Pracownia studencka Katedry Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 1 OZNACZANIE RÓŻNYCH FORM AZOTU W PRÓBKACH WODY POWIERZCHNIOWEJ METODAMI SPEKTROFOTOMETRYCZNYMI Nauka o Środowisku Gdańsk, 2012
1. Wstęp Nauka o środowisku Ćwiczenie 1 2 Zawartość azotu ogólnego w próbkach wodnych jest sumą następujących jego form: + - - N og = N NH4 + N NO2 + N NO3 + N org N og - azot ogólny + N NH4 - azot amonowy (amoniak i jego sole) N - NO2 - azot w postaci azotynów (azotanów (III)) - N NO3 - azot w postaci azotanów (azotanów (V)) N org - azot związany ze związkami organicznymi (z aminokwasów, mocznika amin itp.) Istnieje również pojęcie azotu Kjeldahla. Jest to suma azotu amonowego oraz organicznego. Oznacza się go poprzez rozkład związków organicznych w stężonym kwasie siarkowym wobec siarczanu rtęci jako katalizatora. Azot amonowy Azot amonowy występujący w wodach powierzchniowych pochodzi z biochemicznego rozkładu materii organicznej (zarówno roślinnej i zwierzęcej). Antropogenicznym jego źródłem są zrzuty ścieków komunalnych lub przemysłowych (np. z koksowni). W wodach silnie zanieczyszczonych amoniak pochodzi także z biochemicznego procesu redukcji azotanów. W wodach podziemnych również może występować amoniak, na skutek redukcji azotanów i azotynów przez związki redukujące, jak siarkowodór czy piryt (właściwie żelazo). Amoniak jest związkiem niepożądanym w wodach użytkowych, gdyż utrudnia jej chlorowanie i zwiększa korozję rur. Z punktu widzenia sanitarnego jest on wraz z jego pochodnymi potencjalnie szkodliwy. Oznaczenie amoniaku należy wykonać tuż po pobraniu wody, ponieważ szybko się z wody ulatnia. Azotany(V) Azotany(V) występują w wodach powierzchniowych naturalnie (w małych ilościach) oraz wprowadzane są ze ściekami miejskimi, przemysłowymi, z odwodnień kopalń, z pól nawożonych nawozami azotowymi. Azotany(V) przyczyniają się do szybkiej eutrofizacji (zwiększania żyzności) wód powierzchniowych. Proces eutrofizacji jest niekorzystny, nie tylko, jeśli dotyczy zbiorników będących ujęciami wody. W żyznych wodach występują zakwity fitoplanktonu (np. sinic), które zmniejszają dopływ światła dla roślin i zwierząt wodnych, wydzielają toksyny, są przyczyną niedoboru tlenu i zatrucia siarkowodorem. Azotany(V) są produktem utleniania azotu organicznego w obecności tlenu przez bakterie gleby i wody. Azotany(V) występują zwykle w ściekach świeżych, z czasem ulegają redukcji do azotanów(iii) i amoniaku. Za wysokie stężenie azotanów(v) w wodzie do picia może powodować zwiększone zapotrzebowanie na witaminę A, zakłócenia wzrostu. Szczególnie niebezpieczny jest wzrost
3 stężenia azotanów(v) (powyżej 10 mg/l), który powoduje sinicę u niemowląt. Dopuszczalna zawartość azotanów(v) w wodzie do picia wynosi 50 mg/l, jeśli jest spełniony warunek: [azotany(v)]/50+[azotany(iii)]/3 1, gdzie wartości w nawiasach kwadratowych oznaczają stężenie azotanów(v) i azotanów(iii) w mg/l, ponadto, aby stężenie azotanów(iii) w wodzie wprowadzanej do sieci wodociągowej lub innych urządzeń dystrybucji nie przekraczało wartości 0,10 mg/l. Azotany(III) W wodzie naturalnej azotany(iii) występują w bardzo małych ilościach, głównie w wodach z terenów bagnistych i leśnych. Azotany(III) występują w ściekach z rozkładu azotowych związków organicznych i redukcji w środowisku beztlenowym azotanów(v). W trakcie chlorowania łatwo przekształcają się w azotany. Azotany(III) występują w znacznych ilościach w ściekach długo przetrzymywanych w kanalizacji. Azotany(III) nie są trwałe, są produktem przejściowym w cyklu przemian azotu, łatwo przechodzą w azotany(v) lub amoniak. Jeśli są obecne w wodzie, to znaczy, że zachodzą w niej rekcje utleniania i redukcji. Dlatego azotany(iii) powinny być oznaczane razem z azotanami(v). Niekiedy zawartość azotanów(iii) może świadczyć o niekorzystnych procesach zachodzących w wodzie z punktu widzenia sanitarnego. Przekroczenie stężenia azotanów(iii) w wodzie podziemnej powyżej 0,010 mg/l może być wynikiem skażenia jej szczątkami zwierzęcymi. Potwierdzają to również zwiększone ilości chlorków, amoniaku, azotanów(v) oraz zwiększona utlenialność. Szkodliwość azotanów(iii) wynika z możliwości tworzenia nitrozwiązków wywołujących procesy nowotworowe. Dopuszczalna zawartość azotanów(iii) w wodzie pitnej wynosi 0,50 mg/l z zastrzeżeniem jak w przypadku azotanów(v). 2. Oznaczanie azotu całkowitego Zasada pomiaru Organiczne i nieorganiczne związki azotu są zgodnie z metodą Koroleff a przekształcane do azotanów. Badaną próbkę poddaje się działaniu czynnika utleniającego przy jednoczesnym podgrzaniu próbki. Powstałe azotany w środowisku kwasu siarkowego i fosforowego, reagują z 2,6-dimetylofenolem (DMF) tworząc pomarańczowy 4-nitro-2,6-dimetylofenol, który jest oznaczany fotometrycznie. 2.1. Część doświadczalna: 1. Przygotować spektrofotometr do pracy (czas nagrzewania 15 min). Nałożyć rękawice ochronne podczas zajęć stosowane będą silne kwasy. 2. Mineralizacja próbki Do szklanych pustych zakręcanych probówek wprowadzić 5 ml badanej wody. Dodać pół łyżeczki
4 odczynnika N-1K, a następnie 3 krople odczynnika N-2K. Probówkę szczelnie zamknąć a zawartość wymieszać. Ogrzewać przez 1 godzinę w 120 C w termobloku. Następnie wyjąć i zaczekać do ochłodzenia. Po 10 minutach wstrząsnąć krótko kuwetą. 3. Przygotowanie do pomiaru Jeśli próbka jest mętna należy ją zdekantować. Odmierzyć 0,5 ml próbki do szklanej kuwety testowej. Nie mieszać!! Dodać 0,5 ml odczynnika N-3K. Następnie zamknąć szczelnie i wymieszać. Uwaga!! Kuweta robi się gorąca. Odczekać do schłodzenia. 4. Szklana kuweta służy także jako autoselektor. Należy więc wstawić ją do okrągłego gniazda pomiarowego zgodnie z zaznaczonym nacięciem w otworze. Przyrząd samodzielnie wybiera warunki pomiaru a na ekranie pojawia się opis N. Uwagi- Pomiar mętnej próbki daje zawyżone wyniki. Barwa utrzymuje się do pół godziny po przygotowaniu próbki. 3. Oznaczanie azotu amonowego metodą spektrofotometryczną Zasada pomiaru Azot amonowy (NH + 4 _N) występuje częściowo w formie jonów amonowych oraz częściowo jako amoniak. Pomiędzy tymi dwoma formami występuje równowaga zależna od ph. W roztworach silnie zasadowych azot amonowy występuje głównie jako amoniak, który wchodzi w reakcję ze środkiem chlorującym, tworząc monochloroaminę. Ta reaguje z tymolem tworząc zabarwioną na niebiesko pochodną indofenolu, która jest oznaczana fotometrycznie. 3.1. Część doświadczalna: 1. Przygotować spektrofotometr do pomiarów 2. Przygotować próbki do pomiaru Do probówki odmierzyć kolejno 5 ml wody. Dodać 0,6 ml odczynnika NH4-1 i wymieszać. Następnie dodać płaską łyżeczkę odczynnika NH4-2. Energicznie wytrzasać do momentu całkowitego rozpuszczenia odczynnika. Pozostawić na 5 min. Po upływie tego czasu dodać 4 krople odczynnika NH4-3, wymieszać i odczekać kolejne 5 min. 3. Pomiar Włożyć autoselektor do okrągłego otworu spekolu. Na wyświetlaczu powinien pojawić się napis NH4 N. Wstawić kuwetę z badanym roztworem. Uruchomić pomiar i odczytać wynik Uwagi: Próbki nie zawierające amoniaku zmieniają barwę na żółtą po dodaniu odczynnika NH4-3
5 4. Oznaczanie azotanów(iii) metodą spektrofotometryczną Zasada pomiaru Podstawą metody są następujące reakcje: 1. jonów azotanowych(iii) z kwasem sulfanilowym w środowisku kwaśnym (reakcja diazowania), 2NO Ө 2 + 2H 2HNO 2 O=N O N=O + H 2 O O=N O N=O O=N + Ө O N=O HSO 3 Ar NH 2 + O=N HSO 3 Ar NH N=O + H HSO 3 Ar NH N=O HSO 3 Ar N=N OH HSO 3 Ar N=N OH + H HSO 3 Ar N N + H 2 O w wyniku której powstaje sól diazoniowa; 2. soli diazoniowej z dichlorkiem N (1 naftylo)etylenodiaminy (reakcja sprzęgania), w wyniku której powstaje barwnik azowy o kolorze czerwonofioletowym. Reakcja ta jest bardzo czuła i specyficzna dla jonów azotanowych(iii). Zawartość powstałego barwnika oznacza się fotometrycznie i jest ono proporcjonalne do stężenia jonów azotanowych(iii). Metodę tę można zastosować do badania próbek wód podziemnych, wody pitnej, wód powierzchniowych, wód morskich, ścieków, żywności - po odpowiednim przygotowaniu i również gleby - po odpowiednim przygotowaniu. Stosowany w tej metodzie test kuwetowy dla kuwet 10 mm jest przeznaczony dla próbek o stężeniu NO 2 od 0,07 do 3,28 mg/l (od 0,02 do 1,00 mg/l w przeliczeniu na azot z jonu azotanowego(iii), NO 2 -N). Próbki o większym stężeniu jonów azotanowych(iii) muszą być rozcieńczone wodą dejonizowaną. W oznaczaniu azotanów(iii) w wodzie przeszkadzają jony azotanowe(v), należy je wyeliminować! Poza tym zakłócać przebieg oznaczenia mogą inne substancje, z których wymienić należy te, których już niewielkie ilości są przyczyną nieprawidłowych wyników. Są to związki chemiczne
6 zawierające w roztworze: - Ag + w stężeniu powyżej 1 mg/l, 2 - Cr 2 O 7 w stężeniu powyżej 1 mg/l, - Fe 3+ w stężeniu powyżej 1 mg/l, - S 2 w stężeniu powyżej 10 mg/l. Do substancji, które są przyczyną nieprawidłowych wyników należą również związki o właściwościach redukujących w stężeniu powyżej 10 mg/l. Próbki, jeśli to możliwe, powinny być analizowane zaraz po pobraniu. Maksymalny czas przechowywania wynosi 48 godz. w temperaturze 4 C. 4.1. Część doświadczalna: 1. Przygotować spektrofotometr do pomiarów Po włączeniu aparatu odczekać 15 min, aż nagrzeje się lampa. Następnie wprowadzić autoselektor NO 2 albo wprowadzić symbol metody "036", w celu wybrania odpowiednich warunków pomiaru (patrz: Instrukcja obsługi fotometru Spectroquant ) Przeprowadzić kontrolę procesu pomiarowego z zastosowaniem roztworu wzorcowego azotanów(iii). Kontrolę procesu pomiarowego przeprowadza się wykonując pomiar absorbancji mieszaniny reakcyjnej przygotowanej z roztworu wzorcowego o określonym stężeniu jonów NO 2. Wykonanie: 1. Z roztworu wzorcowego azotanów(iii) o stężeniu jonów NO 2 c = 1 g/l sporządzić w kolbie miarowej na 1000 ml roztwór wzorcowy azotanów(iii) o stężeniu jonów NO 2 c = 1 mg/l. 2. Następnie wprowadzić 1 płaską łyżeczkę odczynnika NO - 2 1 (łyżeczka znajduje się wewnątrz pojemnika odczynnika NO 2-1) do szklanej probówki oraz 5,0 ml świeżo przygotowanego roztworu wzorcowego azotanów(iii) o stężeniu jonów NO 2 c = 1 mg/l. 3. Zawartość intensywnie wymieszać aż do całkowitego rozpuszczenia odczynnika. 4. Mieszaninę pozostawić na 10 minut (czas reakcji). 5. Przelać próbkę do kuwety 10 mm i dokonać pomiaru w fotometrze przy długości fali λ = 540 nm. Przeprowadzić analizę dla świeżo pobranej próbki wody powierzchniowej 1. Mętne próbki wody przesączyć przez sączek. 2. Sprawdzić ph wody przy pomocy pasków uniwersalnych. Wartość ph musi być zawarta w przedziale 2 10; jeśli jest inaczej, dla zachowania właściwej wartości ph, należy użyć roztworów kwasu siarkowego(vi) lub wodorotlenku sodu.
7 Wykonanie pomiaru wody badanej: 1. wprowadzić do szklanej probówki 1 płaską łyżeczkę odczynnika NO - 2 1, 2. następnie przy pomocy pipety wprowadzić 5,0 ml próbki wody, 3. Wymieszać intensywnie do momentu całkowitego rozpuszczenia odczynnika, 4. Odstawić na 10 minut (czas reakcji), 5. Przelać próbkę do kuwety 10 mm, 6. Wykonać pomiar w fotometrze przy długości fali λ = 540 nm. Uwagi: - podane proporcje wody badanej i odczynników są odpowiednie do kuwet 10 mm, - kuwety używane do pomiaru muszą być bezwzględnie czyste, - pomiar należy wykonywać w temperaturze 15 25 C, pomiar w temperaturze niższej niż 15 C daje zaniżone wyniki, natomiast w temperaturze powyżej 25 C zawyżone, - mętne roztwory dają zawyżone wyniki, - barwa roztworu po reakcji utrzymuje się przez 60 min, ale wskazane jest wykonywać pomiar zawsze tak samo po 10 min., - pojemniki z odczynnikami zamykać bezpośrednio po użyciu, przechowywać w wymaganych warunkach. 5. Oznaczanie azotanów(v) metodą fotometryczną Zasada pomiaru: Azotany(V) w roztworze zakwaszonym kwasem siarkowym(vi) i fosforowym(v) reagują z 2,6 dimetylofenolem, tworząc roztwór 4 nitro-2,6-dimetylofenolu, który jest oznaczany fotometrycznie. Azotany(V) w obecności stężonego kwasu siarkowego(vi) przechodzą w kwas azotowy(v), który reaguje z kwasem siarkowym w myśl równania reakcji: HNO 3 + 2H 2 SO 4 + NO 2 + H 3 O + + 2HSO 4 Następnie zachodzi reakcja nitrowania 2,6-dimetylofenolu: Powstały 4 nitro-2,6-dimetylofenol absorbuje promieniowanie elektromagnetyczne o długości fali 320 nm.
8 W oznaczaniu azotanów(v) w wodzie przeszkadzają jony chlorkowe o stężeniu większym niż 1000 mg/l oraz jony azotanowe(iii) o stężeniu większym niż 50 mg/l. Fotometryczne oznaczanie azotanów(iii) z 2,6-dimetylofenolem może być stosowane do próbek o zawartości jonów NO 3 od 1 do 110 mg/l. 5.1. Część doświadczalna: 1. Przygotować spektrofotometr do pomiarów Po włączeniu aparatu odczekać 15 min, aż nagrzeje się lampa, następnie wprowadzić autoselektor NO 3 dla wybrania odpowiednich warunków pomiaru (patrz: Instrukcja obsługi fotometru Spectroquant ). Wykonanie: 1) Przeprowadzić analizę dla świeżo pobranej próbki wody powierzchniowej. 2) Mętne próbki wody przesączyć przez sączek. 3) Przy pomocy pipety wprowadzić do szklanej probówki z korkiem 4,0 ml odczynnika NO - 3 1. 4) Dodać za pomocą pipety 0,5 ml analizowanej próbki wody (Nie mieszać!). 5) Dodać do probówki za pomocą pipety 0,5 ml odczynnika NO - 3 2 (Uwaga!!! Po wprowadzeniu odczynnika NO - 3 2 probówka zrobi się gorąca). Zamknąć probówkę korkiem i wymieszać. Mieszaninę pozostawić na 10 minut (czas reakcji). Pomiar spektrofotometryczny: - przelać próbkę do kuwety 10 mm i dokonać pomiaru w fotometrze przy długości fali λ = 320 nm.