MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 255-261 Natalia Rokosz 1, Waldemar Rastawicki 1, Marek Jagielski 1, Zofia Hetkowska- Abramczyk 2 Wykrywanie przeciwciał dla pałeczek Campylobacter jejuni u dzieci z zespołem Guillain-Barré przy zastosowaniu różnych preparatów antygenowych 1 Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego- Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski 2 Zakład Mikrobiologii Samodzielnego Publicznego Specjalistycznego Szpitala Zachodniego im. Jana Pawła II w Grodzisku Mazowieckim Kierownik: mgr Z. Hetkowska-Abramczyk Oceniono częstość występowania swoistych przeciwciał dla pałeczek Campylobacter jejuni w próbkach surowicy hospitalizowanych dzieci z zespołem Guillain-Barré (GBS). Poziom przeciwciał oceniano testem ELISA, w którym zastosowano cztery różne preparaty antygenowe. Stwierdzono, że badanie serologiczne w kierunku zakażeń C. jejuni, przeprowadzone zwłaszcza przy użyciu wysoce swoistych rekombinowanych białek, może być przydatnym narzędziem w diagnostyce zespołu GBS wywołanego przez ten patogen. Pałeczki z rodzaju Campylobacter jejuni to Gram-ujemne, mikroaerofilne bakterie szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, wywołujące u człowieka odzwierzęcą chorobę nazwaną kampylobakteriozą. Kampylobakterioza przebiega najczęściej pod postacią zapalenia żołądka i jelit lub zapalenia jelit (1,14,17). Do charakterystycznych objawów chorobowych należą: wodnisto- śluzowa biegunka często z obecnością krwi w kale, nudności, wymioty, ból brzucha, podwyższona temperatura ciała. Wcześniej przeprowadzone badania wykazały związek pomiędzy przebytym zakażeniem pałeczkami C. jejuni a występowaniem powikłań neurologicznych, takich jak zespół Guillain-Barré i zespół Miller-Fisher (1,9,11,15,17,20). Częstość występowania zespołu Guillain-Barré jest obliczana na 1-2 przypadków rocznie na 100 tys. osób (3,4). Według tych samych źródeł nawet do 40% przypadków zespołu Guillain-Barré może być wynikiem wcześniejszego zakażenia pałeczkami C. jejuni, najczęściej reprezentującymi serotyp O:19 (11). Wcześniejsze prace wykazały przydatność poszukiwania przeciwciał dla pałeczek C. jejuni w diagnostyce zespołu Guillain-Barré (1,7,13,15). W badaniach tych jako antygenów używano: sonikatu całych komórek pałeczek C. jejuni, ciepłostałego antygenu, białek C. jejuni ekstrahowanych glicyną w środowisku kwaśnym, wyizolowanych białek błony zewnętrznej czy też lipopolisacharydu uzyskanego metodą ekstrakcji komórek Campylobacter mieszaniną fenolu i wody (1,15,17,22). Jednakże, jak dotąd nie opracowano dobrze
256 N. Rokosz i inni Nr 3 wystandaryzowanego odczynu ELISA, wykonywanego przy zastosowaniu jednego wybranego antygenu, który mógłby być użyty w rutynowej diagnostyce zespołu Guillain-Barré (10). Dlatego, też celem podjętych badań była próba odpowiedzi na pytanie, jaki preparat antygenowy należy zastosować w testach serologicznych w celu potwierdzenia przebytej infekcji pałeczkami C. jejuni, skutkującej powikłaniami neurologicznymi. MATERIAŁ I METODY Próbki surowicy. Głównym przedmiotem badań było 8 próbek surowicy uzyskanych od 6 dzieci w wieku od 4-16 lat z rozpoznanym zespołem Giullain- Barré. Od dwojga dzieci uzyskano po dwie próbki surowicy w różnych okresach choroby natomiast od 6 po jednej próbce. U wszystkich sześciu dzieci, przed wystąpieniem objawów neurologicznych, potwierdzono występowanie zaburzeń ze strony układu pokarmowego, takich jak ból brzucha czy biegunka. Wcześniej przeprowadzone badania nie wykazały u nich obecności przeciwciał dla innych patogenów związanych z występowaniem GBS takich jak cytomegalowirus, Mycoplasma pneumoniae czy wirus Epstein-Barr (4,19,21). Dodatkowo, badaniom poddano 5 próbek surowicy uzyskanych od osób z bakteriologicznie potwierdzoną kampylobakteriozą oraz 22 próbki uzyskane od zdrowych klinicznie osób - krwiodawców. Odczyny serologiczne. W badaniach wykorzystano zarówno komercyjny test ELISA jak i test ELISA opracowany we własnym zakresie: 1. Komercyjny test ELISA firmy Mikrogen (recomwell Campylobacter jejuni/campylobacter coli). Jako antygen producent zastosował preparat rekombinowanych białek: PEB 4, OMP18, P39 C.jejuni/C.coli. Badania przeprowadzono zgodnie z procedurą opisaną uprzednio poszukując przeciwciał w klasie immunoglobulin A i G (14). 2. Test ELISA Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH. Test wykonywano na płytkach polistyrenowych firmy Nunc zgodnie z metodyką opisaną w poprzednich publikacjach, oznaczając poziom przeciwciał klasy IgA, IgG oraz IgM (9). Jako antygeny w odczynie ELISA wykorzystano trzy różne preparaty uzyskane z pałeczek C. jejuni: 2.1. Antygen LPS wg zmodyfikowanej metody Boivina. Użyto oczyszczonego lipopolisacharydowego antygenu pałeczek C. jejuni (szczep z kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH nr 33/06) uzyskanego we własnym zakresie zmodyfikowaną metodą Boivina (18). Użyty szczep namnażano 48 godzin na podłożu Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej (firmy Oxoid) w warunkach mikroaerofilnych. W wyniku przeprowadzonego miareczkowania metodą szachownicy ustalono stężenie antygenu LPS na 5 μg/ml. 2.2. Termostabilny antygen. Zastosowano oczyszczony, termostabilny antygen pałeczek Campylobacter jejuni (szczep z kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH nr 129/07; Penner O:1, który wyizolowano z kału osoby z zespołem GBS) uzyskany we własnym zakresie według metody opisanej przez Strid i wsp. (9,17). 2.3. Antygen pełnokomórkowy firmy Virion/Serion). W odczynie ELISA wykorzystano pełnokomórkowy antygen pałeczek Campylobacter jejuni firmy Virion/Serion przeznaczony do odczynu wiązania dopełniacza (numer katalogowy 1206). Antygen C. jejuni użyto w rozcieńczeniu 1:400. W celu wyznaczenia diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał w odczynie ELISA NIZP-PZH, w przypadku użycia każdego preparatu antygenowego, wyznaczono
Nr 3 Przeciwciała dla C. jejuni u dzieci z GBS 257 wartość cut-off, obliczoną na podstawie wyników badania próbek surowicy uzyskanych od krwiodawców (średnia wartość arytmetyczna plus trzy odchylenia standardowe). Statystyczne opracowanie wyników. Istotność różnic w częstości wykrywania przeciwciał w próbkach surowicy osób z GBS, osób z bakteriologicznie potwierdzoną kampylobakteriozą i krwiodawców oceniano dokładnym testem Fishera. Za statystycznie znamienne przyjęto różnice, gdzie poziomy istotności były mniejsze od 0,05 (p<0,05). WYNIKI Przeprowadzone badania wykazały, że najczęściej w próbkach surowicy dzieci z GBS wykrywano podwyższony poziom przeciwciał dla antygenów LPS we wszystkich trzech klasach immunoglobulin. W przypadku użycia odczynu ELISA, w którym zastosowano pozostałe preparaty antygenowe, wykrywano najczęściej przeciwciała klasy IgG, rzadziej przeciwciała klasy IgA i IgM (Tabela I). Tabela I. Porównanie częstości występowania przeciwciał dla różnych antygenów pałeczek Campylobacter jejuni u osób z zespołem Guillain-Barré (GBS), osób z jelitową postacią kampylobakteriozy oraz osób klinicznie zdrowych (krwiodawców). Badana grupa osób (liczba) Osoby z GBS (6) Osoby z kampylobakteriozą (5) Krwiodawcy (22) Liczba próbek surowicy, Antygen w których wykryto przeciwciała w klasie: IgA IgG IgM białka rekombinowane (Mikrogen) 2 4 n.b. antygen pełnokomórkowy (Virion/Serion) 0 5 4 termostabilny antygen wg Strid 1 4 1 antygen LPS wg Boivina 6 6 5 białka rekombinowane (Mikrogen) 2 5 n.b. antygen pełnokomórkowy (Virion/Serion) 1 5 0 termostabilny antygen wg Strid 1 2 1 antygen LPS wg Boivina 5 5 5 białka rekombinowane (Mikrogen) n.b. n.b. n.b. antygen pełnokomórkowy (Virion/Serion) n.b. n.b. n.b. termostabilny antygen wg Strid 2 0 3 antygen LPS wg Boivina 3 5 4 W próbkach surowicy uzyskanych od osób z grup kontrolnych, tj. od osób chorych z bakteriologicznie potwierdzoną kampylobakteriozą oraz osób klinicznie zdrowych - krwiodawców, również najczęściej wykrywano przeciwciała klasy IgA, IgG i IgM dla lipopolisacharydowych antygenów pałeczek C. jejuni oraz przeciwciała klasy IgG w przypadku użycia pozostałych preparatów antygenowych (Tabela I). Statystyczna analiza znamienności różnic między wynikami oznaczeń poziomu przeciwciał w próbkach surowicy osób z GSB i osób z bakteriologicznie potwierdzoną kampylobakteriozą wykazała, że swoiste przeciwciała wykrywane były podobnie często u osób z obydwu grup (p>0,5). Stwierdzono także, że przeciwciała dla antygenu LPS były statystycznie istotnie częściej wykrywane u osób chorych z GSB i kampylobakteriozą niż
258 N. Rokosz i inni Nr 3 u osób klinicznie zdrowych krwiodawców (p<0,05). Nie wykazano natomiast tej statystycznej istotności w przypadku użycia w odczynie ELISA termostabilnego antygenu wg Strid. W tabeli II przedstawiono poziom przeciwciał dla różnych preparatów antygenowych C. jejuni w próbkach surowicy uzyskanych w ostrym i przewlekłym okresie choroby od dwóch pacjentów z zespołem Guillain-Barré (GBS). U obydwu osób wykryto odczynem ELISA diagnostycznie znamienny spadek poziomu przeciwciał w drugiej próbce surowicy, uzyskanej po 4-8 tygodniach od pierwszej, z tym, że istniały dość istotne różnice w jego dynamice w zależności od użytego antygenu. (Tabela II). Tabela II. Poziom przeciwciał dla różnych preparatów antygenowych C. jejuni w próbkach surowicy uzyskanych w różnych okresach choroby od dwóch pacjentów z zespołem Guillain-Barré (GBS). Pacjent/ wiek Nr próbki Białka rekomb. (Mikrogen) Antygen LPS wg Boivina Termostabilny antygen wg Strid Antygen pełnokom. (Virion/Serion) IgA IgG IgA IgG IgM IgA IgG IgM IgA IgG IgM J.S. 1 54,6 653,4 1,4 1,0 1,8 1,2 1,2 0,8 0,4 0,9 0,5 10 lat 2 16,6 165,1 0,5 0,7 1,4 1,2 1,3 0,9 0,2 0,5 0,4 W.S. 1 24,1 107,3 0,6 1,1 1,0 1,0 1,2 0,7 0,3 1,1 0,5 4 lata 2 5,7 68,4 0,3 0,6 0,6 0,1 0,1 0,1 0,3 1,1 0,4 Wartość cut-off > 24 > 24 0,3 0,3 0,4 1,3 1,1 1,4 0,7 0,3 0,4 DYSKUSJA Mechanizmem inicjowania zespołu GBS, w przypadku zakażenia pałeczkami Campylobacter jejuni, jest mimikra antygenowa, prowadząca do syntezy autoprzeciwciał dla gangliozydów nerwów obwodowych (2,5,20,22). Wykazano, że lipopolisacharyd (LPS) C. jejuni zawiera kilka epitopów reagujących krzyżowo z autoprzeciwciałami obecnymi u chorych z GBS (8). Jednakże przeciwciała dla gangliozydów nerwów obwodowych mogą być indukowane również przez inne patogeny, takie chociażby jak CMV, M. pneumoniae czy H. influenzae (4,19,21). Tak więc, potwierdzenie obecności tych przeciwciał u osób z zaburzeniami neurologicznymi może być pomocne w diagnostyce zespołu GBS chociaż nie można na ich podstawie zdiagnozować pierwotnej przyczyny ich wystąpienia. Przeprowadzone badania wykazały obecność przeciwciał dla różnych antygenów pałeczek Campylobacter w próbkach surowicy osób z GBS. Prawdopodobny udział pałeczek Campylobacter w wywołaniu powikłań neurologicznych u tych dzieci potwierdzają również dane z wywiadu klinicznego, mówiące o wcześniejszym wystąpieniu u nich zaburzeń żołądkowo jelitowych. Wyniki naszych badań wykazały, że najczęściej w surowicy osób z GBS wykrywane są przeciwciała dla antygenów lipopolisacharydowych. Niestety, przeciwciała te stwierdzano również stosunkowo często u osób klinicznie zdrowych. Być może jest to związane z niższą swoistością LPS niż białek obecnych w komórkach pałeczek Campylobacter. Wskazywać na to może również wyższa swoistość testu ELISA, w którym zastosowano pozostałe preparaty antygenowe, oparte głównie o komponenty białkowe. Co więcej, jak wynika z przeglądu
Nr 3 Przeciwciała dla C. jejuni u dzieci z GBS 259 piśmiennictwa, zostały opisane nieswoiste reakcje krzyżowe nie tylko pomiędzy antygenami pałeczek Campylobacter jejuni a przeciwciałami dla pałeczek Yersinia sp. i Salmonella sp. ale również z przeciwciałami dla takich patogenów jak Escherichia coli, Helicobacter pylori, Shigella sp., Vibrio cholerae czy nawet Legionella pneumophila (1). Zaobserwowane reakcje krzyżowe mogą wynikać z podobieństwa lipopolisacharydów tych bakterii, gdyż jest on jednym z głównych immunogenów wielu bakterii Gram-ujemnych (8). W celu poprawy czułości i swoistości odczynu ELISA wielu badaczy postanowiło zastosować do serodiagnostyki kampylobakteriozy i jej powikłań preparaty rekombinowanych białek C. jejuni (7). Między innymi Schmidt Ott i wsp. (15) wykazali, że odczyn ELISA, w którym jako antygenu użyto dwóch rekombinowanych białek P39 i P18, odznaczał się wysoką 91,9 % czułością i 99,0 % swoistością (15). Autorzy Ci uważają, że wysoki poziom przeciwciał dla pałeczek C. jejuni utrzymuje się dłużej u osób z kampylobakteriozą niż u osób z GBS będącego powikłaniem tej choroby. Ponadto stwierdzili oni, że obecność przeciwciał klasy IgA u osoby chorej na GBS może świadczyć o niedawno przebytym zakażeniu pałeczkami C. jejuni. Według Ang i wsp. (1) wysokie miano przeciwciał klasy IgA i IgM jest oznaką ostrej infekcji, natomiast poziom przeciwciał klasy IgG utrzymuje się nawet przez kilka lat i nie może być jedynym kryterium potwierdzenia obecnego zakażenia. W związku z tym wydaje się, że słuszne byłoby stwierdzenie, że w próbkach surowicy od osób z GBS należałoby poszukiwać immunoglobulin wszystkich trzech klas, co dałoby możliwość bardziej wiarygodnej interpretacji wyniku badania serologicznego. Niezmiernie istotne jest również wykrycie serokonwersji w dwóch próbkach surowicy uzyskanych w różnych okresach choroby. Według producenta test ELISA firmy Mikrogen, oparty na rekombinowanych białkach swoistych dla pałeczek Campylobacter, charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością. Niestety w przypadku tego testu producent nie przewidział możliwości oznaczania przeciwciał klasy IgM dla C. jejuni/c. coli. W przeprowadzonych przez nas badaniach wykryliśmy przy użyciu tego testu znaczny spadek poziomu przeciwciał, zarówno klasy IgA jak i IgG, w drugiej próbce surowicy uzyskanej od pacjenta z GBS. Ponieważ uzyskanie takich wyników, zgodnie z powszechnie przyjętą zasadą w badaniach serologicznych, może świadczyć o aktualnym zakażeniu bakteryjnym, test ELISA firmy Mikrogen wydaje się być przydatnym narzędziem w serodiagnostyce kampylobakteriozy i jej powikłań. Znacznie słabsza serokonwersja uzyskana w odczynie ELISA przeprowadzonym przy użyciu pozostałych antygenów może być spowodowana ich niższą swoistością. Jest to szczególnie istotne w przypadku zespołu GBS, kiedy to osobom chorym podaje się wysokie dawki immunoglobulin (IVIG), mogące zaburzać wynik badania serologicznego (5,12). Ujemny wynik badania serologicznego nie musi świadczyć o braku zakażenia wywołanego przez pałeczki Campylobacter jejuni. Kaldor i wsp. (10) wykazali, że poziom przeciwciał dla pałeczek C. jejuni w mianie diagnostycznie znamiennym był wykrywany u 58% badanych pacjentów z kampylobakteriozą dopiero w 6-7 dniu od daty wystąpienia objawów klinicznych. Natomiast aż u 79% osób znamienny poziom przeciwciał był wykrywany w 10 dniu od wystąpienia objawów zakażenia. Poziom przeciwciał w klasach IgA i IgM wzrastał do 10 dnia i gwałtownie spadał w przeciągu następnych 7 dni. Poziom przeciwciał klasy IgG wzrastał powoli w ciągu pierwszych 2 tygodni osiągając najwyższy poziom w 3 tygodniu choroby. Przeciwciała klasy IgG utrzymywały się na wykrywalnym poziomie jeszcze przez kilka kolejnych miesięcy.
260 N. Rokosz i inni Nr 3 Wyniki przeprowadzonych badań potwierdzają, iż serodiagnostyka w przypadku pacjentów z zespołem Gullain- Barré indukowanym zakażeniem pałeczkami C. jejuni może odgrywać istotną rolę w rozpoznaniu etiologii choroby. Szczególnie przydatne wydają się być odczyny serologiczne z wykorzystaniem jako antygenu wysoce swoistych rekombinowanych białek. N. Rokosz, W. Rastawicki, M. Jagielski, Z. Hetkowska- Abramczyk Detection of antibodies to Campylobacter jejuni in pediatrics patients with Gullain-Barré syndrome using different antigen preparations SUMMARY Diagnosis of previous C. jejuni infections in GBS patients are mostly based on serological findings. However, there are not consensus what kind of antigen should be used in the serological assays. In our study we used ELISA with four different antigen preparations for investigation of specific antibodies to C. jejuni in serum samples obtained from 6 children with GBS. In all patients the high level of IgA and IgG antibodies to LPS were diagnosed. The antibodies in particular classes of immunoglobulins to recombinant proteins (Mikrogen), termostabile antigen and whole-cell antigen (Virion/Serion) of C. jejuni were diagnosed only in some of the children with GBS. However, in comparison to the control groups, the ELISA with recombinant proteins was most specific. Moreover, in two of the patients a characteristic decline of the level of antibodies to recombinant proteins in sera obtained in acute and chronic phase of disease have been observed. The results of this study showed that serodiagnosis, specially based on recombinant antigens, may be a reliable marker of recent or previous infection caused by C. jejuni in patients with GBS. PIŚMIENNICTWO 1. Ang C, Krogfelt K, Herbrink P i inni. Validation of an ELISA for the diagnosis of recent Campylobacter infections in Guillain- Barré and reactive arthritis patients. Clin Microbiol Infect 2007, 14: 915-22. 2. Bugla-Płoskońska G. Organizacja struktur zewnętrznych bakterii Gram ujemnych a proces aktywacji układu immunologicznego. Post Mikrobiol 2008, 47: 191-7. 3. D Alessandro R, Casmiro M, Guarino M. Study group on clinical and epidemiological problems in neurology. J Neurol 1999; 246:1004-1009. 4. Drac H. Ostra zapalna polineuropatia demielinizacyjna i aksonalna - zespół Guillaina-Barrégo. Pol Przegl Neurol 2009, 5: 61-7. 5. Grygorczuk S, Zajkowska J, Kondrusik M i inni. Zespół Guillaina- Barrégo związek z czynnikami zakaźnymi. Neurol Neurochir Pol 2005;39:230-6. 6. Hänel I, Alter T, Backert S. 25th Janear Symposium: Campylobacter Infections. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz, 2008, 51:1347-52. 7. (Chapter 13). Jacobs B, Belkum A, Endtz H. Guillain-Barré syndrome and Campylobacter infection. Campylobacter, 3rd ed. Edited by I. Nachamkin, Ch.M. Szymański i M.J Blaser, ASM, Washington 2008, 245-260. 8. Jacobs B, van Doorn P, Schmitz P i inni. Campylobacter jejuni infections and anti-gm1 antibodies in Guillain-Barré syndrome. Ann Neurol 1996, 40:181-7.
Nr 3 Przeciwciała dla C. jejuni u dzieci z GBS 261 9. Jakubczak A, Rastawicki W, Jagielski M. Wykorzystanie odczynu ELISA w serologicznej diagnostyce kampylobakteriozy. Med Dośw Mikrobiol 2007; 59:359-70. 10. Kaldor J, Speed B. Guillain Barré syndrome and Campylobacter jejuni. Br Med J 1984;288: 1867-70. 11. Koga M, Ang C, Yuki N i inni. Comparative study of preceding Campylobacter jejuni infection in Guillain- Barré syndrome in Japan and The Netherlands. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2001; 70:693-5. 12. Lipowska M, Kwieciński H. Zespół Guillaina Barrégo. Przew Lek 2006; 9: 59-65 13. Mishu B, Amjad A, Koski C i inni. Serologic evidence of previous Campylobacter jejuni infection in patients with the Guillain Barré syndrome. Ann Inter Med 1993, 118: 947-53. 14. Rokosz N, Rastawicki W, Jagielski M. Ocena przydatności komercyjnego testu recomwell Campylobacter do rutynowej serodiagnostyki zakażeń wywoływanych przez pałeczki Campylobacter jejuni i Campylobacter coli. Med Dośw Mikrobiol 2008,60:289-95. 15. Schmidt-Ott R, Schmidt H, Feldmann S i inni. Improved serological diagnosis stresses the major role of Campylobacter jejuni in triggering Guillain Barré syndrome. Clin Vacc Immunol 2006, 13:779-83. 16. Strid M, Engberg J, Larsen L i inni. Antibody responses to Campylobacter infections determined by an enzyme-linked immunosorbent assay:2-year follow-up study of 210 patients. Clin Diag Lab Immunol 2001; 8:314-19. 17. Svedhem A, Kaijser B. Campylobacter fetus subspiecies jejuni: a common cause of diarrhea in Sweden. J Infect Dis 1980; 142:353-9. 18. Szych J. Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej. Ocena przydatności odczynów nowej generacji do wykrywania przeciwciał dla wybranych O antygenów pałeczek Salmonella i Yersinia oraz antygenu wspólnego pałeczkom jelitowym. Warszawa, 1993, 37-9. 19. Tam C, O Brien S, Petersen I i inni. Guillain- Barré syndrome and preceding infection with Campylobacter, influenza and Epstein-Barr virus in the general practice research database. PLoS ONE 2007, 2:e344 20. Taylor B, Williamson J, Jones D i inni. Utility of serum Campylobacter specific antibodies in determining prior Campylobacter infection in neurological disease. J Clin Neurosci 2007, 14:116-21. 21. Taylor B, Williamson J, Luck J i inni. Sensitivity and specificity of serology in determining recent acute Campylobacter infection. Intern Med J 2004, 34:250-8. 22. Yuki N. Carbohydrate mimicry: a new paradigm of autoimmune diseases. Curr Opin Immun 2005; 17:577-82. Otrzymano: 29.08.2011r. Adres autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24 Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie.