Barbara Garczewska, Wanda Kamińska, Danuta Dzierżanowska

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 231-241 1 Barbara Garczewska, Wanda Kamińska, Danuta Dzierżanowska FENOTYPOWA I GENOTYPOWA CHARAKTERYSTYKA SZCZEPÓW CANDIDA ALBICANS IZOLOWANYCH OD PACJENTÓW HOSPITALIZOWANYCH W INSTYTUCIE POMNIK CENTRUM ZDROWIA DZIECKA Zakład Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej Instytutu Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. D. Dzierżanowska W pracy określono aktywność enzymatyczną, biotypy oraz genotypy 117 szczepów Candida albicans wyizolowanych od 51 pacjentów hospitalizowanych na dwóch oddziałach szpitalnych IP CZD w latach 2000-2005. Wykazano i potwierdzono różnice fenotypowe i genotypowe izolatów drożdżaków wyodrębnionych od dzieci z błon śluzowych oraz z zakażeniem grzybiczym. Drożdżaki z rodzaju Candida są jednym z najczęstszych patogenów odpowiedzialnych za szpitalne układowe bądź uogólnione zakażenia. Badania przeprowadzone w latach dziewięćdziesiątych wykazują, że 10% szpitalnych krwiopochodnych zakażeń było spowodowanych przez oportunistyczne drożdżaki z rodzaju Candida. Drożdżaki są czwartym co do częstości patogenem hodowanym z krwi w USA a ósmym w Europie (7). W ostatnich latach obserwuje się stały wzrost zakażeń grzybiczych o etiologii Candida u pacjentów na Oddziale Intensywnej Terapii (OIT) i oddziałach onkologicznych. Pacjenci na OIT leczeni metodami inwazyjnymi, tj. mechaniczną wentylacją, kaniulacją, tracheotomią u których stosowana jest agresywna antybiotykoterapia, narażeni są na powikłania w postaci ciężkich zakażeń (15, 16) Częstość infekcji grzybiczych występujących wśród pacjentów na OIT waha się w granicach od 10 do 17% (7, 16). U pacjentów z chorobami nowotworowym czynnikami sprzyjającymi rozwojowi grzybic są: niedobory odporności spowodowane chorobą podstawową i chemioterapią, której efektem jest neutropenia. Obecność grzybów w ontocenozie gardła i przewodu pokarmowego może prowadzić początkowo do grzybicy np. przełyku, a następnie do uogólnienia zakażenia. Krwiopochodny rozsiew drożdżaków prowadzi do rozwoju inwazyjnej kandydozy z zajęciem narządów wewnętrznych. Fungemia jest najcięższą postacią kliniczną inwazyjnego zakażenia grzybiczego. Szacuje się, iż częstość inwazji grzybiczej u chorych z grup ryzyka wynosi od 2-25% a śmiertelność w zakażeniach uogólnionych przebiegających z fungemią może dochodzić nawet do 80% (9, 11). 1 Praca wykonana w ramach projektu badawczego KBN nr 2 P05D03627

232 B. Garczewska, W. Kamińska, D. Dzierżanowska Nr 3 Większość zakażeń grzybiczych u chorych w grupach ryzyka wywoływanych jest przez grzyby oportunistyczne z rodzaju Candida i rzadziej przez grzyby pleśniowe. Zakażenia drożdżakami są najczęściej endogenne, spowodowane własną mikroflorą pacjenta. Wśród wielu gatunków drożdżaków izolowanych od hospitalizowanych chorych najliczniej występuje Candida albicans (7). Candida albicans jest fizjologiczną mikroflorą błon śluzowych noso-gardła, przewodu pokarmowego i skóry człowieka. Spośród wszystkich gatunków drożdżaków gatunek ten jest najbardziej inwazyjnym grzybem, charakteryzuje się najsilniejszymi właściwościami adhezyjnymi. Drożdżaki z gatunku Candida albicans nie zawsze wywołują infekcje. Do zakażenia dochodzi w wyniku zaburzenia równowagi pomiędzy drożdżakiem a gospodarzem. Drożdżaki z gatunku Candida albicans cechują się zmiennością fenotypową jak np. zróżnicowaną zdolnością syntezy enzymów odgrywających zasadniczą rolę w patogenezie zakażenia. Z uwagi na powszechne występowanie drożdżaków na błonach śluzowych podstawowym problemem klinicznym jest odróżnienie kolonizacji od zakażenia (18). Głównym celem pracy była charakterystyka fenotypowa i genotypowa szczepów Candida albicans odpowiedzialnych za kolonizację i zakażenia grzybicze u dzieci hospitalizowanych w Oddziale Intensywnej Terapii i Klinice Onkologii naszego szpitala. MATERIAŁ I METODY Przedmiot badań stanowiło 117 szczepów Candida albicans wyizolowanych z próbek różnego materiału klinicznego pobranego od 51 pacjentów z zakażeniem grzybiczym i kolonizacją błon śluzowych hospitalizowanych na dwóch oddziałach szpitalnych: tj. w Klinice Onkologii (26) oraz w Oddziale Intensywnej Terapii (25) Instytutu Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka w latach 2000-2005 (tab.i). Badania mikologiczne. Na podstawie obrazu klinicznego oraz współwystępowania czynników ryzyka tj. powikłań po chemioterapii, przewlekłej antybiotykoterapii, układowej kandydozy, pobierano od pacjentów próbki różnego materiału klinicznego do badań miko- Tabela I. Liczba izolatów C. albicans z materiałów klinicznych od pacjentów Kliniki Onkologii i Oddziału Intensywnej Terapii Oddział kliniczny/ liczba izolatów Krew Płyn móz-rdz. Płyn z jamy otrzewnej Wymazy z ran Aspirat tchawiczy BAL Mocz Cewnik centralny Wymazy z błon śluzowych Klinika Onkologii 21 1-4 2 1 4 1 21 n -55 Oddział Intensywnej Terapii 4-4 4 1 26 8 1 14 n- 62 Razem 25 1 4 8 3 27 12 2 35 n liczba izolatów

Nr 3 Feno- i genotypowa charakterystyka C.albicans 233 logicznych. Każdą próbkę posiewano na stałe podłoże Sabourauda i inkubowano w temp. 37ºC przez okres 5-10 dni. Izolowane szczepy drożdżaków identyfikowano do gatunku w oparciu o cechy biochemiczne za pomocą testu ID 32 C (biomerieux), wykorzystując ich zdolność do przyswajania węgla z różnych substratów. Badanie aktywności enzymatycznej. Ocenę aktywności enzymatycznej 117 szczepów Candida albicans. przeprowadzano przy użyciu testu API ZYM (firmy biomerieux). Paski API ZYM zawierają 19 substratów służących do identyfikacji 19 enzymów hydrolitycznych. Do badań używano zawiesiny komórek drożdżaków o gęstości 5-6 stopni w skali McFarlanda. Na pasek API ZYM nanoszono po 65 µl zawiesiny. Paski inkubowano w temp. 37ºC przez 4 godz. Po inkubacji dodawano po 1 kropli odczynnika ZYM A oraz ZYM B do miseczek i pozostawiano na 5 min. w temp. pokojowej. Odczytu dokonywano oceniając intensywność reakcji barwnej w 5 stopniowej skali barwnej od 0 do 5 ( 0 0 nmol, 1-5 nmol, 2-10 nmol, 3-20 nmol, 4-30 nmol, 5- > 40 nmol). Biotypowanie szczepów Candida albicans. Biotypowanie przeprowadzono na podstawie klasyfikacji Williamsona (20) zmodyfikowanej przez Kurnatowską i Kurnatowskiego (13) na podstawie aktywności 5 hydrolaz: esterazy (eii), arylamidazy walinowej (evi), fosfohydrolazy naftolowej (exi), α-glukozydazy (exv) i N-acetylo-β-glukozyloaminidazy (exvii) Typowanie genetyczne metodą RAPD. Hodowlę 24 godz. C. albicans wirowano w 3000 rpm. Uzyskany osad poddawano działaniu buforu litycznemu (50 mm Tris-HCl ph 7,5: 10 mm EDTA; 1% β-mercaptoethanol) z litykazą o stężeniu końcowym 1%. Badane próbki inkubowano w temp. 37ºC przez 60 min. DNA grzybicze ekstrahowano metodą fenolową. Stężenie DNA oceniano przez pomiar absorpcji roztworu DNA w spektrofotometrze DU (Beckman) przy długości fali λ 260 nm i 280 nm. Do typowania szczepów C.albicans techniką RAPD zastosowano starter 1290 o sekwencji nukleotydowej 5 - GTGGATACAA-3, przy użyciu którego uzyskano produkty w zakresie 100 pz 3000 pz. Reakcję prowadzono w buforze zawierającym 1x 10mM TrisHCl ph 8,3; 50mM KCl, 2,5 mm MgCl 2, dntp w stężeniu 250 mm każdego nukleotydu, starter w stężeniu 20 pm, 2 jednostki polimerazy Taq, MgCl 2 4-5 mm, oraz 70-80 ng DNA. Reakcję przeprowadzono w termocyklerze 2400 Perkin Elmer. Warunki reakcji: 42 cykle- denaturacja 94ºC - 30s, anneling 35 ºC - 30s, synteza nici 72ºC - 30s, końcowe wydłużanie 72 ºC - 5 min. Produkty amplifikacji poddawano rozdziałowi elektroforetycznemu w 2 % żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny, w buforze 1xTBE. Uzyskane wyniki odczytywano w świetle UV. Wielkości uzyskanych prążków porównywano z markerem wielkości 1 Kb DNA Ladder. Uzyskane wyniki opracowano w programie Molecular Analyst firmy BioRad. WYNIKI W tabeli II przedstawiono profile enzymów uwalnianych przez izolaty C. albicans uzyskane od 51 dzieci hospitalizowanych w OIT oraz Klinice Onkologii IP CZD w latach 2000-2005. Najwięcej izolatów drożdżaków wyodrębniono z próbek krwi- 25, Bal-u 27 oraz wymazów z błon śluzowych 35 (Tabela I). Spośród 117 szczepów drożdżaków, wyodrębnionych od pacjentów z dwóch oddziałów, 41 izolatów pochodziło od chorych

234 B. Garczewska, W. Kamińska, D. Dzierżanowska Nr 3 Tabela II Zestawienie enzymów hydrolitycznych uwalnianych przez szczepy Candida albicans izolowanych z błon śluzowych i innych materiałów klinicznych w poszczególnych Klinikach IP CZD Oddział szpitalny/ Liczba izolatów Klinika Onkologii (kolonizacja) n 21 n 34 (zakażenie grzybicze) Oddział Intensywnej Terapii (kolonizacja) n - 20 n 42 (zakażenie grzybicze) n liczba izolatów Numer enzymu I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX 0 21 21 21 0 18 21 16 0 0 19 21 0 0 9 4 10 7 3 0 0 34 34 34 0 34 34 17 0 0 34 34 0 0 3 8 11 16 14 6 0 18 20 20 0 18 20 5 0 0 20 20 0 0 9 11 10 13 2 5 0 42 42 42 0 42 42 15 0 0 42 42 0 0 7 35 6 21 12 8

Nr 3 Feno- i genotypowa charakterystyka C.albicans 235 u których stwierdzono kolonizację błon śluzowych C. albicans (41 z Kliniki Onkologii, 20 z Oddziału Intensywnej Terapii), natomiast 76 od dzieci leczonych z powodu zakażenia grzybiczego (34 Klinika Onkologii i 42 Oddział Intensywnej Terapii). Wszystkie 117 izolaty grzybów wydzielały 14 egzoenzymów spośród 19 badanych enzymów. Znacznie większa liczba izolatów drożdżaków odpowiedzialnych za zakażenia grzybicze uwalniała więcej enzymów proteolitycznych w porównaniu do szczepów wyodrębnionych z błon śluzowych przewodu pokarmowego i dróg oddechowych. Szczepy C. albicans odpowiadające za kolonizację i zakażenie grzybicze pochodzące z dwóch oddziałów szpitalnych w 100% wydzielały lipazę esterazową, arylamidazę walinową i fosfohydrolazę. Żaden z badanych szczepów nie wydzielał lipazy, trypsyny, chymotrypsyny, α-galaktozydazy i β- galaktozydazy. U chorych hospitalizowanych w Klinice Onkologii, u których stwierdzono kolonizację drożdżakami błony śluzowej, wyodrębnione izolaty w mniejszym stopniu uwalniały α-glukozydazę i N-acetylo-β-glukozaminidazę, zaś z Oddziału Intensywnej Terapii arylamidazę cystyny, α mannozydazę. oraz α fukozydazę. Ponadto w Klinice Onkologii wyizolowane szczepy C. albicans, kolonizujące błony śluzowe, jak i odpowiadające za zakażenia u dzieci, w takiej samej liczbie aktywowały arylamidazę cysteiny, natomiast w OIT fosfatazę zasadową i arylamidazę walinową. Analiza liczby enzymów wydzielanych przez poszczególne izolaty C. albicans wykazała, iż w OIT szczepy drożdżaków izolowane z błon śluzowych od dzieci uwalniały znacznie więcej α glukozydazy w porównaniu do izolatów grzybiczych odpowiadających za zakażenia grzybicze u chorych. Na podstawie oznaczonej aktywności enzymatycznej określono biotypy C. albicans występujące na dwóch oddziałach szpitalnych. Szczepy drożdżaków izolowane w Klinice Onkologii zakwalifikowano do 5 biotypów A, C, E, F, G i H natomiast w Oddziale Intensywnej Terapii do biotypów A, C, E, F, G. W Klinice Onkologii największy odsetek w grupie chorych z zakażeniem grzybiczym stanowił biotyp E (64,7%) i biotyp C (26,6%), a u dzieci skolonizowanych drożdżakami na błonach śluzowych dominował biotypy: E (28,6%), A (28,5%) oraz C (19,1%). Wśród szczepów wyodrębnionych od chorych hospitalizowanych w OIT z objawami kandydozy najliczniej występował biotyp E (71,7%). Pozostałe Tabela III Biotypy enzymatyczne szczepów C. albicans izolowanych w poszczególnych Klinikach IP CZD Biotyp Kolonizacja n - 21 Klinika Onkologii (n - 55) Zakażenie grzybicze n - 34 Oddział Intensywnej Terapii (n - 62) Zakażenie Kolonizacja grzybicze n - 20 n - 42 A 6 (28,5%) 2 (5,8%) 3 (15,0%) 1 (2,4%) C 4 (19,1%) 9 (26,6%) 7 (35,0% 5 (11,9%) E 6 (28,6%) 22 (64,7%) 2 (10,0%) 30 (71,4%) F 2 (9,5%) 1 (2,9%) 4 20,0%) 6 (14,3%) G 1 (4,8%) - 2 (10,0%) - H 2 (9,5%) - - - T - - 2 (10,0%) - n liczba izolatów

236 B. Garczewska, W. Kamińska, D. Dzierżanowska Nr 3 szczepy wyizolowane w tej grupie należały do biotypu F (14,3%) oraz biotypu C (11,9%). U chorych z kolonizacją błon śluzowych przewodu pokarmowego hospitalizowanych na OIT dominował biotyp C (35,5%), biotyp F (20,0%) oraz biotyp A (15%). Przeprowadzono analizę genetyczną wzorów RAPD wszystkich badanych izolatów C. albicans odpowiedzialnych za kolonizacje i za układowe zakażenie grzybicze. Typowanie genetyczne wykazało znaczny polimorfizm wśród szczepów Candida albicans. Wśród izolatów drożdżaków pochodzących od pacjentów z chorobą nowotworową hospitalizowanych w Klinice Onkologii wykazano obecność 23 wzorów prążków (genotypów) zaś w Oddziale Intensywnej Terapii 28 wzorów. Największe zróżnicowanie genetyczne zaobserwowano wśród szczepów odpowiedzialnych za kolonizację chorych hospitalizowanych w obu Klinikach naszego szpitala (13 Klinika Onkologii i 15 w OIT). Analiza genotypowa uzyskanych wzorów RAPD potwierdziła endogenny charakter większości zakażeń występujących na tym oddziale. Od 14 pacjentów wyodrębniono 14 różnych klonów C. albicans odpowiedzialnych za zakażenia grzybicze pacjentów z chorobą nowotworową (ryc. 1 C. albicans- 7 klonów). Szczepy klonalne izolowane z różnych materiałów klinicznych pobranych od tych samych pacjentów miały te same wzory prążków, natomiast różniły się genetycznie od szczepów izolowanych od innych chorych. U 2 pacjentów Kliniki Onkologii (GA, MN) występował ten sam klon grzybiczy, co świadczy o krzyżowym przeniesieniu szczepów pomiędzy pacjentami i możliwości wystąpienia zakażenia egzogennego (ryc. 1 - ścieżka 14-15 i 16-18). W Oddziale Intensywnej Terapii typowanie genetyczne 62 szczepów C. albicans potwierdziło obecność 10 klonów wyizolowanych od 10 pacjentów (ryc. 2 szczepy C.albicans 5 klonów). Wśród szczepów wyodrębnionych od pacjentów z OIT analiza genetyczna prążków również potwierdziła endogenny charakter zakażeń, o czym świadczy identyczność szczepów kolonizujących błony śluzowe przewodu pokarmowego i górnych M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 17 18M M 19 202122232425 2627282930313233 M Ryc. 1 Typowanie genetyczne szczepów C. albicans techniką RAPD z zastosowaniem startera 1290. W - wzorzec wielkości 1 kb Ladder (Fermentas) Ścieżki 1-33 DNA C. albicans wyizolowanych od pacjentów Kliniki Onkologii: Ścieżka 1 - klon A, ścieżka 2,3 - klon B, ścieżka 4 - klon C, ścieżka 5-7, 9, 10-11, 14-18 - klon D, ścieżka 8 - klon E, ścieżka 12 klon F, ścieżka 13 - klon G

Nr 3 Feno- i genotypowa charakterystyka C.albicans 237 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M M 14 15 16 1718192021 222324 25 262728 2930 31 M Ryc. 2 Typowanie genetyczne szczepów C. albicans techniką RAPD z zastosowaniem startera 1290. W - wzorzec wielkości 1 kb Ladder (Fermentas) Ścieżki 1-31 C. albicans wyizolowanych od pacjentów Oddziału Intensywnej Terapii: Ścieżka 1 - klon A, ścieżka 2 - klon B, ścieżka 3,5,8 - klon C, ścieżka 4,6,9,10,12 - klon D, ścieżka 7,11 - klon E Tabela IV Liczba profili RAPD dla szczepów C. albicans izolowanych w poszczególnych Klinikach IP CZD Kolonizacja n - 21 n- liczba izolatów Klinika Onkologii n - 55 Zakażenie grzybicze n - 34 dróg oddechowych tego samego chorego oraz szczepów odpowiedzialnych za zakażenia grzybicze. (ryc 2 Pacjent MK ścieżka 20-30) DYSKUSJA Oddział Intensywnej Terapii n - 62 Kolonizacja n - 20 Zakażenie grzybicze n - 42 13 10 15 13 W Oddziałach Intensywnej Terapii oraz na oddziałach onkologicznych obserwowane są dość często zakażenia grzybicze o etiologii Candida albicans. Jest to uwarunkowane obecnością wielu czynników ryzyka predysponujących pacjentów do zakażenia grzybiczego, głównie chorobą podstawową jak również ciężkim stanem klinicznym hospitalizowanych pacjentów (11, 18). W patogenezie zakażenia grzybiczego istotną rolą odgrywa zjawisko występowania (kolonizacja) drożdżaków na błonach śluzowych. U pacjentów z zaburzeniami mechanizmów odporności występuje niekontrolowane namnażanie grzybów na powierzchni nabłonków, które może prowadzić do rozwoju rozsianej krwiopochodnej kandydozy u chorych. Odkryto wiele mechanizmów i czynników wirulencji grzybów, decydujących i warunkujących ich patogenność. Do najważniejszych należą: zdolność przylegania, zmiana fenotypu kolonii, przejście od stadium blastospory do stadium strzępek oraz produkcja enzymów hydrolitycznych (2, 3). Wytwarzane przez Candida enzymy hydrolityczne ułatwiają adherencję i inwazję komórek grzybów do tkanek. Esterazy, lipazy, fosfatazy są szczególnie ważne w pierwszej linii

238 B. Garczewska, W. Kamińska, D. Dzierżanowska Nr 3 zakażenia, ponieważ umożliwiają komórkom grzybów dostarczenie węgla niezbędnego do procesów życiowych i rozwoju infekcji (2, 3). Enzym N-acetylo-β-glukozaminidaza oraz α-mannozydaza hamują migrację neutrofili do ognisk zapalnych, przez co znacząco wpływają na immunologiczną odpowiedź gospodarza. Ponadto enzymy hydrolityczne pozwalają grzybom przetrwać w różnych środowiskach i niszach ekologicznych (2). Badania aktywności 117 izolatów C. albicans odpowiedzialnych za zakażenia grzybicze i kolonizację pacjentów hospitalizowanych na dwóch oddziałach klinicznych potwierdziły znacznie wyższą aktywność hydrolityczną szczepów C. albicans wyizolowanych od chorych z rozwiniętą kandydozą niż szczepów C. albicans powodujących tylko kolonizację błon śluzowych przewodu pokarmowego i górnych dróg oddechowych. Obserwacje te wskazują, że szczepy powodujące zakażenia są metabolicznie bardziej aktywne od szczepów odpowiedzialnych za kolonizację. Izolaty grzybicze wyodrębnione w obu badanych grup pacjentów charakteryzowały się taką sama ilością uwalnianych enzymów w 14 spośród 19 oznaczonych. W badaniach Batura-Gabryel i wsp. (4) analizowano 58 szczeów Candida wyizolowanych od pacjentów z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc i rakiem płuca, u których zdiagnozowano grzybicę jamy ustnej, drożdżaki wykazywały aktywność 18 spośród 19 hydrolaz. Badacze stwierdzili najsilniejszą aktywność czterech enzymów tj. esterazy, lipazy, arylamidazy leucynowej oraz β-glukuronidazy. Enzymy te odpowiadają za szereg procesów zachodzących podczas rozwoju grzybiczego procesu zapalnego w tkankach i rozwoju układowej kandydozy. Ponadto autorzy w swoich badaniach stwierdzili znacznie większą zdolność wydzielania lipazy esterazowej w szczepach pochodzących od chorych z POCHP niż w przypadku chorych na raka płuc (4). W opisanych wyżej badaniach przeprowadzonych u chorych z rakiem płuc aktywność lipazy wykazano u 48,4 % wyizolowanych szczepów C. albicans (4). W Klinice Onkologii oraz OIT wszystkie szczepy C. albicans izolowane od pacjentów z rozwiniętą kandydozą cechowała większa aktywność enzymatyczna dla izolatów wyodrębnionych z krwi, płynu mózgowo rdzeniowego czy BAL-u.. Większość izolatów uwalniała fosfatazę kwaśną, lipazę esterazową, arylamidazę leucytowa i arylamidazę walinową. N- acetylo-β-glukozaminidazę uwalniały tylko nieliczne izolaty drożdżaków. Ten ostatni enzym osłabia aktywność granulocytów obojętnochłonnych co wpływa na zaburzenie mechanizmów obronnych gospodarza (2, 6). Tylko w pojedynczych przypadkach stwierdzono uwalnianie przez niektóre szczepy drożdżaków β-glukuronidazy, co potwierdzone zostało w badaniach innych autorów (2, 4, 14). Porównując aktywność szczepów C. albicans odpowiedzialnych za kolonizację błon śluzowych wykazano, iż znacznie mniejsza liczba badanych szczepów grzybów uwalniała enzymy hydrolityczne. Białasiewicz i Kurnatowska (8) badali aktywność izolatów C. albicans wyizolowanych od pacjentów z ontocenozy jamy ustnej. Autorzy ci wykazali największą aktywność dla fosfatazy kwaśnej i fosfohydrolazy naftylo-as-bi w badanych szczepach. Fosfatazy uwalniane przez szczepy C. albicans wspomagają adherencję komórek grzybów do komórek nabłonkowych gospodarza (13). Badane przez nas szczepy charakteryzowały się największą aktywnością dla fosfatazy kwaśnej. Podobnie jak w innych pracach prowadzonych przez wielu autorów, nasze izolaty drożdżaków odpowiadające za kolonizacje błon śluzowych nie uwalniały trypsyny ani chymotrypsyny (4, 8). Wyodrębnione przez nas drożdżaki C. albicans w 98% należały do 6 biotypów wg klasyfikacji Williamsona. W badaniu Krajewskiej-Kułak aż 82,3 % szczepów C. albicans

Nr 3 Feno- i genotypowa charakterystyka C.albicans 239 wyizolowanych z jamy ustnej pacjentów z chorobami nowotworowymi należało do określonego biotypu (A,B,C,E,F,G,H) wg klasyfikacji Williamsona (21). W badaniach Kurnatowskiej i Kurnatowskiego (13) 148 szczepów C. albicans wyodrębnionych z błon śluzowych, w 60 % można było określić biotyp na podstawie klasyfikacji biotypów wg Williamsona. Na podstawie zdolności uwalniania enzymów hydrolitycznych autorzy stwierdzili 12 biotypów charakterystycznych dla C. albicans. Większość należała do biotypów F (28,7%), a w mniejszym stopniu do A (23,7%), E (18,9%) oraz C (10,2%). Należy podkreślić, iż żaden z badanych izolatów drożdżaków nie wykazywał cech biotypu B, D, H opisanych przez Williamsona (21). W przeprowadzonym przez nas badaniu 117 izolatów C. albicans wyodrębniono 6 biotypów (A,C,E,F,G,H,) zakwalifikowanych na podstawie wydzielanych enzymów hydrolitycznych do klasyfikacji Williamsona. Wśród dzieci hospitalizowanych w Klinice Onkologii i OIT z rozpoznanym zakażeniem grzybiczym dominował biotyp E (64,7% i 71,4%). Niewielki odsetek stanowiły biotypy A, C, F. Wśród szczepów odpowiedzialnych za kolonizacje błon śluzowych na OIT dominował biotyp C zaś w Klinice Onkologii A i E. Należy zaznaczyć, iż w naszym badaniu 117 izolatów nie stwierdzono występowania biotypów B i D. Również żadnego badanego przez nas szczepu grzybów nie można było przyporządkować do określonego biotypu w klasyfikacji Krajewskiej-Kułak i Batury-Gabryel (5, 12) W wewnątrzgatunkowym różnicowaniu grzybów stosowane są metody biologii molekularnej, które umożliwiają porównywanie pokrewieństwa szczepów. W badaniach naszych zastosowano metodę RAPD, z powodzeniem stosowaną przez wielu badaczy w badaniach nad epidemiologią szpitalnych zakażeń grzybiczych (1, 6, 10, 17, 19). Wyniki badań własnych potwierdzają znaczny polimorfizm szczepów C. albicans odpowiedzialnych za kolonizację i zakażenia grzybicze na dwóch oddziałach szpitalnych. Gyanchandani i wsp. (10) przeprowadzili analizę genetyczną 19 szczepów C. albicans pochodzących od pacjentów z chorobą nowotworową. Wśród badanych izolatów nie wykazali obecności dwóch takich samych profili RAPD C. albicans. Vironi i wsp (19) analizowali 17 szczepów drożdżaków odpowiedzialnych za układowe infekcje grzybicze na OIT. Wykazali jednakowe pochodzenie szczepów zakażających i kolonizujących pacjentów. C. albicans jest częstym komensalem przewodu pokarmowego i jednym z drobnoustrojów fizjologicznej flory jamy ustnej i gardła. Stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum prowadzi do eradykacji endogennej mikroflory bakteryjnej i tym samym ułatwia nadmierny wzrost drożdżaków Wyniki te są zbieżne z naszą genotypową analizą szczepów odpowiedzialnych za zakażenia w IP CZD. Porównanie genotypów izolatów C. albicans wykazuje identyczność szczepów wyhodowanych z różnych materiałów klinicznych (ryc. 2 MK ścieżka 20-31 gardło-bal-mocz-krew). Ponadto wyniki naszych badań wykazały klonalny charakter zakażeń grzybiczych występujących wśród chorych hospitalizowanych na dwóch oddziałach szpitalnych. Na uwagę zasługuje fakt, iż w Klinice Onkologii analiza wzorów profili RAPD wykazała obecność 2 takich samych klonów drożdżaków u różnych pacjentów hospitalizowanych w tym samym czasie na oddziale Onkologii co może sugerować o możliwości przeniesienia klonu między pacjentami przez personel medyczny (ryc. 1 GA, MN - ścieżka 14-15 i 16-18).

240 B. Garczewska, W. Kamińska, D. Dzierżanowska Nr 3 WNIOSKI Określenie biotypu pozwala na stwierdzenie częstego występowania cech charakteryzujących zjadliwość izolatów wyodrębnionych od pacjentów zakażonych w porównaniu do skolonizowanych. Wykazano, że zakażenia C. albicans w szpitalu na przykładzie Kliniki Onkologii (GA, MN) mogą szerzyć się krzyżowo. B. Garczewska, W.Kamińska, D. Dzierżanowska PHENOTYPE AND GENOTYPE CHARACTERIZATION OF CANDIDA ALBICANS STRAINS ISOLATED FROM PATIENTS HOSPITALIZED AT THE CHILDREN S MEMORIAL HEALTH INSTITUTE SUMMARY Phenotype and genotype analysis was prepared from Candida strains causing colonization and fungal infections in children hospitalized at The Children s Memorial Health Institute intensive care unit and oncology unit. We totally analyzed 117 C. albicans strains cultured from different clinical specimens received from 51 patients oncology unit (26) and intensive care unit (25). Enzymatic activity was assessed by API ZYM biomerieux. Strains were biotyped according to Williamson, Kurnatowska and Kurnatowski classification. Candida albicans isolates were RAPD typed. C. albicans strains causing colonization and fungal infections on those units released such enzymes like esterase lipasis, waline arylamidasis and phosphohydrolasis. The most frequent biotypes in group of patients oncological unit with fungal infections were biotype E (64,7%) and biotype C (26,6%) while in group of patients with colonized mucosa dominated biotypes: E (28,6%) and A (28,5%). Comparing with intensive care unit group patients, the most frequent biotype isolated among patients with fungal infection symptoms was biotype E (71,7%), while in mucosa colonization group C (35,5%) occurred as a dominating biotype. This study demonstrated clonal character of fungal infections among patients hospitalized in two units and considerable polymorphism among yeast strains: 23 pattern stripes in oncology unit and 28 pattern stripes in intensive care unit. What is more, yeast biotype determination allows showing frequent occurrence of virulence character of isolates received from infected patients in comparison with those received from colonized patients. PIŚMIENNICTWO 1. Bartie K, Williams DW, Wlison MJ i inni. PCR Fingerprinting of Candida albicans Associated with Chronic Hyperplastic Candidosis and Other Oral Conditions. J Clin Microb 2001; 39: 4066-75. 2. Batura-Gabryel H. Wieloogniskowe występowanie i aktywność hydrolityczna grzybów z rodzaju Candida wyizolowanych od chorych na raka płuca. Wiad Paraz 2001; 47: 622-8. 3. Batura-Gabryel H, Brajer B, Kuźnar B i inni. Czy aktywność hydrolityczna grzybów z rodzaju Candida wyizolowanych od chorych z przewlekłą obturacyjną chorobę płucną (POCHP) może zmienić się z postępem choroby podstawowej? Postępy Derm i Alerg 2003; 3:148-55. 4. Batura-Gabryel H, Młynarczyk W. Aktywność hydrolityczna grzybów z rodzaju Candida i występowanie grzybicy jamy ustnej u chorych na raka płuca i przewlekłą obturacyjną chorobę płuc. Mik Lek 2000; 7: 77-82.

Nr 3 Feno- i genotypowa charakterystyka C.albicans 241 5. Batura-Gabryel H. Wieloogniskowe występowanie grzybów z rodzaju Candida u chorych na POChP a ich aktywność hydrolityczna. Mikol Lek 2002; 9: 13-6. 6. Bautista-Munoz C, Boldo XM, Villa-Tanaca L i inni. Identificationn of Candida spp. by randomly amplifird polymorphic DNA analysis and differentiation between Candida albicans and Candida dubliniensis by direct PCR methods. J Clin Microbiol, 2003; 41: 414-20. 7. Beck-Sague C, Jarvis WR. Secular trends in the epidemiology of nosocomial fungal infections in the United States, 1980-1990. National Nosocomial Infections Surveillance System. J Infect Dis 1993; 167: 1247-51. 8. Białasiewicz D, Kurnatowska AJ. Aktywność wybranych enzymów hydrolitycznych Candida albicans szczepów wyizolowanych z ontocenozy jamy ustnej. Mik Lek 1996; 3: 249-52. 9. Diekema DJ, Messer SA, Brueggermann AB i inni. Epidemiology of candidemia: 3 year results from the emerging infections and the epidemiology of Iowa organisms study. J Clin Microbiol. 2002; 40:1298-02. 10. Gyanchandani A, Khan ZK, Farooqui N i inni. RAPD analysis of C. albicans strains recovered from different immunocompromised patients (ICP) reveals an apparently non-random infectivity of the strains. Biochem Mol Biol Int 1998; 44: 19-27. 11. Hobson RP. The global epidemiology of invasive Candida infections-is the tide turning? J Hosp Infect 2003; 55: 159-68. 12. Krajewska-Kułak E, Niczyporuk W, Łukaszuk C i inni. Biotypy enzymatyczne a wrażliwość na leki przeciwgrzybiczne szczepów Candida albicans izolowanych z ontocenozy jamy ustnej pacjentów ze schorzeniami nowotworowymi. Mik Lek 2000;7:27-34. 13. Kurnatowska A, Kurnatowski P. Biotypes of fungi isolated from patiens with oral cavity diseases. Mik Lek 1998; 5: 215-7. 14. Kwaśniewska J, Loga G, Woźniacka A i inni. Grzyby u pacjentów z chorobami pęcherzowymi i tkanki łącznej-aktywność wybranych hydrolaz w szczepach Candida albicans. Mik Lek 2001; 8: 85-90. 15. Maschmeyer G, Ruhnke M. Update on antifungal treatment of invasive Candida and Aspergillus infections. Mycoses 2004; 47: 263-76. 16. Schelenz S: Management of candidiasis in the intensive care unit. J Antimicrob Chemother 2008; 61: Suppl. 1 i31-i34. 17. Tamura M, Watanabe K, Mikami Y i inni. Molecular characterization of new clinical isolates of Candida albicans and Candida dubliniensis in Japan analysis reveals a new genotype of C. albicans with group i intron. J Clin Microbiol. 2001; 39: 4309-19. 18. Vincent J, Bihari DJ, Suter PM i inni. The prevalence of nosocomial infection In intensiva care units in Europe. Results of the European Prevelence of Infection in Intensive Care (EPIC) Study EPIC International Advisory Cornittee. Jama 1995; 274: 639-44. 19. Vironi G, Matsiota-Bernard P. Molecular Typing of Candida isolates from Patients Hospitalized In an Intensive Care Unit. J Infect. 2001; 42: 50-4. 20. Williamson MJ, Samaranayake L, Macfarlane TW. Biotypes of oral Candida albicans and Candida tropicalis isolates. J Medicine and Veterinary Myc 1986; 24: 81-34. Otrzymano: 1 IX 2008 r. Adres Autora: 04-730 Warszawa, Aleja Dzieci Polskich 20, Zakład Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej Instytutu Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka