POLITECHNIKA WARSZAWSKA

POLITECHNIKA WARSZAWSKA WYDZIAŁ INŻYNIERII MATERIAŁOWEJ PRACA DYPLOMOWA INŻYNIERSKA Karolina Korzeb Wytworzenie, ocena właściwości mechanicznych i profilu degradacji kompozytów polimerowo-ceramicznych. Fabrication and evaluation of mechanical properties and degradation profile of polymer-ceramic composites. Nr albumu: 227308 Promotor: dr hab. inż. Wojciech Święszkowski Warszawa, styczeń 2013

Praca realizowana w ramach projektu Bioimplanty dla potrzeb leczenia ubytków tkanki kostnej u chorych onkologicznie finansowanego z Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka. 2

Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Szanownemu Panu dr hab. inż. Wojciechowi Święszkowskiemu, Rodzicom oraz wszystkim osobom, którzy służąc swoją pomocą i radami przyczynili się do powstania niniejszej pracy. 3

Streszczenie: Celem poniższej pracy była ocena właściwości mechanicznych i profilu degradacji kompozytów polimerowo-ceramicznych. Materiały kompozytowe przygotowano metodą odlewania z roztworu. Włókna i trójwymiarowe rusztowania wytworzono za pomocą techniki szybkiego prototypowania. Badania przeprowadzono w trzech etapach. Etap pierwszy miał na celu określenie wpływu rozmiaru cząstek napełniacza na właściwości mechaniczne kompozytów. W tym celu wytworzono kompozyty podwójne zawierające mikroi nanocząstki trójfosforanu wapnia (β-tcp). Włókna poddano statycznej próbie rozciągania. Otrzymane wyniki odniesiono do materiału referencyjnego jakim był czysty polikaprolakton (PCL). Na podstawie otrzymanych wyników do dalszych badań wybrano mikrocząstki TCP. W drugim etapie wytworzono kompozyt trójskładnikowy zawierający dodatkowo 20% wag. poli(d,l-laktydu-ko-glikolidu) (PLGA). Kolejno zbadano wpływ obecności drugiego polimeru na właściwości mechaniczne kompozytów potrójnych. Trzecim etapem badań było wytworzenie z powyższych kompozytów dwu- i trójskładnikowych rusztowań stosowanych do regeneracji ubytków tkanki kostnej w organizmie człowieka oraz przeprowadzenie 5-miesięcznej degradacji rusztowań w roztworze soli fizjologicnej (PBS). Dokonano oceny profilu degradacji rusztowań poprzez obserwację zmian morfologii powierzchni (skaningowa mikroskopia elektronowa, SEM), adsorpcji wody i zmian masy rusztowań (waga analityczna), zawartości fazy krystalicznej (skaningowa kalorymetria różnicowa, DSC), zmian średniej masy cząsteczkowej (chromatografia żelowa, GPC) oraz zmian ph PBS (ph-metr). Podsumowując, mikrocząstki TCP okazały się mieć korzystniejszy wpływ na właściwości mechaniczne kompozytów o osnowie PCL. Faza PLGA dodatkowo zwiększyła parametry wytrzymałościowe i przyspieszyła szybkość degradacji badanych materiałów. Słowa kluczowe: polikaprolakton (PCL), trójfosforan wapnia, poli(d,l-laktyd-ko-glikolid) (PLGA), metoda szybkiego prototypowania, inżynieria tkankowa, rusztowanie biodegradowalne. 4

Abstract: The aim of this study was to evaluate the mechanical properties and degradation profile of polymer-ceramic binary and ternary composites. Poly(ε-caprolactone), PCL, was used as a polymer matrix and tricalcium phosphate (β-tcp) particles of various size (nanoand microparticles) were used as the ceramic filler. Additionally, poly(d,l-lactide-co-glycolide) was used for the ternary composites. The test materials were prepared by combined solvent casting technique and rapid prototyping method and tested in three stages. In the first stage of the study an effect of size of filler particles on mechanical properties of the binary composite was investigated. In order to evaluate the effect, a static tensile test was carried out on binary composites containing nano- and micro-tcp. The results were compared to the reference material which was neat PCL. Based on the results of the tensile test the TCP microparticles were selected to produce a ternary composites, which contained 20 wt.% of PLGA (second stage). Then, the effect of addition of the PLGA on the tensile properties of ternary composite was determined. In the third stage of this study three dimensional scaffolds were fabricated from binary and ternary composites and exposed to 5-month degradation in phosphate buffered saline (PBS). Profile of the degradation was evaluated by investigation of changes of surface morphology of the scaffolds (scanning electron microscopy, SEM), changes in absorption of water and mass of scaffolds (analytical balance), changes in the crystallinity of the materials (differential scanning calorimetry, DSC), changes in the average molecular weight (gel chromatography, GPC) change in ph of the PBS (ph-meter). To summarize, microparticles had better effect on mechanical properties of PCL-based composites. PLGA further increased stiffness and strength and accelerated the rate of degradation of the tested material. Key words: poly(ε-caprolactone), calcium triphosphate (TCP), poli(d,l-lactide-co-glicolide), rapid prototyping, tissue engineering, biodegradable scaffold. 5

Spis treści 1. Wstęp... 8 2. Biomateriały... 9 2.1. Polikaprolakton... 9 2.2. Poli(d,l-laktyd-ko-glikolid)... 10 2.3. Trójfosforan wapnia... 11 2.4. Kompozyty polimerowo-ceramiczne w zastosowaniach medycznych... 12 3. Kośd... 14 4. Inżynieria tkankowa... 16 5. Rusztowania do regeneracji tkanki kostnej... 19 5.1. Techniki szybkiego prototypowania... 20 6. Cel i zakres pracy... 22 7. Materiały i metodyka badao... 23 7.1. Materiały... 23 7.1.1. PCL... 23 7.1.2. PLGA... 23 7.1.3. TCP... 23 7.2. Wytwarzanie kompozytów... 24 7.3. Wytwarzanie włókien oraz trójwymiarowych rusztowao... 25 7.3.1. Wytwarzanie włókien... 26 7.3.2. Wytwarzanie trójwymiarowych rusztowao... 28 7.4. Metody badao wytworzonych materiałów... 28 7.4.1. Statyczna próba rozciągania... 32 7.4.2. Badanie degradacji... 33 7.4.2.1. Zmiany ph roztworu... 35 7.4.2.2. Absorpcja wody i zmiany masy... 36 7.4.3. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)... 37 7.4.4. Chromatografia żelowa (GPC)... 38 7.4.5. Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC)... 40 8. Wyniki badao i ich dyskusja... 42 8.1. Wybór napełniacza do kompozytu trójskładnikowego... 42 8.1.1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)... 42 8.1.1. Statyczna próba rozciągania... 44 6

8.2. Charakteryzacja włókien z kompozytów trójskładnikowych... 48 8.2.1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)... 48 8.2.2. Statyczna próba rozciągania... 50 8.3. Profil degradacji osnowy wytworzonych rusztowao kostnych... 52 8.3.1. Absorpcja wody i zmiany masy... 52 8.3.2. Zmiany ph roztworu... 54 8.3.3. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)... 55 8.3.4. Chromatografia żelowa (GPC)... 59 8.3.5. Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC)... 60 9. Podsumowanie... 62 10. Wnioski... 65 Literatura... 66 7

1. Wstęp Współczesny świat zmaga się z problemem chorób nowotworowych. Według danych Departamentu Badań Demograficznych Głównego Urzędu Statystycznego z dnia 28 stycznia 2011 roku liczba zgonów spowodowanych chorobami nowotworowymi wciąż rośnie i w 2009 roku stanowiła 24% ogółu wszystkich zgonów. Jednym z przypadków chorób nowotworowych są nowotwory występujące w układzie kostnym człowieka. Naruszają one strukturę tkanek i prowadzą do powstania ubytków kostnych u pacjentów. Na rysunku 1 po lewej przedstawiono zdrową strukturę kości, a po prawej ognisko ubytku kostnego. a) b) Rys.1. (a) Zdrowa struktura kostna; (b) ognisko ubytku kostnego [1]. Dla pacjentów ze stwierdzoną resekcją zmienionej nowotworowo tkanki, szansę wyleczenia stwarza inżynieria tkankowa. Zajmuje się ona regeneracją i naprawą uszkodzonych oraz całkowicie zniszczonych tkanek. Poprzez zastosowanie działań inżynierii tkankowej u chorego pacjenta następuje przywrócenie zdrowej tkanki [2]. Ubytki kostne mogą być zastąpione rusztowaniami kostnymi (z ang. scaffolds). Rusztowania te powinny być wykonane z materiałów funkcjonalnych. Mają stanowić podłoże do rozmnażania tkanek i zastępować miazgę kostną. Powinny być również porowate w celu umożliwienia dyfuzji płynów ustrojowych [2,3]. Rusztowania kostne zazwyczaj należałoby wytwarzać z materiałów bioresorbowalnych. W miarę upływu czasu pożądane byłoby, aby ulegały samoistnej degradacji. Produktami degradacji powinny być nieszkodliwe produkty uboczne naturalnie występujące w organizmie człowieka [2]. W poniższej pracy przedstawiono właściwości mechaniczne włókien kompozytowych o osnowie poli(ε-kaprolaktonu) oraz profil degradacji trójwymiarowych rusztowań kompozytowych wytworzonych za pomocą techniki szybkiego prototypowania, w celu doboru najlepszych materiałów do aplikacji medycznych. 8

2. Biomateriały Biomateriały to grupa materiałów o różnorodnym składzie, budowie i właściwościach, akceptowalna przez organizm ludzki lub trwale łącząca się z żywą tkanką i biorąca udział w jej regeneracji [4]. Jedną z klasyfikacji biomateriałów jest podział ze względu na ich reakcję w organizmie człowieka: a) materiały obojętne nie wywołują reakcji otaczającej tkanki lub wywołana reakcja jest niewielka; b) materiały aktywne wiążą się z otaczającą tkanką, a następnie stymulują rozwój zregenerowanego organu; c) materiały resorbowalne ulegają rozkładowi w środowisku organizmu ludzkiego, rozpuszczając się w otaczającej tkance po określonym czasie, a następnie zostają przez nią wchłonięte; Biomateriały należące do grup materiałów obojętnych to głównie metale i ceramiki, np. stale austenityczne, stopy na osnowie kobaltu, tytan i jego stopy, tantal i materiały z pamięcią kształtu [4, 5, 6]. Do materiałów aktywnych w szczególności zaliczamy ceramiki, np. hydroksyapatyt, bioszkła oraz ceramiki na bazie fosforanów wapnia. Posiadają one podobny skład chemiczny do ludzkiej kości. β-trójfosforan wapnia jest wchłaniany przez komórki uczestniczące w ciągłej przebudowie ludzkiej kości, czyli osteoklasty [4, 5]. Natomiast grupę materiałów resorbowalnych reprezentują odpowiednie gatunki polimerów [4]. Możemy je podzielić na polimery naturalne i syntetyczne. Polimery te zazwyczaj są degradowane w wyniku reakcji hydrolizy. Polimery naturalne, takie jak kolagen, ulegają procesowi hydrolizy katalizowanej przez enzymy. Polimery syntetyczne posiadają w swojej budowie grupy funkcyjne podatne do hydrolizy, np. grupy estrowe lub uretanowe. Przykładami takich polimerów są poliestry, poliuretany, poliortoestry, polibezwodniki, czy też pseudopoliaminokwasy [4, 5, 7]. 2.1. Polikaprolakton Poli(ε-kaprolakton), PCL, to semikrystaliczny, hydrofobowy poliester alifatyczny (rys.2), który jest łatwy do przetwarzania. Charakteryzuję się niską temperaturą zeszklenia, 9

T g (-60⁰C) i niską temperaturą topnienia, T m (59-64⁰C). Jest biozgodny oraz biodegradowalny [8]. Rys.2. Wzór strukturalny polikaprolaktonu. PCL łatwo rozpuszcza się w chloroformie, dichlorometanie, benzenie oraz toluenie w temperaturze pokojowej. Posiada niską rozpuszczalność w acetonie. Nie rozpuszcza się w alkoholu i eterze naftowym [9]. Charakteryzuje się niską wytrzymałością na rozciąganie (ok. 23 MPa) przy ogromnej wartości wydłużenia przy zerwaniu (4700%) [10]. Całkowita degradacja PCL trwa od 2 do 4 lat. Czas degradacji zależy między innymi od początkowej masy cząsteczkowej polimeru i jego zwilżalności. Materiały hydrofobowe ulegają wolniejszej degradacji niż materiały hydrofilowe. PCL w obecności wody ulega hydrolizie do kwasu i zostaje usunięty z organizmu człowieka w cyklu Krebsa [8]. 2.2. Poli(d,l-laktyd-ko-glikolid) Poli(d,l-laktyd-ko-glikolid) (PLGA) to kopolimer biodegradowalny (rys.3). Pochodzi z grupy poliestrów. Komórki wykazują dobrą przyczepność do jego cząstek [7]. Rys.3. Wzór strukturalny poli(d,l-laktydu-ko-glikolidu). PLGA składa się z cząsteczek kwasu glikolowego (GA) i kwasu mlekowego (LA) ((L)- lub (D,L)-laktyd). PLGA jest amorficzny przy zawartości od 25% do 75% (L)- i (D,L)-laktydu. Podobnie jak PCL ulega degradacji w wyniku hydrolizy wiązań estrowych. Szybkość degradacji PLGA zależy m.in. od masy cząsteczkowej i stosunku molowego LA:GA. W przypadku stosunku 50:50 degradacja trwa od 1 do 2 miesięcy, a gdy stosunek molowy 10

LA:GA wynosi 75:25 degradacja wydłuża się od 4 do 5 miesięcy. Natomiast materiał składający się z 85% DL-laktydu i 15% glikolidu ulega degradacji w czasie od 5 do 6 miesięcy [7]. 2.3. Trójfosforan wapnia Trójfosforan wapnia (TCP) jest solą kwasu ortofosforowego H 3 PO 4. Pochodzi z układu równowagi CaO-P 2 O 5, w którym występują m.in. cztery związki znajdujące się w obszarze zainteresowań biomedycyny (rys.4). Jednym z nich jest ortofosforan (V) wapnia o oznaczeniu skrótowym TCP (z ang. Tri-Calcium-Phosphate) lub C 3 P, nazwie mineralogicznej whitlockit, wzorze chemicznym Ca 3 (PO 4 ) 2 i składzie tlenowym 3CaO P 2 O 5 [6]. Rys.4 Układ równowagi CaO-P 2 O 5 [6]. 11

TCP jest ceramiką występującą w dwóch odmianach polimorficznych: αtcp jest odmianą wysokotemperaturową, charakteryzującą się dużo większą szybkością rozpuszczania. Trwała do 1430⁰C, gdzie przechodzi w α TCP i w temperaturze 1777⁰C ulega stopieniu. βtcp to odmiana niskotemperaturowa o mniejszej niż αtcp szybkości rozpuszczania. Jest trwała do 1125⁰C [6]. TCP cechuje się wysoką biozgodnością. Produkty jego degradacji mogą uczestniczyć w procesie przebudowy nowej kości. Syntetyczny βtcp składa się w 54,3% mas. z CaO i 45,7% mas. z P 2 O 5. Stosunek molowy Ca/P w TCP wynosi 1,5 i jest zbliżony do stosunku molowego kości wynoszącej 1,70 (wg Le Geros [6]). Fosforany wapnia ulegają degradacji, trwającej nawet do roku czasu. Podczas degradacji TCP, w środowisku symulującym płyny ustrojowe SBF (z ang. Simulated Body Fluid), ceramika zostaje pokryta warstwą hydroksyapatytu [6]. Warstwa może powstać na dwa sposoby. W pierwszym przypadku poprzez rozpuszczanie βtcp i wytrącanie jonów wapnia oraz fosforanowych. Drugim sposobem powstania warstwy hydroksyapatytowej jest jej powstanie na drodze hydrolizy βtcp. βtcp po wszczepieniu w ubytki kostne ulega pochłonięciu przez makrofagi i komórki olbrzymie. Duży wpływ na procesy degradacji i wchłaniania ma udział objętościowy mikro i makroporów ceramiki. Badania in vivo przeprowadzone na królikach wykazały ubytek masy βtcp po 3 miesiącach degradacji wynoszący 15 ± 6% dla ceramiki o 30% obj. udziale makroporów. W przypadku ceramiki o dodatkowym udziale 40% obj. mikroporów ubytek TCP po 3 miesięcznej degradacji wzrósł do 30 ± 4% [6]. 2.4. Kompozyty polimerowo-ceramiczne w zastosowaniach medycznych PCL jest często stosowany do wytwarzania rusztowań ze względu na jego łatwą przetwarzalność. Jednak rusztowania wykonane z czystego PCL nie mają wysokich właściwości mechanicznych. Trójwymiarowe struktury wytworzone z takich polimerów można stosować do przedklinicznych i klinicznych aplikacji w inżynierii tkankowej [11]. Aktualne badania pokazują, że w celu polepszenia właściwości mechanicznych rusztowań do regeneracji tkanki kostnej wykonanych z PCL i poprawy ich interakcji z tkanką do polimeru dodaje się ceramik nieorganicznych. W ten sposób otrzymuje się bioaktywne 12

rusztowania kompozytowe [3]. Bioaktywność jest to zdolność bezpośredniego przylegania powierzchni implantu do tkanki miękkiej lub twardej, bez tworzenia warstwy pośredniej ze zmodyfikowanej tkanki [6]. Mechaniczne właściwości kompozytów PCL-TCP są podobne do właściwości kości gąbczastej [12]. Stosowane są również modyfikacje polimerowej osnowy kompozytów m.in. w celu sterowania okresem degradacji macierzy. Wprowadza się takie polimery jak m.in. poliestry, poliuretany [7]. W przypadku poliestru PLGA wytwarza się rusztowania z polimeru o różnym stosunku LA/GA, przez co możliwe jest sterowanie szybkością degradacji [3]. Zarówno rusztowania wytworzone z PCL oraz rusztowania wyprodukowane z PLGA wykazują biozgodność. Implanty wykonane z powyższych materiałów również przyczyniły się do udanej regeneracji kości piszczelowych królika w czasie 12 tygodniowego badania [13]. Kość charakteryzuje się większą sztywnością w porównaniu do obecnie dostępnych rusztowań [3]. W związku z tym, celem wielu z obecnie prowadzonych badań jest opracowanie odpowiednich połączeń materiałowych, które można by było wykorzystać w aplikacjach medycznych. 13

3. Kość Szkielet to układ kości i stawów. Jest to rusztowanie podtrzymujące i nadające kształt ciału człowieka. Kości stanowią miejsca przyczepu mięśni, osłaniają struktury organizmu, m.in. mózg, rdzeń kręgowy. Rys.5. Przekrój kości zbitej [14]. Tkanka kostna to rodzaj tkanki łącznej. Jej zewnętrzną warstwę stanowi okostna. Jest to cienka błonka zbudowana z tkanki łącznej. Zawiera w swojej strukturze naczynia krwionośne i nerwy penetrujące kość. Pod okostną leży kość zbita (rys.5). Jej przekrój przedstawiono na rysunku 5. Kość zbita posiada niejednorodną strukturę. Jej podstawowym elementem jest osteon. Osteon posiada budowę perforowanego walca o długości kilku milimetrów i średnicy 200 µm. W jego kanałach, tzw. kanałach Haversa, znajdują się naczynia nerwowe i krwionośne biegnące wzdłuż kości. Wokół każdego kanału ułożone są blaszki kostne. Wśród blaszek kostnych występują równomiernie rozłożone komórki kostne osteocyty. Osteocyty powstają z komórek kościotwórczych tzw. osteoblastów. Wewnętrzną warstwę kości stanowi lekka kość gąbczasta. Jest ona porowata i cechuje się rzadszą strukturą. Typy kości możemy podzielić ze względu na ich kształt. Wyróżniamy: 1. Kości długie ich długość przewyższa znacznie szerokość i grubość. Zazwyczaj służą jako dźwignie i miejsca przyczepu mięśni. Łagodzą wstrząsy i naprężenia. W swojej budowie posiadają jamy szpikowe. Przykładem tego typu kości są kości kończyn górnych i dolnych. 14

2. Kości płaskie ich długość i szerokość znacznie przewyższa grubość. Służą jako osłony. W swojej budowie posiadają szpik czerwony, dzięki czemu pełnią funkcję krwiotwórczą. Przykładami kości płaskich są kości biodrowe, sklepienia czaszki i łopatki. 3. Kości krótkie posiadają podobne wymiary długości, szerokości i grubości. Są masywne i pełnią rolę sprężystych osłon i sklepień. Przykład kości krótkich to kości nadgarstka i stopy. 4. Kości różnokształtne posiadają inny wymiar niż powyższe trzy typy. Przykładem kości różnokształtnych są kości podniebienia oraz kręgi. 5. Kości pneumatyczne posiadają w swojej budowie wypełnione powietrzem jamy. Wnętrze jam pokryte jest błoną śluzową. Występują w czaszce. Przykładem tego typu kości jest kość czołowa lub szczęka [14]. 15

4. Inżynieria tkankowa Inżynieria tkankowa według definicji polega na wykorzystaniu podstaw i metod inżynierii, biotechnologii oraz medycyny klinicznej. Jest stosowana w celu regeneracji uszkodzonych lub usuniętych tkanek i narządów wewnętrznych, oraz wytworzenia nowych tkanek [6]. W inżynierii tkankowej można wyróżnić podstawowe technologie : 1) Projektowanie i wytwarzanie rusztowań (podłoży) umożliwiających proliferację i różnicowanie komórek, zwykle macierzystych oraz zapewnienie stabilizacji obszaru dla odbudowujących się tkanek; 2) Izolację, hodowlę i zasiedlanie komórkami; 3) Projektowanie i wytwarzanie systemów dostarczania czynników biologicznych; Połączenie powyższych technologii jest w stanie przyspieszyć regenerację i umożliwić odbudowę częściowo lub całkowicie uszkodzonej tkanki [2]. Czynnikami odgrywającymi podstawową rolę w inżynierii tkankowej są komórki, czynniki wzrostu oraz sztuczne macierze pozakomórkowe (rusztowania) dla komórek. Jako komórki najczęściej wykorzystuje się komórki macierzyste pobierane ze szpiku kostnego pacjenta. Mają one wysoką zdolność odnawiania się. Mogą także różnicować się w niektóre tkanki (kostną, chrzęstną i ścięgnową). Czynnikami wzrostu są proteiny i białka. Mają one zdolność do łączenia się z receptorami komórek, dzięki czemu indukują ich proliferację, czyli mnożenie. Trójwymiarowe macierze strukturalne są wykonywane z biomateriałów. Mają na celu zapewnienie struktury nośnej dla komórek oraz umożliwienie przyczepienia i wzrostu komórki [6]. W inżynierii tkankowej wykorzystuje się między innymi materiały biodegradowalne, które powinny spełniać poniższe wymagania: nie wywoływać stanów zapalnych w organizmie, posiadać czas degradacji odpowiedni do tempa regeneracji tkanki, posiadać właściwości mechaniczne dopasowane do aplikacji i czasu degradacji, nie być toksyczne oraz nie uwalniać toksycznych składników podczas degradacji, być otrzymywane w sposób powtarzalny [7]. Polimery bioresorbowalne są materiałami, które głównie w wyniku hydrolizy degradują w środowisku biologicznie czynnym do nieszkodliwych produktów ubocznych [6]. 16

Polimery, które ulegają szybszej degradacji hydrolitycznej zawierają w swojej budowie grupy funkcyjne podatne na proces hydrolizy, m.in. grupy estrowe, węglany, grupy amidowe, moczniki, grupy uretanowe [7]. Proces degradacji polimerów syntetycznych może przebiegać w całej objętości materiału lub na jego powierzchni. Degradacja składa się z następujących etapów: a) adsorpcji cieczy na powierzchni materiału i jej dyfuzji w głąb objętości, b) hydrolizy wiązań występujących w polimerze, c) spadku masy cząsteczkowej i obniżeniu właściwości mechanicznych w wyniku hydrolitycznej fragmentacji łańcucha polimerowego, d) rozpuszczeniu produktów degradacji, które uległy dyfuzji do powierzchni materiału oraz fagocytowaniu mniejszych fragmentów, e) eliminacji produktów degradacji w cyklu Krebsa. Rys.6. Schemat degradacji PCL [8]. Na rysunku 6 przedstawiono przykładowy schemat degradacji PCL. Początkowo w wyniku degradacji następuje adsorpcja wody przez polimer. Następnie, w wyniku reakcji chemicznej materiału z płynami ustrojowymi dochodzi do hydrolizy łańcuchów poliestrowych. Kolejno następuje uwolnienie cząsteczek monomerów i oligomerów, które są eliminowane z organizmu w cyklu Krebsa [6]. Cykl Krebsa jest to cykl reakcji enzymatycznych w mitochondriach, który stanowi podstawę oddychania komórkowego. Dostarcza on energii w postaci kwasu adezynotrójfosforowego (ATP) i substancji potrzebnych do dalszych przemian metabolicznych. W wyniku tego procesu wydziela się energia, CO 2 i H 2 O [15]. Podatność materiału na degradację zależy od szybkości adsorpcji i dyfuzji wody w materiale. Na proces degradacji wpływa również środowisko biologicznie aktywne. Mogą w nim występować odziaływania chemiczne i mechaniczne. Powyższe oddziaływania 17

prowadzą do zmian materiałowych, np. obniżenia masy cząsteczkowej, spadku właściwości mechanicznych, a w konsekwencji utraty funkcjonalności. Na proces degradacji wpływają enzymy, lipidy, śladowe ilości jonów metali oraz aktywne makrofagi. Mogą one wywołać reakcje ogólnoustrojowe w przypadku przeniesienia produktów degradacji z dala od miejsca implantacji. Produkty degradacji mogą być przenoszone aktywnie przez makrofagi i pasywnie przez tkanki oraz układ krążenia. Natomiast zbyt szybki proces degradacji może prowadzić do przedwczesnej utraty właściwości mechanicznych. Ponadto nagłe uwolnienie dużej ilości kwaśnych produktów hydrolizy może wywołać rozwój stanu zapalnego. Szybkość degradacji materiału powinna być współzależna z procesem gojenia się uszkodzonej tkanki [6]. 18

5. Rusztowania do regeneracji tkanki kostnej Rusztowania do zastosowań w inżynierii tkankowej są trójwymiarowymi, porowatymi obiektami wytworzonymi z biodegradowalnego materiału, których celem jest zapewnienie tymczasowej stabilizacji regenerującej się tkance. Pełnią one funkcję podłoża do adhezji, migracji, proliferacji oraz różnicowania komórek. Rusztowania powinny być biozgodne i nietoksyczne, aby zostały zaakceptowane przez organizm. Ich właściwości mechaniczne należy odpowiednio dobrać do aplikacji i czasu degradacji. Zaleca się, aby podłoża były łatwo sterylizowane, aby zapobiegać zakażeniu. Ważna jest również ich porowata struktura umożliwiająca dyfuzję płynów ustrojowych. Pory powinny posiadać średnicę, co najmniej 100 µm, aby nastąpiła prawidłowa penetracja komórek. Dodatkowo rusztowania nie powinny być produkowane z kosztownych materiałów. Proces wytwarzania powinien być prosty, tani i szybki, aby ich produkcja była opłacalna [3]. Rys.7. Schemat ideowy regeneracji tkanki kostnej z zastosowaniem inżynierii tkankowej [2]. Istnieją dwa sposoby aplikacji rusztowania w organizmie ludzkim. Pierwszy z nich polega na pobraniu komórek od chorego pacjenta podczas biopsji. Komórki zostają rozmnożone na macierzy w kontrolowanych warunkach in vitro (rys.7). Następnie zasiedlone podłoże zostaje wszczepione do zmienionego chorobowo miejsca podczas operacji. Rusztowania po wykonaniu swojego zadania zostają usunięte z organizmu. Nie jest potrzebna kolejna operacja, aby usunąć implanty. Oszczędza to bólu pacjentowi i obniża koszty zabiegów medycznych. Drugie podejście polega na bezpośrednim wszczepieniu rusztowania do organizmu człowieka. Wówczas komórki migrują do macierzy z sąsiadujących tkanek i go zasiedlają. Następnie komórki zaczynają się rozmnażać i różnicować na implancie. Dzieje się to w ludzkim organizmie. Zaletą drugiego podejścia jest możliwość natychmiastowego użycia rusztowania oraz zmniejszenie liczby zabiegów pacjenta [2, 3]. 19

5.1. Techniki szybkiego prototypowania Techniki szybkiego prototypowania (z ang. Rapid Prototyping, RP) polegają na wytworzeniu trójwymiarowych obiektów fizycznych. Obiekty wytwarza się przyrostowo warstwa po warstwie bezpośrednio z modeli komputerowych przy użyciu oprogramowania CAD [16]. Najbardziej popularne metody szybkiego prototypowania to: Stereolitografia (z ang. Stereolithography, SL) polega na lokalnym warstwowym utwardzaniu ciekłego fotopolimeru za pomocą wiązki laserowej; Wytwarzanie strumieniem kropli fotopolimeru (z ang. Jetted Photopolymer, JP) polega na nanoszeniu fotopolimeru za pomocą głowic drukujących; Selektywne spiekanie laserowe (z ang. Selective Laser Sintering, SLS) polega na spajaniu warstwowym proszków poprzez ich spiekanie wiązką lasera; Wytwarzanie przez nakładanie warstw materiału (z ang. Laminated Object Manufacturing, LOM) polega na wycinaniu laserowym obrysu modelu i sklejaniu go do poprzedniej warstwy materiału; Modelowanie uplastycznionym polimerem (z ang. Fused Deposition Modeling, FDM) polega na formowaniu obiektu poprzez warstwowe osadzanie uplastycznionego materiału, jest kontrolowane za pomocą sterowania numerycznego; Trójwymiarowe drukowanie (z ang. Three Dimensional Printing, 3DP) polega na sklejaniu proszku za pomocą lepiszcza przy użyciu dwóch głowic drukujących [16]. W tabeli.1. przedstawiono wady i zalety powyższych metod RP. Tab.1. Zalety i wady metod RP. Metoda Zalety Wady SL Duży rozmiar części Duża dokładność Wysokie wymogi BHP Duży koszt JP Duża dokładność Szybkość procesu wytwarzania Mała wielkość obiektu Niska waga obiektu SLS Duża dokładność Brak dodatkowych obróbek Długi czas wytwarzania elementu Wysoki koszt systemu LOM Niski koszt Nieograniczony wymiar modelu Niedokładne wykończenie Anizotropia właściwości FDM Niski koszt Otrzymujemy gotowe elementy Długi czas wytwarzania elementu Niska jakość powierzchni 3DP Szybki czas powstawania elementu Niski koszt Mała dokładność Niska jakość powierzchni 20

Wiodącą metodą RP wykorzystywaną do produkcji rusztowań jest metoda FDM. Geometryczne modele rusztowań można otrzymać nie tylko przy użyciu programów graficznych typu CAD 3D. Mogą one również pochodzić ze skanów tomografii komputerowej i skanów rezonansu magnetycznego. Podstawowy proces powstania modelu FDM składa się z następujących etapów: a) odwzorowaniu medycznym przyszłego modelu, b) projektowaniu modelu w programie komputerowym CAD, c) importu danych modelu z programu CAD do pliku w formacie STL i wprowadzeniu danych do drukarki, d) wirtualnym pocięciu modelu na przekroje poprzeczne, e) procesu wytwarzania modelu FDM, W procesie wytwarzania FDM, przy stałych, kontrolowanych parametrach temperatury i ciśnienia, następuje wytłaczanie materiału w postaci włókien na podłoże i formowanie trójwymiarowego obiektu [8]. 21

6. Cel i zakres pracy Celem pracy była ocena wpływu różnych rodzajów napełniaczy na właściwości mechaniczne oraz profil degradacji kompozytów polimerowo-ceramicznych. Wpływ powyższych czynników na właściwości mechaniczne zbadano na kompozytach w postaci włókien. Natomiast profil degradacji osnowy wyznaczono badając rusztowania trójwymiarowe. Zarówno włókna, jak i rusztowania zostały wytworzone metodą odlewania z roztworu połączoną z techniką szybkiego prototypowania. Rolę osnowy w kompozytach pełnił polikaprolakton (PCL). Jako napełniacza użyto 10% wag. nano- lub mikro- cząstek trójfosforanu wapnia (β-tcp). W przypadku kompozytów trójskładnikowych dodatkowo do osnowy wprowadzono poli(d,l-laktyd-ko-glikolid) (PLGA). Początkowym etapem badań było określenie wpływu rozmiaru cząstek TCP na właściwości mechaniczne kompozytów. W tym celu wytworzono dwa rodzaje włókien kompozytów dwuskładnikowych zawierających 10% wag. nanocząstek oraz mikrocząstek TCP. Włókna te poddano statycznej próbie rozciągania. Napełniacz nadający wyższą sztywnością użyto do wytworzenia kompozytu potrójnego z dodatkiem 20% wag. PLGA. Wpływ obecności drugiego polimeru na właściwości mechaniczne zbadano również za pomocą statycznej próby rozciągania. W kolejnym etapie badań wyznaczono profil degradacji kompozytów. W tym celu wytworzono rusztowania z kompozytów dwuskładnikowych, zbrojonych nanoi mikrocząstkami TCP, jak również z kompozytu trójskładnikowego PCL-TCP-PLGA. Przeprowadzono 5- miesięczną degradację trójwymiarowych macierzy w roztworze soli fizjologicznej (z ang. Phosphate Buffered Saline PBS). Podczas procesu degradacji badano zmianę masy rusztowań, absorpcję wody oraz zmiany średniej masy cząsteczkowej, zawartości fazy krystalicznej, morfologii powierzchni i ph PBS. Wszystkie otrzymane wyniki odniesiono do materiału referencyjnego jakim był czysty PCL. 22

7. Materiały i metodyka badań 7.1. Materiały Do wytworzenia rusztowań wykorzystano polikaprolakton jako osnowę kompozytów, oraz mikro- i nano- cząstki trójfosforanu wapnia jako napełniacz. W kompozytach potrójnych użyto dodatkowej fazy polimerowej, jaką był poli(d,l-laktyd-ko-glikolid). 7.1.1. PCL Polikaprolakton został zakupiony od firmy SIGMA ALDRICH (Wielka Brytania). Producent oszacował wartość jego masy molowej na 70 000-90 000 g/mol. Polimer miał postać białych granulek o średnicy około 3 mm. 7.1.2. PLGA Poli(d,l-laktyd-ko-glikolid) (RESOMER RG 504H) został wyprodukowany przez firmę Boehringer-Ingelheim (Niemcy). Według producenta kopolimer posiada stosunek molowy D,L-laktydu do glikolidu wynoszący od 48:52 do 52:48, a lepkość materiału w 0,1% chloroformie w temp. 25 ⁰C wynosi 0,45-0,6 dl/g. 7.1.3. TCP Mikro cząstki trójfosforanu wapnia (nanoxim-tcp201) o rozmiarze 2,5 ± 0,5 µm zostały przekazane przez firmę FLUIDINOVA (Portugalia), w postaci białego proszku o geometrii zbliżonej do sferoidalnych cząstek. Natomiast nano cząstki trójfosforanu wapnia zakupiono w firmie SIGMA ALDRICH (USA). Cząstki miały postać białego proszku. Według producenta rozmiar cząstek proszku nano TCP wynosi poniżej 100 nm, a ich geometria jest zbliżona do sferoidalnych cząstek. 23

7.2. Wytwarzanie kompozytów Materiały o składzie przedstawionym w tabeli 2 zostały wytworzone metodą odlewania z roztworu. Tab.2. Skład wytworzonych materiałów. Nazwa materiału Skład kompozytu [wag. %] PCL PLGA Nano - TCP Mikro - TCP PCL 100 - - - PCL-TCP nano 90-10 - PCL-TCP mikro 90 - - 10 PCL-PLGA-TCP mikro 70 20-10 Czysty PCL (w przypadku materiału referencyjnego), mieszanina PCL z 10% wag. dodatkiem TCP (w przypadku kompozytów dwuskładnikowych) lub mieszanina PCL z PLGA wraz z 10% wag. dodatkiem TCP (w przypadku kompozytów trójskładnikowych) zostały rozpuszczone w dichlorometanie (czystość 99,8%; POCH, Polska) przez 2 godziny. Następnie poddano je ultrasonikacji pulsacyjnej przez 5 min w temperaturze 25⁰C, po czym mieszano na mieszadle magnetycznym przez 24 godziny. Rys.8. Film PCL. Rys.9. Suszarka próżniowa (Memmert, Niemcy). Kolejno roztwory wylano na szalkę Petriego i pozostawiono na 24 godziny do wyschnięcia. Uzyskano film, widoczny na rysunku 8. Film suszono w suszarkach 24

próżniowych (rys.9.) w temperaturze 45⁰C przez okres 48 godzin i temperaturze 25⁰C, przy ciśnieniu 50 mbar, przez okres 24 godzin. 7.3. Wytwarzanie włókien oraz trójwymiarowych rusztowań Wysuszone filmy pocięto na kawałki o wymiarach około 5 x 5 mm, które kolejno wsypano do zbiornika Bioscaffoldera (Syseng, Niemcy). Rys.10. (a) Stanowisko obsługi drukarki 3D typu Bioscaffolder; (b) głowica drukująca urządzenia Bioscaffolder. 25

Na rysunku 10a przedstawiono stanowisko do obsługi drukarki 3D typu Bioscaffolder. Natomiast na rysunku 10b widzimy głowicę drukującą urządzenia. Materiał, w skutek wytworzonego w zbiorniku ciśnienia, trafia do metalowej formy. Zarówno zbiornik jak i forma są ogrzewane przy pomocy grzałki oporowej pozwalającej utrzymać zadaną temperaturę. Materiał jest podgrzewany do temperatury płynięcia polimeru w celu jego uplastycznienia. Kolejno w wyniku wytworzonego ciśnienia materiał jest podawany do śruby ślimakowej. Śruba wytłacza materiał przez igłę tworząc włókno. Wytworzone włókno układane jest na stoliku i tworzy warstwa po warstwie trójwymiarowe rusztowanie. Tab.3. Parametry procesu wytwarzania. Nazwa materiału Temperatura [⁰C] Ciśnienie [MPa] PCL 100 0,5 PCL-TCP nano 115 0,6 PCL-TCP mikro 100 0,5 PCL-PLGA-TCP mikro 105 0,6 Wszystkie materiały zostały wytworzone przy pomocy techniki FDM przy parametrach ciśnienia i temperatury zestawionych w tabeli 3. 7.3.1. Wytwarzanie włókien W programie komputerowym typu CAD (Solid Works) zaprojektowano prostopadłościan o wymiarach 50 x 100 mm. Kolejno zapisano te dane w postaci pliku STL i zaimportowano je do programu PrimCAM, który steruje pracą drukarki 3D. Podczas drukowania włókien zadano następujące parametry procesu: prędkość przemieszczania się igły w płaszczyźnie XY:100 mm/min, prędkość przemieszczania się igły w osi Z: 400 mm/min, użyta igła: G25 o średnicy wewnętrznej 250 µm (rys.11.). Włókna zostały drukowane na specjalnym podłożu składającym się z tekturowej podkładki (rys.12). Na podkładce umieszczono dwa prostokątne paski dodatkowej tektury, które stanowiły podporę dla wytwarzanych włókien. Odległość między środkami podpór wynosiła 5 cm. Na podpory naklejono taśmę dwustronną w celu lepszego przymocowania 26

drukowanych włókien. Powyższe rozwiązanie umożliwiło otrzymanie włókien o powtarzalnej średnicy, które były drukowane w powietrzu (uniknięto kontaktu włókna z podłożem po opuszczeniu materiału przez igłę). Schemat wytwarzania włókien na specjalnym podłożu przedstawiono na rysunku 12. Rys.11. Igła G25 użyta do produkcji próbek. Rys.12. Schemat produkcji włókien na specjalnie zaprojektowanym podłożu. Po zakończeniu procesu produkcji i wystygnięciu włókien zostały one odcięte skalpelem, tak aby usunąć części pokryte klejem pochodzącym z folii dwustronnej. 27

7.3.2. Wytwarzanie trójwymiarowych rusztowań W celu wytworzenia rusztowań kostnych w programie komputerowym, typu CAD o nazwie Solid Works, zaprojektowano sześcian o boku długości 5 mm (rys.13.). Rys.13. Model rusztowania kostnego w programie typu CAD. Następnie zaimportowano dane modelu do pliku w formacie *.STL. Wprowadzono je do programu PrimCAM. Model został wirtualnie pocięty na 27 warstw w postaci przekrojów poprzecznych. Ustawiono następujące parametry procesu wytwarzania rusztowań kostnych: prędkość przemieszczania się igły w płaszczyźnie XY:100 mm/min, prędkość przemieszczania się igły w osi Z: 400 mm/min, grubość warstwy: 0,190 mm, odległość między kolejnymi warstwami:0,555 mm, kąt ułożenia włókien w kolejnych warstwach w rusztowaniu: 90⁰, użyta igła: G25 o średnicy włókna 250 µm. 7.4. Metody badań wytworzonych materiałów Wszystkie próbki przed badaniami zostały poddane płukaniu w izopropanolu. Proces oczyszczania polegał na umieszczeniu włókien (na okres 15 minut) i rusztowań kostnych (na okres 30 minut) w izopropanolu. Nie rozpuszcza on PCL i PLGA [7, 9]. Następnie próbki umieszczono w płuczce ultradźwiękowej (rys.14.) na 1 minutę przy pulsacyjnym charakterze pracy w temperaturze 25⁰C. 28

Rys.14. Płuczka ultradźwiękowa. Oznaczenie próbek włókien użytych do badań przedstawiono w tabeli 4. Natomiast próbek rusztowań kostnych w tabeli 5. Tab.4. Oznaczenie próbek włókien użytych w badaniach. Materiał Oznaczenie próbki Metody badawcze PCL PCL-TCP mikro PCL-TCP nano PCL-PLGA-TCP mikro A.1; A.2; A.3; A.4; A.5; A.6; B.1; B.2; B.3; B.4; B.5; B.6; C.1; C.2; C.3; C.4; C.5; C.6; D.1; D.2; D.3; D.4; D.5; D.6; SEM; Statyczna próba rozciągania; SEM; Statyczna próba rozciągania; SEM; Statyczna próba rozciągania; SEM; Statyczna próba rozciągania; Tab.5. Oznaczenie próbek rusztowań kostnych użytych w badaniach. Materiał Lp. PCL Tydzień degradacji Oznaczenie próbki 1 W0 A0 SEM 2 B0 DSC 3 A0, B0, C0 GPC Metoda badawcza 29

4 W4 A4 SEM 5 B4 DSC 6 A4, B4, C4 GPC 7 W8 A8 SEM 8 B8 DSC 9 A8, B8, C8 GPC 10 W12 A12 SEM 11 B12 DSC 12 A12, B12, C12 GPC 13 W16 A16 SEM 14 B16 DSC 15 A16, B16, C16 GPC 16 W20 A20 SEM 17 B20 DSC 18 A20, B20, C20 GPC Materiał Lp. PCL-TCP mikro Tydzień degradacji Oznaczenie próbki 19 W0 D0 SEM 20 E0 DSC 21 D0, E0, F0 GPC 22 W2 D2 SEM 23 E2 DSC 24 D2, E2, F2 GPC 25 W4 D4 SEM 26 E4 DSC 27 D4, E4, F4 GPC 28 W6 D6 SEM 29 E6 DSC 30 D6, E6, F6 GPC 31 W8 D8 SEM 32 E8 DSC 33 D8, E8, F8 GPC 34 W12 D12 SEM 35 E12 DSC 36 D12, E12, F12 GPC Metoda badawcza 30

37 W16 D16 SEM 38 E16 DSC 39 D16, E16, F16 GPC 40 W20 D20 SEM 41 E20 DSC 42 D20, E20, F20 GPC Materiał Lp. PCL-TCP nano Tydzień degradacji Oznaczenie próbki 43 W0 G0 SEM 44 H0 DSC 45 G0, H0, I0 GPC 46 W2 G2 SEM 47 H2 DSC 48 G2, H2, I2 GPC 49 W4 G4 SEM 50 H4 DSC 51 G4, H4, I4 GPC 52 W6 G6 SEM 53 H6 DSC 54 G6, H6, I6 GPC 55 W8 G8 SEM 56 H8 DSC 57 G0, H8, I8 GPC 58 W12 G12 SEM 59 H12 DSC 60 G12, H12, I12 GPC 61 W16 G16 SEM 62 H16 DSC 63 G16, H16, I16 GPC 64 W20 G20 SEM 65 H20 DSC 66 G20, H20, I20 GPC Materiał Lp. PCL-PLGA-TCP mikro Tydzień degradacji Oznaczenie próbki Metoda badawcza Metoda badawcza 31

67 W0 J0 SEM 68 K0 DSC 69 J0, K0,L0 GPC 70 W2 J2 SEM 71 K2 DSC 72 J2, K2,L2 GPC 73 W4 J4 SEM 74 K4 DSC 75 J4, K4,L4 GPC 76 W6 J6 SEM 77 K6 DSC 78 J6, K6,L6 GPC 79 W8 J8 SEM 80 K8 DSC 81 J8, K8,L8 GPC 82 W12 J12 SEM 83 K12 DSC 84 J12, K12,L12 GPC 85 W16 J16 SEM 86 K16 DSC 87 J16, K16,L16 GPC 88 W20 J20 SEM 89 K20 DSC 90 J20, K20,L20 GPC Dodatkowo na wszystkich degradowanych rusztowaniach przeprowadzono badanie absorpcji wody i zmian masy. Wykonano również pomiar ph medium użytego do procesu degradacji. 7.4.1. Statyczna próba rozciągania Statyczna próba rozciągania pojedynczych włókien tekstylnych jest opisana w normie ASTM (z ang. American Society for Testing and Materials) D 3822 01. Według powyższej normy próbka rozciągana powinna mieć długość początkową co najmniej 10 mm. Szybkość rozciągania użyta podczas próby jest zależna od szacunkowej wartości wydłużenia przy 32

zerwaniu dla badanego materiału. W przypadku próbek o długości początkowej L o =10 mm wyróżniamy następujące wartości szybkości rozciągania: 1 mm/min dla materiałów o wydłużeniu przy zerwaniu poniżej 8%; 6 mm/min dla materiałów o wydłużeniu przy zerwaniu pomiędzy 8 a 100%; 24 mm/min dla materiałów o wydłużeniu przy zerwaniu powyżej 100% [17]. Oceny właściwości mechanicznych dokonano na wytworzonych włóknach. Próbę rozciągania włókien przeprowadzono na maszynie wytrzymałościowej Tytron 250 (MTS, USA). Sześć włókien każdego z wytworzonych materiałów (PCL; PCL-TCP mikro; PCL-TCP nano; PCL-PLGA-TCP mikro) o początkowej długości L o =20 mm rozciągano z szybkością V=48 mm/min, ponieważ PCL charakteryzuje się wydłużeniem przy zerwaniu na poziomie 4700% [10]. Następnie wyznaczono moduł Younga i umowną granicę plastyczności materiałów. Moduł Younga, określający sztywność, wyznaczono jako tangens kąta nachylenia liniowego zakresu krzywej naprężenie odkształcenie, gdzie obowiązuje prawo Hookea. Natomiast umowną granicę plastyczności obliczono jako naprężenie występujące przy 1% odkształceniu trwałym [18]. Statyczną próbę rozciągania kompozytów dwuskładnikowych przeprowadzono w celu wyznaczenia napełniacza zapewniającego najlepsze właściwości mechaniczne. Napełniacz ten użyto następnie do produkcji kompozytów trójskładnikowych. Badanie to przeprowadzono również na kompozycie trójskładnikowym w celu zbadania wpływu dodatkowego polimeru na jego właściwości mechaniczne. 7.4.2. Badanie degradacji Norma ISO 10993-13 przewiduje metodę badań degradacji w czasie przyspieszonym i w czasie rzeczywistym. Obydwie metody degradacji odbywają się w temperaturze 37⁰C w buforach o ph od 1,0 do 10,5. Metody różnią się jedynie czasem prowadzenia eksperymentu degradacji. Gdy przewidywany czas kontaktu implantu z tkankami wynosi poniżej 30 dni, ocena degradacji w czasie przyspieszonym powinna się odbyć po 2 i 7 dniach. W przypadku przewidywanego czasu kontaktu implantów z tkankami wynoszącego powyżej 30 dni, ocenę degradacji powinno przeprowadzać się po 2 i 60 dniach. W przypadku degradacji w czasie rzeczywistym, dla implantów będących w kontakcie z tkankami poniżej 30 dni, ocena degradacji przypada na 4 terminy wraz z 30 dniem. Natomiast przy degradacji rzeczywistej implantów, których zakładany czas kontaktu z tkankami wynosi powyżej 30 dni, ocenę degradacji winno się przeprowadzać po 1, 3, 6 i 12 miesiącach lub do utraty integralności wyrobu [6]. 33

Ocenę postępu degradacji przeprowadza się między innymi poprzez pomiar zmian masy implantów (waga analityczna), zmian masy cząsteczkowej (chromatografia żelowa) i właściwości termicznych (różnicowa kalorymetria skaningowa) [6]. Rys.15. Cieplarka w której inkubowano próbki podczas degradacji. Rys.16. Komora laminarna. Degradację materiałów przeprowadzono w roztworze PBS. Ze względu na ograniczony czas pracy dyplomowej degradacja była prowadzona przez okres 20 tygodni. Badaniu poddano rusztowania kostne każdego wytworzonego materiału (PCL; PCL-TCP mikro; PCL-TCP nano; PCL-PLGA-TCP mikro). Początkowo wszystkie próbki umieszczono w szalkach i zalano 10ml roztworu PBS. Podczas procesu degradacji próbki przebywały 34

w cieplarce (rys.15.) o temperaturze 37⁰C, która jest zbliżona do temperatury ludzkiego organizmu. W cieplarce inkubowane próbki były delikatnie wytrząsane. Półka cieplarki była wprowadzona w ruch obrotowy z prędkością 100 rpm. PBS był wymieniany co 2 tygodnie, aż do wyjęcia każdej z degradowanych próbek. Zmiana PBS odbywała się w komorze laminarnej (rys.16.). Przed każdą wymianą medium komora była odkażana roztworem 70% alkoholu etylowego. Rusztowania wykonane z materiału referencyjnego, jakim był PCL wyjmowano w 4, 8, 12, 16 i 20 tygodniu degradacji. Natomiast macierze kompozytów zostały wyjęte w 2, 4, 6, 8, 12, 16 i 20 tygodniu degradacji. W każdym punkcie pomiarowym badano po 3 rusztowania dla danego materiału. 7.4.2.1. Zmiany ph roztworu Po wyjęciu próbki z PBS mierzono jego ph. Pomiary dokonano w roztworze PBS po wyjęciu próbek w 4, 6, 8, 12, 16 i 20 tygodniu degradacji. Rys.17. ph metr. Rys.18. Waga analityczna. Wartości ph zostały zmierzone na ph-metrze Mettler Toledo (rys.17.). Profil zmian ph PBS podczas degradacji wyznaczono dla każdego z badanych materiałów. 35

7.4.2.2. Absorpcja wody i zmiany masy Profil degradacji materiałów wyznaczono na podstawie zmian masy badanych rusztowań oraz absorbowania przez nie wody. Każda degradowana próbka, po wyjęciu z roztworu PBS, została opłukana wodą demineralizowaną w celu usunięcia ewentualnych resztek soli. Następnie, za pomocą sączka filtracyjnego, z próbek usunięto możliwie najwięcej niezabsorbowanej wody i zważono je na wadze analitycznej (rys.18.). Kolejno próbkę suszono najpierw w temperaturze otoczenia i pod ciśnieniem atmosferycznym przez 24 godziny, a następnie w suszarce próżniowej o temperaturze 25⁰C, przy ciśnieniu 50 mb przez 14 dni. Po całkowitym osuszeniu próbek dokonano pomiaru ich wagi. Z różnicy masy próbki mokrej i suchej wyznaczono absorpcję wody przez rusztowaniach dla każdego z materiałów. Absorpcję wody obliczono na podstawie poniższego wzoru: (1), gdzie: X absorpcja wody; masa mokrego rusztowania; masa suchego rusztowania. Masę próbek po degradacji ( poniższego wzoru: ) wyznaczono jako procent masy początkowej według (2), gdzie: masa rusztowania przed procesem degradacji masa suchego rusztowania Próbki, po zbadaniu absorpcji wody i masy po degradacji, zostały użyte do kolejnych badań, jakimi były: skaningowa mikroskopia elektronowa, chromatografia żelowa i skaningowa kalorymetria różnicowa. 36

7.4.3. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) W celu obserwacji morfologii powierzchni badanych materiałów użyto skaningowego mikroskopu elektronowego. Schemat budowy takiego mikroskopu przedstawiono na rysunku 19. Mikroskop Elektronowy składa się z działa elektronowego, gdzie wytwarzana jest wiązka elektronów. Kolejnym elementem budowy tego urządzenia jest kolumna, w której wiązka elektronów jest przyspieszana i ogniskowana. Tak uformowana wiązka elektronów trafia do komory próbki, gdzie następuje pobudzenie powierzchni badanej próbki przez wiązkę elektronów. Mikroskop ten zwykle posiada zestaw detektorów odbierających różne sygnały emitowane przez próbkę. Należą do nich: detektor niskoenergetycznych elektronów wtórnych (z ang. Secondary Electrons, SE), jak również detektor elektronów wstecznie rozproszonych (z ang. Back Scattered Electrons, BSE). Ostatnim elementem jest system przetwarzania sygnałów pochodzących od poszczególnych detektorów na obraz obserwowany na monitorze komputera. Rys.19. Schemat budowy skaningowego mikroskopu elektronowego [19]. Obserwacje badanych próbek zostały przeprowadzone na skaningowym mikroskopie elektronowym TM 3000 w trybie BSE, przy napięciu przyspieszającym wiązkę elektronów równym 15 kv i powiększeniach 100x, 500x, 1000x i 1500x. Badaniu poddano wszystkie włókna przeznaczone do próby rozciągania w celu wyznaczenia ich średnicy i obserwacji morfologii powierzchni, oraz rozłożeniu zbrojenia w kompozytach. Badaniu poddano również rusztowania wytworzone z każdego badanego materiału (PCL; PCL-TCP mikro; PCL-TCP 37

nano; PCL-PLGA-TCP mikro), które pochodziły z wszystkich punktów pomiarowych (tygodnie: 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20). Tydzień zerowy obserwowano w celu określenia jakości wytworzonego rusztowania. Natomiast na macierzach pochodzących z pozostałych punktów pomiarowych obserwowano zmiany morfologii powierzchni w czasie degradacji. 7.4.4. Chromatografia żelowa (GPC) W celu oznaczenia średniej wartości masy cząsteczkowej użyto chromatografii żelowej (z ang. Gel Permeation Chromatography, GPC). Polimery to mieszanina łańcuchów polimerowych o różnej długości, a co za tym idzie różnej masie cząsteczkowej. Chromatograf GPC wykorzystany do badań składał się z dwóch połączonych szeregowo kolumn chromatograficznych wypełnionych ziarnami nierozpuszczalnego polimeru (poli(styren-ko-diwinylobenzen)), w postaci żelu posiadającego pory o określonej wielkości. Badanie GPC polega na podaniu na kolumnę roztworu polimeru i jego rozdziale ze względu na długość łańcucha. Łańcuchy o małych rozmiarach wnikają do porów ziaren, przez co przebyta przez nie droga, a co za tym idzie czas elucji, są dłuższe. Cząsteczki o największej masie cząsteczkowej i średnicy większej niż pory ziaren nie wnikają do porów, mają więc krótszą drogę do pokonania w kolumnie i opuszczają ją jako pierwsze. Na podstawie pomiaru GPC możemy otrzymać informacje o liczbowo średniej masie molowej ( ). ( ) ( ) ( ), gdzie: masa molowa makrocząsteczki [g/mol], liczba makrocząsteczek o masie molowej, masa wszystkich makrocząsteczek o masie molowej [g]. Właściwości polimerów zależne od liczby cząsteczek, czyli od to właściwości koligatywne. Zależą one od stężenia, a nie rodzaju substancji rozpuszczonej. Przykładami właściwości koligatywnych zależnych od są: ebuliometria, czyli podwyższenie temperatury wrzenia; kriometria, czyli obniżenie temperatury zamarzania; ciśnienie osmotyczne oraz zmniejszenie ciśnienia pary nad roztworem [20]. Na podstawie pomiaru GPC określa się również wartości masowo (wagowo) średniej masy molowej ( ). 38

( ) ( ), gdzie: masa molowa makrocząsteczki [g/mol], liczba makrocząsteczek o masie molowej, masa wszystkich makrocząsteczek o masie molowej [g]. Właściwości polimerów zależne od wielkości cząsteczek, czyli od to przykładowo: rozpuszczalność; lepkość w stanie stopionym i w roztworze; przetwarzalność; temperatury: kruchości, zeszklenia i topnienia; zdolność do krystalizacji; zdolność do formowania błon i włókien; plastyczność; odporność chemiczna i termiczna. wpływa również na właściwości mechaniczne, takie jak: moduł sprężystości czy wytrzymałość na rozciąganie. Wyższe wartości zwiększają wytrzymałość na rozciąganie do pewnej wartości granicznej. Powyżej wartości granicznej wpływ jest nieistotny [20]. Rys.20. Chromatograf żelowy. W celu przygotowania próbek do badania na chromatografie żelowym rusztowania rozpuszczano przez 24 godzin w chloroformie o czystości HPLC (POCH S.A.; Polska). Stosunek rozpuszczonej masy rusztowania do objętości 1 ml chloroformu wynosił 1:3. Następnie w przypadku próbek kompozytowych odwirowano ceramikę z prędkością 39

10 000 rpm przez 10 minut. Kolejno roztwór polimeru został przefiltrowany przez teflonowy filtr strzykawkowy o średnicy porów 0,2 µm i umieszczony w fiolce przeznaczonej do badania na chromatografie żelowym. Za pomocą modułowego chromatografu żelowego serii 1200 Agilent, widocznego na rysunku 20, wyznaczono liczbowo i wagowo średnią masę cząsteczkową badanych próbek. Analizie GPC poddano po 3 rusztowania wytworzone z każdego badanego materiału (PCL; PCL-TCP mikro; PCL-TCP nano; PCL-PLGA-TCP mikro), które pochodziły z wszystkich punktów pomiarowych (tygodnie: 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20). Badanie to miało na celu określenie zmian wartości liczbowo i wagowo średniej masy cząsteczkowej podczas procesu degradacji. 7.4.5. Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC) Jedną z metod analizy termicznej jest skaningowa kalorymetria różnicowa (z ang. Differential Scanning Calorimetry, DSC). DSC stosowana jest w analizie fazowej, pomiarze ciepła przemian fazowych i reakcji chemicznych, wyznaczaniu ciepła właściwego substancji, oznaczaniu składu chemicznego i czystości, wyznaczaniu parametrów kinetycznych reakcji [21]. Metoda polega na pomiarze zmiany różnicy strumienia cieplnego powstającego podczas programu temperaturowego między próbką badaną i referencyjną. Podczas badania umieszcza się próbkę badaną i referencyjną w piecu grzewczym. Następnie próbki zostają ogrzane lub chłodzone w jednakowych warunkach, najczęściej ze stałą szybkością nagrzewania lub chłodzenia. W próbce odniesienia podczas ogrzewania i chłodzenia nie zachodzą żadne przemiany [22]. Kolejno rejestrujemy pomiar pochłanianego lub wydzielanego ciepła podczas zmiany temperatur zachodzących podczas reakcji w badanej próbce. Można również zmierzyć różnice strumienia cieplnego w funkcji czasu w przypadku pomiaru izotermicznego. W badanej próbce podczas ogrzewania możemy zaobserwować przemianę egzotermiczną, gdy następuje spadek entalpii. Przemianę endotermiczną obserwujemy, gdy następuje wzrost entalpi próbki. Dzięki krzywej DSC możemy wyznaczyć temperaturę oraz entalpię topnienia i krystalizacji materiału, określić temperaturę przejścia szklistego T g, jak również wyznaczyć wartość ciepła właściwego i energię aktywacji procesu krystalizacji. Zaletami metody DSC są: niewielka ilość materiału potrzebnego do przeprowadzenia badania; możliwość badania substancji zarówno organicznych, jak i nieorganicznych, w stałym i ciekłym stanie skupienia; uzyskaniu analizy termicznej zarówno podczas ogrzewania jak i chłodzenia. 40

Rys.21. Skaningowy kalorymetr różnicowy Q2000 (TA Instruments). Analizę termiczną badanych próbek przeprowadzono na różnicowym kalorymetrze skaningowym Q2000 (TA Instruments, USA) widocznym na rysunku 21. Próbki podczas badania dwukrotnie chłodzono do temperatury -80⁰C, a następnie grzano do temperatury 200⁰C z prędkością 10⁰C/min. Kolejno, z otrzymanego wykresu zmian ciepła właściwego w zależności od temperatury (drugie grzanie próbki), wyznaczono entalpię topnienia badanej próbki, Odniesiono ją do entalpii topnienia 100% krystalicznego PCL wynoszącej 139,4 J/g [23]. Następnie z poniższego wzoru [24] obliczono zawartość fazy krystalicznej. [ ] ( ), gdzie: k zawartość fazy krystalicznej, f współczynnik uwzględniający wagowy udział PCL, ΔH entalpia topnienia badanej próbki [J/g], ΔH m entalpia topnienia 100% krystalicznej fazy odniesienia [J/g]. Badaniu poddano rusztowania kostne każdego wytworzonego materiału (PCL; PCL-TCP mikro; PCL-TCP nano; PCL-PLGA-TCP mikro), które pochodziły z wszystkich punktów pomiarowych (tygodnie: 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20), w celu określenia zmian zawartości fazy krystalicznej podczas procesu degradacji. 41

8. Wyniki badań i ich dyskusja 8.1. Wybór napełniacza do kompozytu trójskładnikowego 8.1.1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) Poniżej przedstawiono zdjęcia SEM morfologii powierzchni wytworzonych włókien: polimerowych i kompozytów dwuskładnikowych (rys. 22-24.) oraz wykres uśrednionych wartości średnic włókien (rys. 25.). Rys.22. Zdjęcie SEM włókna wytworzonego z 100%PCL, próbka A.1. Rys.23. Zdjęcie SEM włókna wytworzonego z kompozytu o składzie wagowym 90%PCL- 10%TCP (cząstki w postaci mikro), próbka B.1. 42

Uśredniona średnica *µm+ Rys.24. Zdjęcie SEM włókna wytworzonego z kompozytu o składzie wagowym 90%PCL- 10%TCP (cząstki w postaci nano), próbka C.1. 250 200 150 100 221 205 204 50 0 Materiał PCL PCL-TCP mikro PCL-TCP nano Rys.25. Uśrednione średnice rozciąganych włókien PCL i kompozytów dwuskładnikowych. Na rysunku 22 przedstawiono przykładowe włókno materiału referencyjnego. Obserwowano gładką, jednolitą powierzchnię. Włókno posiadało równoległe do siebie krawędzie. Pojedyncze równoległe wgłębienia na powierzchni włókna były pozostałościami pochodzącymi z procesu produkcyjnego. Na rysunku 23 przedstawiono morfologię powierzchni przykładowego włókna kompozytowego dwuskładnikowego wytworzonego z dodatkiem 10% wag. TCP w postaci mikro. Włókno również posiada równoległe krawędzie. Na powierzchni włókna zauważono równomiernie rozłożony napełniacz, jakim był TCP, w postaci białych nieregularnych cząsteczek. Na rysunku 24 dostrzeżono morfologię powierzchni włókna kompozytowego dwuskładnikowego wytworzonego z dodatkiem 10% wag. TCP w postaci nano. Na powierzchni włókna zauważono dość równomiernie rozłożony napełniacz w postaci białych, cząsteczek, które swoją geometrią były zbliżone do 43

cząstek sferoidalnych. Można było zaobserwować również pojedyncze obszary zaglomerowanego napełniacza. Były to obszary, gdzie kilka cząstek przylega bezpośrednio do siebie. Włókno posiadało równoległe krawędzie. Jednak jego powierzchnia nie była gładka, charakteryzowała się fałdami. Włókno posiadało przy krawędziach miejsca cechujące się postrzępioną rozwiniętą powierzchnią, wytworzoną podczas procesu produkcyjnego. Powyższe cechy mogą rzutować na właściwości mechaniczne badanych włókien. Na podstawie obserwacji SEM wyznaczono dla każdego włókna wartość średnicy (pomiar średnicy w sześciu różnych miejscach każdego z włókien). Kolejno średnice sześciu włókien pochodzących z każdego badanego materiału uśredniono i przedstawiono jako średnią i odchylenie standardowe (rys. 25). Wszystkie włókna były wytwarzane za pomocą tej samej igły, o średnicy wewnętrznej równej 250 µm. Otrzymane włókna charakteryzowały się mniejszymi średnicami niż średnica igły, co mogło być wynikiem skurczu polimeru po etapie produkcyjnym [25]. Mogło to być również związane z wyższą lepkością polimeru. Dodatek cząstek napełniacza zwiększa lepkość i zmniejsza szybkość płynięcia polimerów [26]. 8.1.1. Statyczna próba rozciągania Na podstawie wykresów naprężenie-odkształcenie wyznaczono moduł Younga oraz umowną granicę plastyczności wytworzonych włókien. Wartości zestawiono w tabeli 6. Dokonano weryfikacji napełniaczy mikro- i nano- TCP do wytworzenia kompozytów trójskładnikowych. Odpowiedniejszym napełniaczem okazały się cząstki TCP w postaci mikro, które charakteryzowały się wyższymi parametrami opisującymi właściwości mechaniczne. Moduł Younga dla włókien polimerowych wynosił 408 MPa, a dla włókien kompozytowych zbrojonych cząsteczkami TCP w postaci mikro i nano odpowiednio 612 i 503 MPa. Analizując wpływ napełniacza na moduł Younga zauważono, że w przypadku cząstek TCP w postaci nano wystąpił około 25% wzrost sztywności w odniesieniu do włókna wytworzonego z czystego polimeru. Natomiast w przypadku użycia w produkcji kompozytów dwuskładnikowych cząstek TCP w postaci mikro obserwowano około 50% wzrost sztywności w odniesieniu do włókna czystego PCL. Umowna granica plastyczności dla materiału referencyjnego wynosiła 15,3 MPa. Natomiast w przypadku zbrojenia cząstkami TCP w postaci mikro dostrzeżono wzrost umownej granicy plastyczności do wartości 18,2 MPa, a w przypadku zbrojenia cząstkami TCP w postaci nano obserwowano wzrost wartości do 44

Naprężenie σ [MPa] 17,2 MPa. Teoretycznie napełniacz w postaci nano powinien w większym stopniu polepszyć wartości parametrów wytrzymałościowych kompozytów. W przypadku badanych kompozytów nie dostrzeżono takiej zależności. Wyższe parametry wytrzymałościowe mikrokompozytów mogą być spowodowane morfologią ich powierzchni. W przypadku zdjęcia SEM kompozytów z napełniaczem TCP w postaci nano (rys. 24) dostrzeżono nierówności na powierzchni włókna, które mogły być koncentratorami naprężeń zmniejszającymi wartości parametrów mechanicznych włókien. Tab.6. Porównanie średnich wartości modułu Younga i umownej granicy plastyczności dla wytworzonych włókien. Materiał E [MPa] R 1 [MPa] 100% PCL 408 ± 31 15,3 ± 1,4 90% PCL 10% TCP mikro 612 ± 142 18,2 ± 3,1 90% PCL 10% TCP nano 503 ± 35 17,2 ± 1,4 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Odkształcenie ε [%] A.1 A.2 A.3 A.4 A.5 A.6 Rys.26. Krzywe naprężenie-odkształcenie dla włókien wytworzonych z 100% PCL. 45

Naprężenie σ [MPa] Naprężenie σ [MPa] 30 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Odkształcenie ε [%] B.1 B.2 B.3 B.4 B.5 B.6 Rys.27. Krzywe naprężenie-odkształcenie dla kompozytów o składzie wagowym 90%PCL- 10%TCP (mikrocząstki). 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 Odkształcenie ε [%] C.1 C.2 C.3 C.4 C.5 C.6 Rys.28. Krzywe naprężenie-odkształcenie dla kompozytów o składzie wagowym 90%PCL- 10%TCP (nanocząstki). 46

Naprężenie σ [MPa] Na rys.26-28 przedstawiono krzywe naprężenie-odkształcenie dla wytworzonych włókien. Krzywe włókien z nanocząstkami charakteryzowały się podobnym przebiegiem, co wykazuje na równomierne rozmieszczenie napełniacza w objętości kompozytów oraz powtarzalności procesu wytwarzania tych włókien. Krzywe kompozytów z mikrocząstkami posiadały podobny przebieg. Krzywa B.2 charakteryzowała się większymi wartościami naprężeń. Spowodowała dość duży rozrzut wyników, co wpłynęło na wysoki błąd otrzymanych parametrów wytrzymałościowych. Jednak zachowywała cały czas analogiczny przebieg w porównaniu do pozostałych badanych włókien. 25 20 15 17,5 MPa 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 Odkształcenie ε [%] Rys.29. Krzywa naprężenie-odkształcenie dla próbki C.2. Na rysunku 29 przedstawiono niebieską krzywą naprężenie-odkształcenie dla próbki C.2 kompozytu z nanocząstkami. Kolorem czarnym zaznaczono zakres prostoliniowy krzywej naprężenie-odkształcenie, w którym obowiązuje prawo Hookea. Moduł Younga wyznaczono jako tangens kąta nachylenia liniowego zakresu krzywej naprężenieodkształcenie. W przypadku próbki C.2 moduł Younga wynosił 488 MPa. Badany materiał nie wykazywał widocznej granicy plastyczności. W takim przypadku wprowadza się umowną granicę plastyczności. Obliczona się ją jako naprężenie występujące przy 1% odkształceniu trwałym [18] w przypadku tworzyw sztucznych. Kolorem czerwonym oznaczono odcinek odpowiadający odkształceniu 1%, biegnący równolegle do zakresu prostoliniowego krzywej naprężenie-odkształcenie. Przecięcie odcinka czerwonego z krzywą naprężenieodkształcenie odpowiada wartości umownej granicy plastyczności, wynoszącej 17,5 MPa dla próbki C.2. 47

8.2. Charakteryzacja włókien z kompozytów trójskładnikowych 8.2.1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) Na poniższym zdjęciu SEM (rys.30) przedstawiono morfologię powierzchni włókna kompozytu trójskładnikowego wytworzonego z 70% wag. PCL, 20% wag. PLGA i 10% wag. mikrocząstek TCP. Rys.30. Zdjęcie SEM włókna wytworzonego z kompozytu o składzie wagowym 70%PCL- 20%PLGA-10%TCP (mikrocząstki TCP), próbka D.1. Na rysunku 31 SEM porównano morfologię powierzchni kompozytów zbrojonych mikrocząstkami (kompozyt dwuskładnikowy i trójskładnikowy). Włókno kompozytu trójskładnikowego charakteryzowało się równoległymi do siebie brzegami (rys.30). Na powierzchni można było dostrzec równomiernie rozłożone, drobne, białe, nieregularne cząstki TCP, jak również równomiernie rozłożone sferoidalne, nieco większe cząstki (mikroinkluzje) zaznaczone na rysunku 31b. W przypadku zdjęć włókien kompozytów dwuskładnikowych z mikrocząstkami TCP (rys.31a) nie zaobserwowano powyższych mikroinkluzji. Kompozyt dwuskładnikowy i trójskładnikowy różnił się tylko dodatkową fazą polimerową PLGA. Sferoidalne cząstki w postaci mikoinkluzji występujące w kompozycie trójskładnikowym były to prawdopodobnie cząsteczki PLGA. 48

Uśredniona średnica *µm+ Rys.31. Zdjęcie SEM włókien wytworzonych z kompozytów z mikrocząstkami: dwuskładnikowego (a) i trójskładnikowego (b), próbki B.1, D.1. 250 200 150 100 50 221 205 204 188 0 Materiał PCL PCL-TCP mikro PCL-TCP nano PCL-PLGA-TCP mikro Rys.32. Uśrednione średnice wszystkich rozciąganych włókien. Uśredniona średnica w przypadku włókien kompozytów trójskładnikowych wynosiła 188 µm. Pomiaru średnicy dokonano analogicznie jak w przypadku kompozytów dwuskładnikowych. Włókna kompozytów trójskładnikowych również były wytwarzane za pomocą igły o średnicy wewnętrznej 250 µm, którą wytworzono włókna PCL i włókna kompozytów dwuskładnikowych. Otrzymane włókna charakteryzowały się jeszcze mniejszą średnicą (rys.32), co mogło być wynikiem skurczu polimerowego i zwiększonej lepkości kompozytu. Jak powszechnie wiadomo, dodatek cząstek napełniacza zmniejsza szybkość płynięcia polimerów [26]. 49

Naprężenie σ [MPa] 8.2.2. Statyczna próba rozciągania W celu charakteryzacji właściwości mechanicznych kompozytu trójskładnikowego, analogiczne jak w przypadku kompozytów dwuskładnikowych, wyznaczono moduł Younga oraz umowną granicę plastyczności na podstawie krzywych naprężenie-odkształcenie. Stwierdzono, że dodatek trzeciej fazy zwiększył parametry wytrzymałościowe kompozytu trójskładnikowego w porównaniu do kompozytów dwuskładnikowych. Wyznaczona średnią wartość modułu Younga dla kompozytu trójskładnikowego, która wynosiła 926 ± 138 MPa, a średnia wartość umownej granicy plastyczności odpowiadała 18,8 ± 3,0 MPa. Analizując krzywą naprężenie-odkształcenie (rys.33) dla kompozytu trójskładnikowego zauważamy podobny przebieg krzywych dla pięciu z sześciu badanych włókien. Jedynie krzywa D.3 charakteryzowała się większymi wartościami naprężeń, ale zachowała analogiczny przebieg w porównaniu do pozostałych badanych włókien. Oznacza to, że proces produkcji kompozytów trójskładnikowych jest powtarzalny i może być stosowany na większą skalę. 30 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 Odkształcenie ε [%] D.1 D.2 D.3 D.4 D.5 D.6 Rys.33. Krzywe naprężenie-odkształcenie dla kompozytów o składzie wagowym 70%PCL- 20%PLGA-10%TCP (mikrocząstki). 50

Umowna granica plastyczności R 1 [MPa] Moduł Younga E *MPa+ 1200 1000 800 600 400 926 200 408 612 503 0 Materiał PCL PCL-TCP mikro PCL-TCP nano PCL-PLGA-TCPmikro Rys.34. Porównanie średniego modułu Younga wytworzonych włókien. 25 20 15 10 15,3 18,2 17,2 18,8 5 0 Materiał PCL PCL-TCP mikro PCL-TCP nano PCL-PLGA-TCPmikro Rys.35. Porównanie średniej umownej granicy plastyczności wytworzonych włókien. Na rysunku 34 przedstawiono średnie wartości modułu Younga, a na rysunku 35 średnie wartości umownej granicy plastyczności dla wszystkich badanych kompozytów. Dodatek PLGA spowodował ponad dwukrotny wzrost sztywności w odniesieniu do materiału 51

Absorbcja wody X [%] referencyjnego, oraz 30% wzrost sztywności w porównaniu do kompozytu dwuskładnikowego wytworzonego z takim samym napełniaczem. Obserwowano również wzrost umownej granicy plastyczności dla kompozytów trójskładnikowych do wartości 18,8 MPa. Wzrost parametrów wytrzymałościowych dla kompozytów trójskładnikowych był związany z ich strukturą. Obserwując zdjęcie SEM (rys.30) kompozytu zawierającego dodatkową fazę polimerową zaobserwowano na powierzchni zarówno cząstki TCP, jak i mikroinkluzje PLGA przedstawione na rys.31b, które stanowiły zbrojenie umacniające kompozyt. PLGA jest polimerem o wysokim module Younga 1,4-2,8 GPa [3], co wpłynęło na większą sztywność kompozytu trójskładnikowego. 8.3. Profil degradacji osnowy wytworzonych rusztowań kostnych 8.3.1. Absorpcja wody i zmiany masy Największą absorpcją wody i zmianą masy charakteryzowały się rusztowania kostne wytworzone z kompozytu trójskładnikowego. Oznacza to, że osnowa z dodatkiem trzeciej fazy, w postaci PLGA znacząco przyspiesza szybkość degradacji badanych rusztowań. 160 140 120 100 80 60 40 20 0 2 4 6 8 12 16 20 Tydzieo PCL PCL-TCP mikro PCL-TCP nano PCL-PLGA-TCP mikro Rys.36. Zmiany absorpcji wody wytworzonych rusztowań w czasie 20 tygodniowej degradacji w PBS. Analizując zmiany absorpcji wody badanych rusztowań (rys.36) dostrzeżono, że rusztowania wytworzone z kompozytów dwuskładnikowych charakteryzowały się podobną absorbcją wody od około 28 do 57% w trakcie degradacji. Posiadały one wartości nieco 52

Zmiany masy m p [%] wyższe niż rusztowania wykonane z materiału referencyjnego, którym odpowiadała absorpcja wody na poziomie 14-48%. Natomiast w przypadku implantów wytworzonych z kompozytów trójskładnikowych absorpcja wody była znacząco wyższa od pozostałych badanych rusztowań kostnych. W pierwszych sześciu tygodniach degradacji wynosiła od około 55 do 69%, a od 8 do 20 tygodnia wzrosła od 86 do 111%. 120 100 80 60 40 20 0 2 4 6 8 12 16 20 Tydzieo PCL PCL-TCP mikro PCL-TCP nano PCL-PLGA-TCP mikro Rys.37. Zmiany masy rusztowań w czasie 20 tygodniowej degradacji w PBS. W przypadku rusztowań wykonanych z materiału polimerowego oraz z kompozytów dwuskładnikowych masa rusztowań pozostała po degradacji (rys.37) nie uległa dużej zmianie (nie przekroczyła 1%) podczas 20 tygodniowej degradacji. Natomiast kompozyt trójskładnikowy charakteryzował się postępującym ubytkiem masy w trakcie degradacji. Już po 2 tygodniach inkubacji masa rusztowania wyniosła 95% masy początkowej i spadała liniowo do 6 tygodnia, osiągając wartość około 82% masy początkowej. Po ośmiu tygodniach inkubacji wartość masy rusztowań trójskładnikowych zmalała do wartości około 80% masy początkowej i utrzymała się na tym poziomie do końca eksperymentu. 53

ph 8.3.2. Zmiany ph roztworu Obserwując zmiany ph PBS (rys.38), w którym zostały degradowane materiały, dostrzeżono bezpieczny zakres wartości ph buforu imitującego ludzkie płyny ustrojowe. Analizując wartości zmian ph PBS zauważono, że dodatek cząstek TCP w kompozytach dwuskładnikowych nie wpłynął na wartość ph medium. Zarówno w przypadku PBS, w którym degradowano rusztowania wykonane z polimeru, jak również z kompozytów dwuskładnikowych do 16 tygodnia degradacji obserwowano stałe wartości ph PBS wynoszące około 7,4, co odpowiada początkowemu ph PBS. 9,00 8,50 8,00 7,50 7,00 6,50 6,00 5,50 5,00 4 6 8 12 16 20 Tydzieo PCL PCL-TCP mikro PCL-TCP nano PCL-PLGA-TCP mikro Rys.38. Zmiany ph PBS w czasie 20 tygodniowej degradacji wytworzonych rusztowań. W przypadku degradacji kompozytu trójskładnikowego już w pierwszych sześciu tygodniach obserwowano znaczący spadek wartości ph PBS do wartości około 6,5. Kolejno po ósmym tygodniu inkubacji nastąpił wzrost ph do wartości ok 7, a po 12 i 16 tygodniach degradacji ph PBS osiągnęło wartość odpowiadającą ph PBS, w którym inkubowano macierze polimerowe i implanty wykonane z kompozytów dwuskładnikowych. Dopiero po 20 tygodniach degradacji obserwowano wartość ph PBS równą 7,1 dla wszystkich badanych materiałów. Gwałtowny spadek ph PBS w przypadku kompozytów trójskładnikowych w początkowych tygodniach degradacji był spowodowany hydrolizą szybko degradującego PLGA (uwolnienie kwaśnych produktów hydrolizy). Wartości ph dla wszystkich badanych rusztowań oscylowały w zakresie bezpiecznym dla organizmu ludzkiego. 54

8.3.3. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) Poniżej przedstawiono zdjęcia morfologii powierzchni wytworzonych rusztowań (rys.39) z materiału referencyjnego (rys.39a-b), kompozytów dwuskładnikowych (rys.39c-f) oraz kompozytów trójskładnikowych (rys.39g-h). Na rysunkach 39a,c,e,g obserwowano matryce bezpośrednio po wytworzeniu. Włókna tworzące rusztowania były ułożone równolegle w poszczególnych warstwach obserwowanych na zdjęciach. Charakteryzowały się również prostymi krawędziami. Oznacza to, że proces produkcyjny był powtarzalny. W przypadku kompozytów dwuskładnikowych i trójskładnikowych z mikrocząstkami dostrzeżono równomiernie rozłożone cząstki napełniacza na całej powierzchni każdego z włókien tworzącego rusztowanie. W kompozytach dwuskładnikowych z nanocząstkami napełniacz był również rozłożony równomiernie, jednak obserwowano niewielkie pojedyncze skupiska TCP na powierzchni rusztowania. Na rysunkach 39b,d,f,h obserwowano rusztowania po 20 tygodniach degradacji. W przypadku wszystkich rusztowań kostnych pochodzących z kolejnych etapów degradacji obserwowano włókna ułożone równolegle w każdej z warstw podłoża komórkowego. Włókna posiadały proste krawędzie. Były odpowiednio przytwierdzone, czyli nie odklejały się od siebie w czasie degradacji, co oznacza, że mogą stanowić stabilną podstawę do rozrostu tkanek w ludzkim organizmie. Na rusztowaniach bezpośrednio po wytworzeniu zmierzono również średnicę włókien. Pomiaru średnicy dokonano analogicznie jak w przypadku badanych włókien. Uśrednione średnicę rusztowań wynosiły odpowiednio: 257 µm (rusztowania polimerowe), 212 µm (rusztowania kompozytu dwuskładnikowego z mikrocząstkami), 213 µm (rusztowania kompozytu dwuskładnikowego z nanocząstkami) i 247 µm (rusztowania kompozytu trójskładnikowego). Macierze również były wytwarzane za pomocą igły o średnicy wewnętrznej 250 µm, którą wytworzono włókna. Otrzymane rusztowania charakteryzowały się większą średnicą od badanych włókien, co mogło być wynikiem różnic w lepkości materiałów. Dodatkowo w rusztowaniach włókna były na siebie nakładane, przez co uległy spłaszczeniu na stykach. Powierzchnię włókien rusztowań wykonanych z kompozytów dwuskładnikowych z nanocząstkami bezpośrednio po wytworzeniu przedstawiono na rysunku 40. Tak samo jak w przypadku wcześniej badanych włókien (rys.24) powierzchnia charakteryzowała się fałdami oraz postrzępioną rozwiniętą powierzchnią. Świadczy to o problemach z produkcją nanokompozytów. 55

Rys.39. Zdjęcia SEM rusztowań (a, b) polimerowych, (c, d) kompozytów dwuskładnikowych (mikrocząstki), (e,f) kompozytów dwuskładnikowych (nanocząstki), (g,h) kompozytów trójskładnikowych (a, c,e, g) bezpośrednio po wytworzeniu oraz po (b, d, f, h) 20 tygodniu degradacji; kolejno próbki: A0, A20, D0, D20, G0, G20, J0, J20; (x100). 56

Rys.40. Zdjęcie SEM rusztowania kompozytu o składzie wagowym 90%PCL-10%TCP (nanocząstki) bezpośrednio po wytworzeniu (x1500); próbka G0. Rys.41. Zdjęcia SEM rusztowań kompozytów dwuskładnikowych o składzie wagowym 90%PCL-10%TCP z cząstkami w postaci (a, c, e) mikro i (b, d, f) nano, (a,b) bezpośrednio po wytworzeniu, (c,d) po 6 i (e,f) po 20 tygodniach degradacji (x1000); kolejno próbki: D0, G0, D6, G6, D20, G20. 57

Rys.42. Zdjęcia SEM rusztowań kompozytów trójskładnikowych (a) bezpośrednio po wytworzeniu; po (b) 4, (c) 6 i (d) 16 tygodniach degradacji (x1000); kolejno próbki: G0, G4, G6 i G16. Na rysunku 41 porównano powierzchnie włókien rusztowań kompozytów dwuskładnikowych bezpośrednio po wytworzeniu i pochodzących z 6 oraz 20 tygodni degradacji. Morfologia powierzchni obydwu degradowanych macierzy w porównaniu do rusztowań bezpośrednio po wytworzeniu nie wykazywała zmian. Zmian również nie zaobserwowano podczas całego czasu trwania eksperymentu dla kompozytów dwuskładnikowych. Na rysunku 42 przedstawiono morfologię powierzchni włókien rusztowań trójskładnikowych bezpośrednio po wytworzeniu oraz podczas degradacji, pochodzących z 4, 6 i 16 tygodnia. Zaobserwowano zmiany w morfologii macierzy podczas eksperymentu. Powierzchnia podczas degradacji stała się bardziej rozwinięta. Na powierzchni degradowanych rusztowań od 4 tygodnia dostrzeżono niewielkie otwory widoczne na rysunku 42. Prawdopodobnie są to obszary pozostałe po zdegradowanych mikroinkluzjach PLGA. 58