Ćwiczenie 1. OZNACZANIE PESTYCYDÓW W WODACH 1. Wiadomości ogólne dotyczące pestycydów Pestycydy (łac. pestis zaraza, pomór, caedo zabijam) ogół substancji pochodzenia naturalnego lub uzyskanych na drodze syntezy, stosowanych do zwalczania niepożądanych organizmów. Używane są głównie w rolnictwie do ochrony roślin uprawnych, lasów, zbiorników wodnych, ale również zwierząt, ludzi, czy produktów żywnościowych, a także do niszczenia żywych organizmów, uznanych za szkodliwe, w budynkach inwentarskich, mieszkalnych, szpitalnych i magazynach. Podział pestycydów w zależności od kierunku zastosowania: - Zoocydy - środki do zwalczania szkodników zwierzęcych, np. insektycydy (Karbaryl), - Fungicydy - środki grzybobójcze (Nimrod, Topsin). - Herbicydy - środki chwastobójcze (Roundup). - Regulatory wzrostu - środki stymulujące lub hamujące procesy życiowe roślin. - Atraktanty - środki zwabiające. - Repelenty - środki odstraszające. Podział pestycydów pod względem chemicznym: - Pestycydy nieorganiczne np. insektycyd arsenian ołowiu PbHAsO4, herbicyd amidosulfonian amonu H2NS(O2)ONH4, fungicyd zasadowy chlorek miedzi(ii) 3Cu(OH)2 CuCl2 H2O - Pestycydy organiczne np. pestycydy chloroorganiczne (HCH, DDT, metoksychlor), fosforoorganiczne (monokrotofos), pochodne kwasu fenoksyoctowego, (2,4-D; 2,4-DB; 2,4,5-T), pochodne triazynowe (symazyna, atrazyna) Stosowanie pestycydów przynosi wiele niewątpliwych korzyści, do których można zaliczyć m.in. zwiększenie plonów upraw rolniczych dzięki ograniczaniu chorób roślin oraz niszczeniu patogenów, czy chwastów oraz zmniejszenie strat żywności w trakcie magazynowania i transportu. Niestety ich stosowanie ma też negatywne skutki. Ponieważ wykazują one dużą trwałość, ulegają akumulacji w środowisku oraz bioakumulacji. Sprzyja też temu duża ich mobilność w środowisku naturalnym człowieka. Kumulacja szkodliwych pozostałości po stosowanych zabiegach zależy od gatunku rośliny, rodzaju pestycydu, wielkości dawki oraz sposobu aplikacji. Do organizmu człowieka pestycydy przenikają głównie przez przewód pokarmowy, a dostarczone jednorazowo dawki tych środków nie są na ogół szkodliwe, jednak nawet niewielka ich ilość przyjmowana stale, kumuluje się w organizmie i staje się niebezpieczna. Z uwagi na wspomniane właściwości szczególnie narażone na obecność pestycydów są zbiorniki i cieki wodne, w tym te, które są źródłem wody pitnej. Choć wiele spośród pestycydów zostało wycofanych z użycia w wielu krajach, to jednak są one nadal produkowane i stosowane w wielu krajach rozwijających się. Z uwagi na dosyć wysoką lotność niektórych pestycydów rozsiane na polach uprawnych i plantacjach w krajach tropikalnych przedostają się stosunkowo łatwo do atmosfery i transportowane wraz z masami powietrza w kierunku biegunów, trafiają z opadami atmosferycznymi do gleb strefy umiarkowanej. Największy problem stanowią tu pozostałości pestycydów chloroorganicznych takich, jak DDT i jego metabolity (p,p -DDE i p,p -DDD) oraz stereoizomery heksachlorocykloheksanu, heptachlor, aldryna i dieldryna. Biorąc pod uwagę powyższe, kontrola poziomu pozostałości pestycydów w żywności jest ciągle konieczna. Wybór odpowiedniej metody analitycznej do oznaczania pozostałości pestycydów 1
zależy głównie od rodzaju produktu spożywczego poddanego badaniu, tzw. matrycy, oraz od jego natury chemicznej. Przed przystąpieniem do oznaczania analitów, należy wykonać wiele czynności poprzedzających ten proces, do których należą: właściwe pobranie próbki, ekstrakcja pestycydów z próbki, oczyszczanie ekstraktu oraz jego odpowiednie przygotowanie i dopiero na końcu identyfikacja odpowiednio dobraną techniką badawczą. Metodami chromatograficznymi, służącymi do oznaczania pestycydów mogą być zarówno chromatografia gazowa (GC), która jest stosowana najczęściej, jak i chromatografia cieczowa (HPLC). 2. Ogólne zasady postępowania przy oznaczaniu pestycydów w wodach Pestycydy występują w wodach na stosunkowo niskich poziomach stężeń. Dlatego niezbędny jest etap izolacji pestycydów ze skomplikowanej matrycy wodnej oraz etap wzbogacania przed ostatecznym oznaczeniem końcowym. Schemat poniżej pokazuje typowe etapy postępowania przy analizie śladowych ilości pestycydów: Metody izolacji (wzbogacania) pestycydów z próbek wody. Metodą najczęściej wykorzystywaną przy przygotowaniu próbki do analizy jest ekstrakcja do fazy stałej (SPE) oraz pewna jej odmiana mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME). Zasada ekstrakcji w SPE polega na wykorzystaniu zjawiska podziału związków między dwie fazy: stałą i ciekłą. W pierwszym etapie anality są zatrzymywane na 2
powierzchni złoża sorbentu przy czym muszą mieć większe powinowactwo do fazy stałej niż do matrycy próbki. Ekstrakcja do fazy stałej umożliwia przechowywanie analitów niestabilnych lub o dużej lotności na powierzchni stałego sorbentu oraz wykonywanie reakcji derywatyzacji między aktywnymi grupami analitu i sorbentu. Właściwy proces ekstrakcji analitów do fazy stałej jest zwykle poprzedzony etapem kondycjonowania złoża sorbentu. Proces ten polega na przygotowaniu powierzchni sorbentu do efektywnej izolacji i wzbogacania analitów z wody. W wyniku kondycjonowania sorbentu centra aktywne złoża ulegają aktywacji np. w przypadku żelu krzemionkowego modyfikowanego fazą oktadecylową skręcone łańcuchy ulegają rozprostowaniu, tworząc na powierzchni sorbentu swego rodzaju szczotkę o znacznie powiększonej powierzchni aktywnej. Należy zwrócić uwagę, aby ten sam rozpuszczalnik był stosowany zarówno do kondycjonowania, jak i do elucji analitów z powierzchni sorbentu po wzbogaceniu. W praktyce kondycjonowanie przeprowadza się przez przepłukanie złoża niewielką objętością rozpuszczalnika lub rozpuszczalników organicznych oraz rozpuszczalnika o właściwościach najbardziej zbliżonych do właściwości matrycy badanej próbki (wody dejonizowanej w przypadku próbek wodnych). Oddzielenia analitów od zanieczyszczeń w trakcie SPE można dokonać na trzy sposoby - poprzez: ekstrakcję selektywną - na sorbencie w trakcie wzbogacania są zatrzymywane jedynie oznaczane związki organiczne, a pozostałe przechodzą przez złoże bez zatrzymywania, selektywne wymywanie zanieczyszczeń - w trakcie płukania złoża sorbentu są wymywane zanieczyszczenia, a oznaczane anality pozostają na złożu i są wymywane innymi rozpuszczalnikami, selektywne wymywanie analitu - wymywanie oznaczanych związków przy jednoczesnym pozostawaniu na złożu sorbentu związków stanowiących zanieczyszczenie. Najczęściej stosuje się ekstrakcję takimi rozpuszczalnikami, jak: dichlorometan, pentan, aceton, metanol, izopropanol, octan etylu, heksan, acetonitryl, izooktan lub ich mieszaniny. Najbardziej skutecznym rozpuszczalnikiem do wymywania zaadsorbowanych pestycydów ze złoża sorbentu jest metanol ze względu na swoją dużą siłę eluotropową. Oznaczanie pestycydów. Metoda HPLC stosowana w przypadku oznaczania związków polarnych, a przede wszystkim niestabilnych chemicznie i nietrwałych. Metody GC można stosować zarówno w przypadku związków polarnych, jak i niepolarnych, jednakże muszą one cechować się lotnością albo dawać się przekształcić w związki lotne (derywatyzacja). Derywatyzacja daje możliwość jednoczesnego oznaczenia pestycydów z różnych grup. Ważnym elementem analizy jest właściwa detekcja rozdzielanych związków. Najczęściej używanymi detektorami do oznaczania pozostałości pestycydów są detektory: spektrometru mas, wychwytu elektronów, płomieniowojonizacyjny, płomieniowo-fotometryczny czy termojonowy, czuły na związki azoto- i fosforoorganiczne. W przypadku analizy pestycydów chloroorganicznych naturalnym jest stosowanie detektora wychwytu elektronów (ECD ang. Electron capture detector). ECD wykorzystuje absorpcje elektronów w fazie gazowej przez cząsteczki elektronofilowe. Podstawowym jego elementem jest komora jonizacyjna z dwoma elektrodami. W komorze umieszczone jest źródło radioaktywne emitujące promieniowanie β (elektrony). Elektrony pierwotne emitowane przez źródło zderzają się z cząsteczkami gazu w detektorze, powodując jonizację połączoną z emisją wtórnych elektronów i tworzeniem jonów dodatnich: β + M β + M + + e gdzie: M oznacza cząsteczka gazu, e elektron. 3
Pomiędzy elektrody w komorze przyłożone jest pewne napięcie. W wytworzonym polu elektrycznym elektrony szybko migrują do anody, co powoduje stały przepływ prądu o natężeniu kilku na. Prawdopodobieństwo rekombinacji jonów dodatnich z wolnymi elektronami jest znikomo małe. Wielkość prądu płynącego prze detektor ulega zmniejszeniu, jeśli przez detektor przechodzą cząsteczki wykazujące powinowactwo do elektronów. W takim przypadku zachodzi absorpcja wolnych elektronów przez te cząsteczki, zgodnie z jednym z równań: AB + e AB + hν AB + e A + B - W efekcie prąd płynący przez detektor ulega zmniejszeniu, co jest sygnałem pomiarowym. Czułość i selektywność detektora wychwytu elektronów zależą od powinowactwa elektronowego związków. W przypadku związków organicznych powinowactwo elektronowe (elektronofilowość) zależy przede wszystkim od dominujących grup funkcyjnych w cząsteczce (np. atomy chlorowców, grupy estrowe, hydroksylowe, czy inne zawierające tlen). Odpowiedź detektora może się zmieniać w granicach od 1 do 10 7 w zależności od charakteru cząsteczki. Z tego względu detektora musi być kalibrowany osobno na wszystkie oznaczone związki 3. Część eksperymentalna Celem ćwiczenia jest identyfikacja w próbkach wody pestycydów chloroorganicznych DDE i DDD metodą GC-ECD oraz zapoznanie się z techniką przygotowania próbki do analizy metodą zatężania do ciała stałego (SPE). Student wykonuje zatężenie techniką SPE związków organicznych z trzech próbek wodny o objętości 100 ml, przygotowanych przez prowadzącego a następnie dokonuje analizy chromatograficznej uzyskanych próbek. Niezależnie dokonuje rozdziału chromatograficznego mieszaniny znanej ilości standardów wybranych pestycydów (po 1 ng/μl DDD i DDE) celem określenia czasów ich retencji i siły sygnału. Przeprowadzenie wzbogacania techniką SPE Wykonanie zatężenia próbek techniką SPE przeprowadza się z wykorzystaniem systemu do ekstrakcji SPE (Baker SPE-12G) i kolumienek typu C18 o objętości złoża 500 mg (krzemionka modyfikowana fazą oktadecylową). Etapy wykonania procedury: 1. Zmontowanie zestawu próżniowego - założenie końcówek, zaworków i kolumienek, podłączenie pompy próżniowej, wstawienie do komory plastikowego pojemnika na przesącz. 2. Kondycjonowanie kolumienek (pod próżnią ok. -10 kpa): - dwukrotnie po 3 ml MeOH - dwukrotnie po 3 ml wodą bidestylowaną (Uwaga: nie dopuścić do wysuszenia złoża), 4
3. Przepuścić przez złoża badane próbki (100 ml preparowanej próbki wody, przygotowanej przez prowadzącego) z prędkością nie większą niż 10 ml/min. 4. Przepłukać kolumienki po ok. 3 ml czystej wody, 5. Osuszyć kolumienki powietrzem (pod próżnią ok -40 kpa przez ok. 5 min), 6. Usunąć z komory systemu SPE pojemnik ze zlewkami i wstawić statyw z naczyńkami szklanymi, przeznaczonymi do zbierania eluatu, 7. Wymyć ekstrakt z kolumienki 2x1 ml mieszaniną eteru dietylowego i heksanu (1:1) lub metanolem (pod próżnią ok. -10 kpa), 8. Odparować rozpuszczalnik do sucha pod azotem, a pozostałości rozpuścić 0.5 ml MeOH, 9. Po 1 ul uzyskanych roztworów poddajemy analizie na GC-ECD (wg osobnej instrukcji). Pliki wyników kolejnych analiz (chromatogramy) oznaczamy w sposób następujący: XPESTY dla mieszaniny standardów pestycydów; XH2OYN dla analiz wód (pisanie rozszerzenia pliku nie jest konieczne); gdzie X oznacza nr grupy, Y nr zespołu. Pliki zapisujemy w katalogu: C:\CHROMA\ANALIZY\KURS2. Warunki pracy chromatografu GC-ECD: Typ aparatu Detektor Kolumna (dł. x śred. wewn. x grubość filmu) Dozowana objętość próbki Gaz nośny Program temperaturowy SHIMADZU GC-14B ECD RTX-5 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm 1 μl Azot, 99,999% czystości 100 C (1min) 20 /min 300 C (3 min) Temperatura detektora 300 C Temperatura dozownika 240 C W/w parametry pracy wprowadza się do aparatu ręcznie. Opracowanie wyników 1. Zidentyfikować rodzaj pestycydu w danej próbce wody. 2. Odczytać z chromatogramów powierzchnie pod pikami odpowiadającymi poszczególnym herbicydom z mieszaniny wzorcowej. 3. Odczytać z chromatogramów powierzchnie pod pikami odpowiadającymi czasom retencji poszczególnych herbicydów w ekstraktach otrzymanych z kolumienek. 4. Obliczyć stężenia pestycydów w μg/100 ml. Literatura: Biziuk M. Pestycydy, występowanie, oznaczanie i unieszkodliwianie, WNT, Warszawa 2001. 5
Ćwiczenie I Data: Godzina: Imiona i Nazwiska Grupa 1. 2. 3. Opis Powierzchnia piku Stężenie Wzorzec DDD R tddd = 1 ng/μl Wzorzec DDE R tdde = 1 ng/μl Próbka wody 1 Próbka wody 2 Próbka wody 3 Wnioski: μg/100 ml μg/100 ml μg/100 ml 6