Uwalnianie białka z komórek drody Saccharomyces cerevisiae

Andrzej Heim, Urszula Kamionowska, Marek Solecki Katedra Aparatury Procesowej, Politechnika Łódzka Uwalnianie białka z komórek drody Saccharomyces cerevisiae Streszczenie Przedstawiono wyniki dowiadcze dezintegracji drody Saccharomyces cerevisiae w klasycnym młynie perełkowym. Badano efekt niszczenia komórek w zalenoci od stenia zawiesiny zmienianego w zakresie od,5 do,2 g suchej masy/cm i prdkoci obrotowej mieszadła zmienianej w zakresie od 1 do 5 obr/min. Stopie dezintegracji okrelano dwoma metodami: na podstawie absorbancji mierzonej przy długoci fali λ = 26 nm i na podstawie iloci uwolnionego białka okrelanego metod Lowry ego. Wykazano zwikszanie si stałej szybkoci procesu wraz ze zwikszaniem koncentracji pocztkowej komórek w zawiesinie. Słowa kluczowe: dezintegracja mikroorganizmów, uwalnianie białka, kinetyka procesu Oznaczenia B ilo uwolnionego białka, [mg/cm ] B m maksymalna moliwa do uwolnienia ilo białka, [mg/cm ] C ilo kwasów nukleinowych wyznaczona na podstawie absorbancji mierzonej przy długoci fali λ=26 nm C m maksymalna moliwa do uwolnienia ilo kwasów nukleinowych k 1 stała szybkoci uwalniania białka, [1/s] k 2 stała szybkoci wyznaczona na podstawie pomiarów absorbancji, [1/s] n prdko obrotowa mieszadła, [obr/min] S stenie zawiesiny mikroorganizmów, [g suchej masy/cm ] t czas trwania procesu, [s] X stopie dezintegracji, [%] Wprowadzenie Wyodrbnienie zwizków chemicznych zawartych we wntrzu mikroorganizmów wymaga zniszczenia cigłoci cian komórkowych i błon cytoplazmatycznych w stopniu umoliwiajcym wypłynicie chronionej przez nie zawartoci. Na skal półtechniczn i techniczn proces dezintegracji drobnoustrojów przeprowadzany jest midzy innymi w młynach perełkowych. Do opisu procesu powszechnie stosowane jest liniowe równanie róniczkowe pierwszego rzdu pomimo czsto wykazywanych zmian stałej szybkoci ze zmian stenia zawiesiny [Marffy, Kula 1974; Limon-Lason i in. 1979; Heim, Solecki 1999]. Badania procesu dezintegracji drody oparte na pomiarach absorbancji przy długoci fali λ=26 nm wykazały, e powysze zmiany stałej szybkoci mog wynika z nieliniowego przebiegu procesu [Heim, Solecki 21]. W pracy przedstawiono wyniki bada procesu dezintegracji drobnoustrojów w klasycznym młynie perełkowym. Ich celem było okrelenie wpływu stenia 1

zawiesiny mikroorganizmów na przebieg procesu uwalniania białka i porównanie uzyskanych rezultatów z otrzymanymi w oparciu o pomiary absorbancji przy długoci fali λ=26 nm. Zakres bada Urzdzenie badawcze stanowił poziomy młyn perełkowy z mieszadłem wielotarczowym o pojemnoci komory roboczej około 1 dm. rednica wewntrzna zbiornika wynosiła 8 mm. Tarcze mieszadła o rednicy 66 mm rozstawione były co mm. Przestrze robocz w 8% wypełniały kulki o rednicy 1 mm wykonane ze szkła bezołowiowego. Młyn zaopatrzony był w płaszcz chłodzcy połczony z termostatem. Do bada uyto pochodzcych z jednej partii handlowych drody piekarskich Saccharomyces cerevisiae produkcji lskiej Fabryki Drody Polmos w Wołczynie. Faz cigł zawiesiny stanowił wodny roztwór zawierajcy,15 M NaCl i 4 mm K 2 HPO 4 o ph w granicach 6,-6,5. Materiał biologiczny magazynowano w temperaturze około 4 o C przez okres nie dłuszy ni tygodnie od daty produkcji. Eksperymenty przeprowadzono w warunkach pracy urzdzenia ze stałym wsadem (praca okresowa). Stenia zawiesiny drody zmieniano w zakresie od,5 do,2 g s.m./cm. Badania wykonano dla prdkoci mieszadła z zakresu od 1 do 5 obr/min. Metodyka i opracowanie wyników Rozkład wielkoci czstek w zawiesinie komórek drody sporzdzono laserowym analizatorem ziaren (analysette22, Fritsch GmbH). Do opracowania wyników pomiarów zastosowano metod Fraunhofera. Proces dezintegracji drody badano dwoma metodami porednimi. Supernatant otrzymywano po 15 minutowym wirowaniu próbek w wirówce (Sigma K, B. Braun Biotech International GmbH) przy przypieszeniu odrodkowym 2g. W zalenoci od iloci uwolnionych zwizków wewntrzkomórkowych stosowano 1, 2 i 4 krotne rozcieczenia. Pierwsza metoda oparta była na pomiarach iloci uwalnianego w procesie białka. Do jego oznaczania wykorzystano metod Lowry ego [Lowry i in. 1951], stosujc jako wzorzec wodny roztwór krystalicznej albuminy wołowej (Albumin A 9647, Sigma-Aldrich GmbH). Stopie dezintegracji komórek wyznaczano z zalenoci (1). B B X1= (1) Bmax B Zmiana stenia białka w fazie cigłej zawiesiny była czsto wykorzystywana do badania procesu dezintegracji. Metod Lowry ego [1951] stosowali [Marffy, Kula 1974] oraz [Limon-Lason i in. 1979] wykazujc zaleno stałej szybkoci od stenia zawiesiny. Z kolei Mogren i in. [1974] wykazali t metod brak wpływu koncentracji pocztkowej komórek na kinetyk uwalniania białka. 14

Proces dezintegracji badano równie na podstawie spektrofotometrycznych pomiarów absorbancji wiatła o długoci fali λ =26 nm. Ze wzgldu na niedogodno posługiwania si dwoma parametrami, korzystajc z wyznaczonych przez Benthin i in. [1991] danych dla nukleotydów, absorbancj i krotno rozcieczenia przeliczono na ilo czystego kwasu nukleinowego. Poczynione uproszczenie dla rozwaanego zagadnienia nie ma negatywnych konsekwencji. Nie mona jednak wyznaczonych iloci kwasów nukleinowych wykorzystywa do wyznaczania ich procentowego udziału w komórkach drody. Oparty na pomiarze absorbancji stopie dezintegracji komórek drody wyznaczano analogicznie jak dla metody pierwszej. Czas trwania procesu planowano tak, aby dla około piciu ostatnich z pitnastu pobranych w równych odstpach czasu próbek, wystpowały wahajce si zmiany wyznaczanego parametru B lub C nie wiksze od błdu pomiarowego dopuszczalnego dla stosowanej metody. Na podstawie spełniajcych to kryterium danych wyznaczano wartoci maksymalne B max i C max wystpujce po zdezintegrowaniu wszystkich komórek drody. W przypadku nie uzyskania w okrelonym eksperymencie wynikajcej z ograniczonej czułoci metody stabilizacji procesu, maksymalne wartoci B max i C max wyznaczono z linii regresji pomidzy wartociami zmiennych B max i S oraz C max i S uzyskanymi w pozostałych dowiadczeniach. Poprawno uzyskanych rezultatów potwierdzano wynikami uzyskanymi dla procesu dezintegracji przeprowadzanego w czasie trzykrotnie dłuszym od stosowanego w typowych dowiadczeniach. Kinetyk procesu uwalniania białka opisano powszechnie stosowanym liniowym równaniem róniczkowym pierwszego rzdu w postaci (2). db = k (B B) (2) 1 max dt Wartoci stałej szybkoci procesu k 1 uzyskano w wyniku przeprowadzenia liniowej regresji zgodnie ze wzorem () dla danych dowiadczalnych uzyskanych przed stabilizacj procesu. ln D1 = k1 t () Zalenoci () otrzymywano odpowiednio z równania (2) po rozdzieleniu zmiennych, obustronnym scałkowaniu i przyjciu oznaczenia (4). Bmax D1 = (4) B B max Analogicznie wyznaczono stał szybkoci k 2 dla wyników otrzymanych metod drug. Rezultaty i dyskusja Uzyskane obydwoma metodami wyniki dowiadcze potwierdziły istnienie zalenoci midzy efektem dezintegracji a steniem zawiesiny mikroorganizmów. Zarówno zmiany stałej szybkoci k 1 (rys. 1), jak i zmiany stałej szybkoci k 2 (rys. 2) s zbiene z rezultatami uzyskanymi we wczeniejszych badaniach [Heim, Solecki 21]. Dla procesu przeprowadzanego przy prdkociach obrotowych mieszadła wikszych od 2 obr/min, efekt dezintegracji zwiksza si wraz ze zwikszaniem 15

pocztkowej koncentracji mikroorganizmów. Dla stenia zawiesiny,2 g s.m./cm wartoci stałej szybkoci s około 5% wiksze od uzyskanych dla stenia,5 g s.m./cm. Podobnie jak we wczeniejszych badaniach wykazano równie, e przy prdkoci mieszadła 1 obr/min nastpuje zmniejszanie efektu dezintegracji ze zwikszaniem stenia zawiesiny do,14 g s.m./cm. Powyej tej wartoci szybko procesu zwiksza si. k1 [1/s].12.1.8.6.4 1 [obr/min] 15 [obr/min] 2 [obr/min] 25 [obr/min] [obr/min] 5 [obr/min].2.5.8.11.14.17.2 S [g s.m./cm ] Rys. 1. Wpływ stenia zawiesiny na stał szybkoci uwalniania białka Fig. 1. Influence of the suspension condensation on the constant rate of releasing the proteins k2 [1/s].1.9.8.7.6.5.4..2.1 1 [obr/min] 15 [obr/min] 2 [obr/min] 25 [obr/min] [obr/min] 5 [obr/min].5.8.11.14.17.2 S [g s.m./cm ] Rys. 2. Wpływ stenia zawiesiny na stał szybkoci procesu wyznaczon na podstawie pomiarów absorbancji o długoci fali 26 nm Fig. 2. Influence of the suspension condensation on the constant rate of the process determined on the basis of the absorbance measurements with a 26-nm wavelength Uzyskane współczynniki korelacji dla pierwszej metody zawierały si w przedziale,915,9957 a dla drugiej metody w przedziale,97,9994. W wszystkich przypadkach zakres zmian odchylenia standardowego stałych szybkoci procesu, odpowiednio dla poszczególnych metod, okrelały przedziały: od 2,59 do 6,72% i od,72 do 7,19%. Znacznie korzystniejsze rezultaty uzyskano w wyniku statystycznego poszukiwania maksymalnej ilo białka B max oraz maksymalnej ilo kwasów nukleinowych C max według metodyki stosowanej midzy innymi przez van Gover i in. [199]. Polega ona na wyznaczeniu takich wartoci B max i C max, dla których wartoci współczynników korelacji pomidzy zmiennymi linii regresji s maksymalne. Ich zakres w przypadku metody pierwszej zawierał si w przedziale,9669 -,9978 a w przypadku metody drugiej,98 -,9998. W przeprowadzonej 16

analizie uwzgldniono dane pomiarowe uzyskane przed stabilizacj procesu. Zakres uzyskanych wartoci odchylenia standardowego stałej szybkoci procesu odpowiednio dla stosowanych metod okrelały przedziały 1,14,75% i,72 2,89%. W przypadku nieliniowego przebiegu procesu wartoci B max i C max nie s jednak zgodne z wartociami rzeczywistymi [Heim, Solecki 21]. Wartoci B max i C max wyznaczone statystycznie dla przeprowadzonych dowiadcze s wysze od około 2 do ponad % od wartoci B max i C max. Badania korelacji prostoliniowej pomidzy tymi parametrami a steniem zawiesiny potwierdziły istnienie znacznie silniejszego zwizku dla danych wyznaczonych dowiadczalnie (rys. ). Otrzymane dla nich współczynniki determinancji przy stosowaniu metody Lowry ego [1951] wynosi,9959, a przy stosowaniu metody opartej na pomiarze absorbancji -,9516. Współczynniki korelacji uzyskane w wyniku badania zalenoci liniowej pomidzy zmiennymi B max i S oraz C max i S wynosiły odpowiednio,9196 i,921. Wyznaczone dla procesu długotrwałego dezintegrowania iloci kwasów nukleinowych i białka mieciły si w 95% przedziale ufnoci dla liniowej regresji pomidzy B max i C max a S. Bmax, Cmax [mg/cm ] 5 45 4 5 B max 25 2 15 1 C max 5.5.8.11.14.17.2 S [g s.m./cm ] Rys.. Wpływ stenia zawiesiny na wartoci B max i C max Fig.. Influence of the suspension condensation on the values B max and C max Tak w przypadku bada analizowanych na podstawie pomiaru absorbancji jak i na podstawie iloci uwalnianego białka, dla czci przeprowadzonych dowiadcze, uzyskano nieliniowy przebieg procesu (rys. 4). Dla najmniejszego stenia zawiesiny kinetyk procesu bardzo dobrze opisuje liniowe równanie róniczkowe. Przy wikszej koncentracji mikroorganizmów wystpuj odchylenia przebiegu procesu od liniowoci. W pocztkowej jego fazie dane dowiadczalne połoone s znacznie poniej linii teoretycznej wyznaczonej na podstawie regresji, a w kocowej fazie - powyej. Rezultat ten jest tym wyraniejszy, im wiksze jest stenie zawiesiny. Zmniejszanie szybkoci dezintegracji ze zwikszaniem pocztkowej koncentracji drobnoustrojów w zakresie od,5 do,11 g s.m./cm moe by spowodowane zwikszaniem oporów wprowadzania komórek do objtoci niszczenia wytwarzanej podczas rozcierania i walcowania [Heim, Solecki 22]. Zwikszanie szybkoci rozrywania cian komórkowych w pocztkowym etapie procesu dla stenia zawiesiny wikszego od,11 g s.m./cm moe wynika z blokowania mikroorganizmów w objtociach niszczcych wytwarzanych podczas zderze kulek [Heim, Solecki 1999]. 17

lnd.5 2.5 2 1.5 1.5.5 [g/cm ].5 [g/cm ].14 [g/cm ].14 [g/cm ].2 [g/cm ].2 [g/cm ] 2 4 6 8 1 t [s] Rys. 4. Przebieg procesu dezintegracji (n=25 obr/min, znaczniki zaczernione uwolnione białko, znaczniki puste pomiar absorbancji) Fig. 4. Course of the disintegration process (n=25 rpm,black marks released proteins, empty marks measurement of absorption) rednia liczba komórek wyznaczona na podstawie liczby kolonii wyhodowanych na płytkach Petriego dla zawiesiny o steniu,5 g s.m./cm wynosiła 17,1 1 8, a wyznaczona za pomoc komory Thoma dla zawiesiny o steniu,14 g s.m./cm 7,6 1 9. Obydwie wartoci potwierdzaj opublikowan teoretyczn zaleno pomidzy odległoci geometrycznych rodków ssiednich drobnoustrojów a steniem zawiesiny drody i liczb komórek [Heim, Solecki 1999]. Na podstawie rozkładu wielkoci komórek drody (rys. 5) i liczby komórek zawartych w jednostkowej objtoci potwierdzono, e wraz ze zwikszaniem stenia zwiksza si intensywno wzajemnego oddziaływania mikroorganizmów [Heim, Solecki 1999]. Zwikszanie pocztkowej liczby drobnoustrojów w zawiesinie w zakresie małych ste (,5,11 g s.m./cm ) powoduje gwałtowne zmniejszenie si odległoci midzy geometrycznymi rodkami ssiednich drody. Dla zawiesiny o zawartoci suchej masy,14 g s.m./cm s one porównywalne ze rednic najwikszych komórek drody (rys. 1). Dla,2 g s.m./cm liczba komórek o rednicy wikszej od obliczonej teoretycznej odległoci midzy ich rodkami, stanowi około % populacji. W rozwaaniach przyjto równomierne rozmieszczenie mikroorganizmów w wzłach sieci heksagonalnej zwartej. Podczas procesu dezintegracji nie wystpuje jednak zmniejszanie si stałej szybkoci procesu wraz ze zmniejszaniem liczby komórek (rys. 5). Ponadto w przypadku dezintegrowania mikroorganizmów w zawiesinie o steniu,2 g s.m./cm współczynniki regresji liniowej punktów pomiarowych pozostałych po odrzuceniu uzyskanych w pocztkowym okresie procesu, w którym osignite zostaje 4% zmniejszenie populacji drody, s nieco wiksze od współczynnika uzyskanego dla wszystkich punktów pomiarowych. W przypadku udziału drody w niszczeniu ssiednich komórek wartoci stałych szybkoci powinny by zblione do uzyskiwanych dla stenia,5 g s.m./cm. Zwikszanie stałej szybkoci w dalszym etapie procesu, wykazywane ze zwikszaniem stopnia dezintegracji komórek przy duych steniach zawiesiny, moe by spowodowane zmian własnoci reologicznych zawiesiny. S one nastpstwem midzy innymi uwalnianiem zwizków wewntrzkomórkowych i mikromielenia drobnych fragmentów cian komórkowych powodujcego wzrost lepkoci pozornej zawiesiny. 18

2 15 udział [%]. 1 5.2..5.7 1.2 1.8 2.9 4.7 wielko czstek [µm] Rys. 5. Rozkład wielkoci czstek zawartych w zawiesinie drody Fig. 5. Distribution of molecule sizes contained in yeast suspension Praca naukowa finansowana ze rodków Komitetu Bada Naukowych w latach 2-26 jako projekt badawczy 4 T9C 5 24. Bibliografia Benthin S., Nielsen J., Villadssen J. 1991. A Simple and Reliable Method for the Determination of Cellular RNA Content, Biotech. Tech., 5, 1, 9-42 Heim A., Solecki M. 1999. Disintegration of Microorganisms in Bead Mill with a Multi-Disc Impeller, Powder Technology, 15, 9-96 Heim A., Solecki M. 21. Effect of the Concentration of Microorganism Suspension on Cell Disintegration in a Bead Mill, 6 th World Congress of Chemical Engineering, Melbourne Australia Heim A., Solecki M. 22. Yeast Disintegration in a Bead Mill with Stable Baffles, 1 th European Symposium on Comminution, ISBN -9184-4-, Heidelberg Niemcy Marffy F., Kula M.R. 1974. Enzyme Yields from Cells of Brewer s Yeast Disrupted by Treatment in a Horizontal Disintegrator, Biotechnology and Bioengineering, 16, 62-64 Mogren H., Lindblom M., Hedenskog G. 1974. Mechanical Disintegration of Microorganisms in an Industrial Homogenizer, Biotechnology and Bioengineering, 16, 261-274 Limon-Lason J., Hoare M., Orsborn C.B., Doyle D.J., Dunnill P. 1979. Reactor Properties of a High-Speed Bead Mill for Microbial Cell Rupture, Biotechnology and Bioengineering, 21, 745-774 Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem., 19, 265-275 7.4 11.8 18.9 19

van Gaver D., Huyghebaert A. 199. Optimization of Yeast Cell Disruption with a Newly Designed Bead Mill, Enzyme Microb. Technol., 1, 665-671 Releasing the proteins from yeast cells Saccharomyces cerevisiae Summary: Results of disintegration of yeast Saccharomyces cerevisiae in the classical bead mill are presented. The disintegration effect was investigated depending on the concentration of cell suspension ranging from.5 to.2 g d.m./cm and rotational speed of the impeller ranging from 1 to 5 rpm. The disintegration was determined by two methods: on the basis of the measurement of absorbance (λ = 26 nm) of supernatant samples of the processed suspension, and on the basis of the quantity of released protein determined by the Lowry method. The process rate constant was shown to increase with the increase of the initial concentration of cells. Key words: disintegration of microorganisms, releasing the proteins, kinetics of the process 14