year. Conclusions: Due to the high percentage of ciprofloxacin resistant Neisseria gonorrhoeae strains (more than 61%)) the antibiotic should not be used for the treatment of gonorrhoea in Poland. Key words: Neisseria gonorrhoeae, resistance, ciprofloxacin WST^P Ciprofloksacyna jest syntetycznym lekiem przeciwbakteryjnym z grupy fluorochinolonow powszechnie stosowanym w Polsce, szczegolnie w leczeniu zakazen ukladu moczowego, w tym w zapaleniach cewki moczowej. Nierzadko leczenie wl^czane jest na podstawie objawow klinicznych (wyciek z cewki moczowej, dyzuria) bez identyfikacji patogenu wywotuj^cego, a tym bardziej bez oznaczania wrazliwosci bakterii na stosowany antybiotyk. Liczba zarejestrowanych przypadkow rzez^czki w Polsce wynosila wg danych NIZP- -PZH w 2012 roku 1,9 a w 2013 1,7 na 100 tys. jednak bior^c pod uwag? fakt, ze wi^kszosc przypadkow nie jest zglaszanych problem moze bye znacznie bardziej powszechny. Niew^tpliwie rzez^czka obok zakazen Chlamydia trachomatis jest jedn^ z najcz^stszych przyczyn zapalenia cewki moczowej w Polsce. Leczenie utrudnia narastaj^ca opomosc N. gonorrhoeae na stosowane antybiotyki, w tym ciprofloksacyn^. Mechanizm dziatania ciprofloksacyny polega na inaktywacji dwoch enzymow bakteryjnych: topoizomerazy 11 (gyrazy) i topoizomerazy IV odpowiedzialnych za superspiralizacj^ DNA. Opomosc N.gonorrhoeae na ciprofloksacyny moze bye wamnkowana przez dwa mechanizmy: mutacje w genach gyra i parc, koduj^cych odpowiednio topoizomerazy 11 i IV oraz nadprodukcjy biatek pomp Wonowych MtrCDE, MacA-MacB i NorM. U N.gonorrhoeae do tej pory nie odkryto acetylotransferaz ciprofloksacyny oraz bialek aktywnie chroni^cych gyrazy, wystypuj^cych u innych bakterii Gram-ujemnych (7,10, 11, 17, 21). Najwiyksze znaczenie maj4 mutacje w genach gyra i parc. O opomosci decyduje zwykle kombinacja zmian jednoczesnie w obu bialkach. W obu biatkach istnieje kilka najczysciej opisywanych substytucji, przy czym wystypuj^ one z rozn^ czystosci^ w zaleznosci od regionu geograficznego. W Polsce dane dotycz^ce poziomu wrazliwosci szczepow JV. gonorrhoeae m ciprofloksacyny s^ jak dot^d sk^pe i dotycz^ lat 2010 - czysciowo 2012 (13). Celem podjytych badah byla ocena poziomu wrazliwosci szczepow A^. gonorrhoeae na ciprofloksacyny, izolowanych od pacjentow, zglaszaj^cych siy do poradni Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach 2012-2013

Nr2 Lekoopomosc N. gonorrhoeae 101 MATERIAL I METODY Badano 65 izolatow Neisseria gonorrhoeae pochodz^cych z wymazow z cewki moczowej, szyjki macicy, gardia lub odbytu od chorych z Kliniki Dermatologii i Wenerologii. Byty to szczepy izolowane w kohcu 2012 roku, nie badane w poprzedniej pracy (13) oraz szczepy z 2013 roku. Bakterie hodowano na agarze czekoladowym (biomerieux), w atmosferze zawieraj^cej 5% CO,, w temperaturze 37 C i identyfikowano na podstawie morfologii kolonii, morfologii komorek w preparatach mikroskopowych barwionych metod^ Grama, wynikow testu oksydazowego, oraz testu fermentacji cukrow (API NH, biomerieux). Oceny wrazliwosci zgromadzonych szczepow Neisseria gonorrhoeae na ciprofloksacyny dokonano przy uzyciu paskow nas^czonych gradientem styzenia leku (E-testow), (biomerieux). Oznaczenie wykonywano zgodnie z zaleceniami producenta. Dla kazdego szczepu przygotowano zawiesiny w roztworze fizjologicznym NaCl o gystosci 0,5 w skali McFarlanda i rozprowadzono j ^ rownomiemie na powierzchni agaru czekoladowego (14). Paski zawieraj^ce gradient antybiotyku nakladano po 10 minutach od wykonania posiewu. Inkubacjy prowadzono w temperaturze 37 C, w atmosferze wzbogaconej CO, Odczyt E- testow dokonywany by! po 24 godzinach przy uzyciu lupy. Obecnosc kolonii bakteryjnych wokol paska oznaczala opomosc na dane styzenie antybiotyku. Wyniki interpretowano zgodnie z zaleceniami EUCAST. Tabela I. Porownanie kryteriow wrazliwosci na ciprofloksacyny wg. EUCAST i CLSI oraz wartosci MIC ciprofloksacyny okreslone dla 65 badanych szczepow N. gonorrhoeae. MIC Wrazliwosc Liczba szczepow (mg/l) EUCAST 2013 CLSI 2013 >0,002 0 S S 0,002 2 S S 0,004 13 s S 0,008 5 s S 0,016 4 s S 0,032 1 s s 0,064 0 I s 0,125 0 R 1 0,25 1 R 1 0,5 0 R 1 1,0 0 R R 2,0 3 R R 4.0 3 R R 8,0 3 R R 16,0 3 R R 32,0 1 R R >32,0 26 R R Objasnienia: S-wrazliwy, 1-srednio wrazliwy, R-opomy

102 B. Mlynarczyk-Bonikowska i inni Nr2 WYNIKI Mimo roznic w kryteriach wrazliwosci na ciprofloksacyny opracowanych przez EU CAST i CLSI, to w przypadku badanych szczepow, uzyskano podobne wyniki niezaleznie od zastosowanego kryterium. Niewielka roznica wyst^pila tylko w przypadku jednego szczepu, ktory zgodnie z kryteriami CLSI byl slabo wrazliwy, a w przypadku zastosowania kryteriow EUCAST by! opomy. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. W tabeli II. obliczono wartosci MIC50 i MIC90 ciprofloksacyny dla badanych szczepow. Tabela II. M1C, i MIC,^ ciprofloksacyny dla szczepow N.gonorrhoeae. Liczba szczepow Zakres MIC mg/l M1C, mg/l MIC, mg/l 65 0.002->32 8 >32 Liczba (%) szczepow wg EUCAST 2013 wg CLSI 2013 s 1 R S 1 R 25 (38,5) 0 40 (61,5) 25 (38,5) 1 (1,5) 39 (60,0) DYSKUSJA Prowadzone przez nas wczesniej badania obejmowaly charakterystyky epidemiologiczn^ 218 szczepow A^. gonorrhoeae izolowanych w naszym osrodku w latach 2010-12 (13). Stwierdzono wowczas, ze w roku 2010 dominowaly nastypuj^ce klony NG-MAST: 5421, charakteryzuj^cy siy wrazliwosci^ na ciprofloksacyny (MIC 0,125-0,5), ST5421 (MIC 2-4) oraz opomy na ciprofloksacyny ST 225 (MIC16->32). W 2011 roku wsrod najczystszych typow NG-MAST nalezy wymienic wrazliwy na antybiotyki w tym na ciprofloksacyny ST2992 (MIC dla ciprofloksacyny 0,002-0,008). W 2011 stwierdzono ponadto podobn^ liczby przedstawicieli typu ST 1407. Ten ostatni typ NG-MAST po raz pierwszy zostat wyizolowany w Polsce w czerwcu 2011, aw roku 2012 wyraznie juz dominowal, stanowi^c 41,8 % wszystkich izolatow. ST 1407 charakteryzowat siy wartosciami MIC ciprofloksacyny 8->32mg/L (13). Nie jest to jednak jedyny problem zwi^zany z ST 1407. Charakteryzuje siy on mozaikow^ strukmr^ PBP2 (penicilin binding proteine 2), co wi^ze siy z obnizon^ wrazliwosci^ lub nisk^ opomosci^ na antybiotyki betalaktamowe, a w tym zalecany w leczeniu rzez^czki ceftriakson. Co wiycej, jak wykazano uprzednio, wystarczy pojedyncza mutacja aby powstaly szczepy o wysokiej opomosci na ceftriakson; taki szczep opisano m. in. we Francji (18). Wsrod innych typow NG-MAST wyizolowanych w Polsce w latach 2010-2012 szczepow dwoinek rzez^czki opomych na ciprofloksacyny (M1C>32), mozna wymienic m.in. ST 8379, ST 1861 i ST 1340 (13). Opomosc Neisseria gonorrhoeae na ciprofloksacyny wsrod obecnie badanych szczepow, pochodz^cych z lat 2012-2013, wystypowata u 61,5%. Jest to wynik bardzo zblizony do wynikow uzyskanych dla szczepow z lat wczesniejszych (61% opomych izolatow) (13). Uzyskane wyniki wskazuj^, ze odsetek szczepow dwoinek rzez^czki opomych na ciprofloksacyny w Polsce w ostatnich latach (2010-2013) utrzymuje siy na stalym, wysokim poziomie. Badania izolatow z innych krajow europejskich przeprowadzane w ramach

Nr2 Lekoopomosc N. gonorrhoeae 103 EURO-GASP wykazaly l^cznie opomosc wsrod 52,7% w 2010 roku i 48,7 % w 2011 roku. Czystosc wystypowania opomosci na ciprofloksacyny wsrod szczepow N. gonorrhoeae znacznie roznila siy w poszczegolnych krajach uczestnicz^cymi w EURO-GASP. W 2011 roku najwyzszy odsetek szczepow opomych wystypowal w Rumunii (80,8%) a najnizszy w Irlandii (14,1%) (6). W Szwajcarii w latach 2009-12 ponad 73% szczepow wykazywalo opomosc na ciprofloksacyny (5). Badania przeprowadzane w Rosji w ramach RU-GASP wlatach 2008-2009 wykazaly ponad 49% szczepow opomych na cipofloksacyny (9). Wedhig badah przeprowadzanych w ramach GISP, odsetek szczepow N. gonorrhoeae opomych na ciprofloksacyny w USA w 2011 roku wynosit 13,3% (8). W rejonie Ameryki Poludniowej i Karaibow w 2011 roku opomych na ciprofloksacyny byio 42,1% badanych izolatow (4). W niektorych rejonach Azji opomosc na ciprofloksacyny dotyczy nawet 97% (Pakistan, Indie, Bhutan) (15) lub 100%) (np. Shandong Chiny) izolowanych szczepow (22). Wsrod opomych na ciprofloksacyny typow NG-MAST wymieniano w innych krajach szczegolnie ST 1407 i 225 (3, 5). Sposrod 97%) szczepow o obnizonej wrazliwosci na cefiksym, badanych w Anglii i Walii, 74% reprezentowalo ST 1407 i 100% bylo opomych na ciprofloksacyny (3). Ze wzglydu na wysoki odsetek szczepow opomych na chinolony, CDC juz od 2003 roku wycofalo rekomendacje dla ciprofloksacyny w leczeniu rzez^czki (20). Rowniez lusti nie zaleca stosowania tego antybiotyku u chorych zakazonych N. gonorrhoeae (dopuszczona jest mozliwosc zastosowania tylko u chorych z ciyzkim uczuleniem na cefalosporyny, po uprzednim wykazaniu in vitro, ze dany szczep jest wrazliwy na ciprofloksacyny) (1). Przeprowadzone przez nas badania wykazuj^, ze rowniez w Polsce ciprofloksacyna nie powinna bye lekiem mtynowo stosowanym w leczeniu rzez^czki. PISMIENNICTWO 1. Bignell C, Unemo M; European STl Guidelines Editorial Board.2012 European guideline on the diagnosis and treatment of gonorrhoea in adults. Int J STD AIDS 2013; 24: 85-92. 2. Chisholm SA, Alexander S, Desouza-Thomas L i inni. GRASP Collaborative Group. Emergence of a Neisseria gonorrhoeae clone showing decreased susceptibility to cefixime in England and Wales.J Antimicrob Chemother 2011; 66: 2509-12. 3. Chisholm SA, Unemo M, Quaye Ni inni. Molecular epidemiological typing within the European Gonococcal Antimicrobial Resistance Surveillance Programme reveals predominance of a multidrug-resistant clone. Euro Surveill. 2013; 17: 18(3) pii: 20358. 4. Dillon J A, Trecker MA, Thakur SD. Gonococcal Antimicrobial Surveillance Program Network in Latin America and Caribbean 1990-2011.Two decades of the gonococcal antimicrobial surveillance program in South America and the Caribbean: challenges and opportunities. Sex Transm Infect 2013; 89 Suppl. 4:iv36-41. 5. EndimianiA, Guilarte YN, Tinguely R i inni. Characterization of Neisseria gonorrhoeae isolates detected in Switzerland (1998-2012): Emergence of mulddrug-resistant clones less susceptible to cephalosporins. BMC Infect Dis 2014; 14: 106. doi: 10.1186/1471-2334-14-106. 6. European Centre for Disease Prevention and Control. Gonococcal antimicrobial susceptibility surveillance in Europe, 2011. Stockholm: ECDC; 2013. 7. Golparian D, Shafer WM, Ohnishi M, Unemo M. Importance of multidrug efflux pumps in the antimicrobial resistance property of clinical multidrug-resistant isolates oineisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 3556-9.

104 B. Mlynarczyk-Bonikowska i inni Nr2 8. Kirkcaldy RD, Kidd S, Weinstock HS i inni. Trends in antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae in the USA: the Gonococcal Isolate Surveillance Project (GISP), January 2006-June 2012. Sex Transm Infect. 2013; 89 Suppl 4;iv5-10. doi: 10.1136/sextrans-2013-051162. 9. Kubanova A, Frigo N, Kubanov A i inni. The Russian gonococcal antimicrobial susceptibility programme (RU-GASP) - national resistance prevalence in 2007 and 2008, and trends during 2005-2008. Euro Surveill 2010; 8: 15(14). 10. Kulkarni S, Bala M, Sane S i inni. Mutations in the gyra and parc genes of quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates in India. Int J Antimicrob Agents 2012; 40: 549-53. 11. Lindback E, Rahman M, Jalal S, Wretlind B. Mutations in gyra, gyrb, parc, and pare in quinolone-resistant strains of Neisseria gonorrhoeae. APMIS 2002; 110: 651-7. 12. LiuWB, WangGJ.JingL. The andmicrobia! susceptibility of A^emenagowo^-r/zoeae in Weihai. China J Lepr Skin Dis 2006; 22: 204-6. 13. Mlynarczyk-Bonikowska B. Serwin AB, Golparian D i inni. Gonorrhoea epidemiology, antimicrobial susceptibility/resistance and genetic characteristics of Neisseria gonorrhoeae isolates from Poland, 2010-2012. BMC Infect Dis 2014; 14: 65. doi: 10.1186/1471-2334-14-65. 14. National Committee for Clinical Laboratory Standards Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically. 7th ed. Approved standard NCCLS M7-A7. 2006; National Committee for Clinical LaboratoryStandards, Wayne. 15. Sethi S, Golparian D, Bala Mi inni. Antimicrobial susceptibility and genetic characteristics of Neisseria gonorrhoeae isolates from India, Pakistan and Bhutan in 2007-2011.BMC Infect Dis 2013; 13:35. doi: 10.1186/1471-2334-13-35. 16. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MlCs and zone diameters. Version 4.0, 2014; http://www.eucast.org. 17. UeharaAA, Amorin EL, Ferreira Mde F i inni. Molecular characterization of quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates from Brazil. J Clin Microbiol 2011; 49: 4208-12. 18. Unemo M, Golparian D, Nicholas R i inni. High-level cefixime- and ceftriaxone-resistant N. gonorrhoeae in France: novel pena mosaic allele in a successful international clone causes treatment failure. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56: 1273-80. 19. Wang B, Xu JS, Wang CX i inni. Antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeae isolated in Jiangsu Province, China, with a focus on fluoroquinolone resistance. J Med Microbiol 2006; 55: 1251-5. 20. World Health Organization. Increases in fluoroquinolone resistant Neisseria gonorrhoeae among men who have sex with men-united States, 2003, and revised recommendations for gonorrhea treatment. Morb Mortal Wkly Rep 2004; 53: 335-8. 21. Xie GY. Ying CM, Zhou JH. Study on gene mutations of Neisseria gonorrhoeae resistant to fluoroquinolone. J Diagn Concepts Pract 2006; 5: 243-6. 22. Zhao LH, Zhao SP. Molecular basis of high-level ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae strains from Shandong Province, China. Braz J Microbiol 2013; 44: 273-6. Otrzymano:22 V112014n Adres Autora: 02-008 Warszawa, ul. Koszykowa 82A, Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny