Biosynteza erytrytolu z glicerolu przez drożdże Yarrowia lipolytica

Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Nauk o Żywności Marta Marcinkiewicz Biosynteza erytrytolu z glicerolu przez drożdże Yarrowia lipolytica Praca doktorska wykonana po kierunkiem prof. dr hab. Waldemara Rymowicza w Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Wrocław 2011

Niniejsza praca została wykonana w ramach projektu pn. Biotechnologiczna konwersja glicerolu do polioli i kwasów dikarboksylowych PO IG 01.01.02-00-074/09-00 Projekt współfinansowany ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego Wrocław 2011 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Biuro Partnera Projektu ZIELONA CHEMIA 51-630 Wrocław, ul. Chełmońskiego 37/41 tel. +48 71 320 77 93 fax +48 71 320 77 94 zielona.chemia@up.poznan.pl www.zielonachemia.org.pl

Panu prof. dr hab. Waldemarowi Rymowiczowi chciałabym serdecznie podziękować za cierpliwość i życzliwość, cenne uwagi i wskazówki otrzymane podczas dyskusji naukowych oraz za wszelką pomoc podczas pisania tej rozprawy

STRESZCZENIE Celem pracy było przygotowanie podstaw dla procesu biosyntezy erytrytolu z glicerolu przez drożdże Y. lipolytica. W pierwszym etapie badań, spośród 15 szczepów drożdży należących do tego gatunku, na podstawie wyników uzyskanych w hodowlach okresowych, prowadzonych w podłożach zawierających glicerol odpadowy lub techniczny, wybrano szczep Y. lipolytica Wratislavia K1, który w podłożu z glicerolem odpadowym charakteryzował się najwyższą wydajnością erytrytolu, szybkością objętościową i właściwą produkcji erytrytolu równymi Y ERY = 0,53 g/g; Q ERY = 1,01 g/lh; q ERY = 0,068 g/gh. Dla wybranego szczepu zbadano wpływ poszczególnych składników podłoża produkcyjnego oraz ich stężenia na proces biosyntezy erytrytolu. Analizowano źródła węgla, azotu i fosforu, a także obecność chlorków metali, jonów Cu +2 i Mn +2. Najefektywniejszy proces biosyntezy erytrytolu przebiegał w podłożu zawierającym następujące składniki [g/l]: glicerol odpadowy- 150, NH 4 Cl- 2, KH 2 PO 4-0,25, NaCl- 30, CuSO 4-0,5 mg/l, MnSO 4 xh 2 O- 20 mg/l. Początkowe ciśnienie osmotyczne towarzyszące optymalnemu stężeniu substratu i NaCl wynosiło: 7,19 (dla 150 g/l glicerolu odpadowego) i 5,91 MPa (dla 30 g/l NaCl). W kolejnym etapie badano wpływ warunków hodowlanych na proces produkcji erytrytolu z glicerolu przez wybrany mikroorganizm. Najkorzystniejsze warunki dla procesu biosyntezy tego związku były: temperatura- 30ºC, ph- 3,0 i szybkość obrotowa mieszadła- 800 rpm. Dodatkowo w przypadku różnych szybkości obrotów oceniono kształt komórek pod mikroskopem, który nie uległ znacznym zmianom. W ostatnim etapie badań dokonano szczegółowej charakterystyki procesu biosyntezy erytrytolu z glicerolu przez Y. lipolytica Wratislavia K1, w której analizowano przebieg produkcji erytrytolu, ciśnienie osmotyczne i stopień nasycenia tlenem podłoża w trakcie trwania hodowli. W trakcie tej hodowli powstało 100 g/l erytrytolu ze 150 g/l glicerolu odpadowego, a cały proces trwał 110 h. Wysoka selektywność tego procesu była możliwa dzięki obecności 30 g/l chlorku sodu, a biomasę po zakończeniu hodowli poddano analizie pod kątem zawartości białka, tłuszczu i składu kwasów tłuszczowych. Stężenia tych substancji w biomasie wynosiły odpowiednio: białko- 17,5%, tłuszcz wewnątrzkomórkowy- 7% z największym udziałem estrów kwasu oleinowego (45%) i linolowego (23,5%).

SPIS TREŚCI 1. PRZEGLĄD LITERATURY... 9 1.1 Właściwości i występowanie erytrytolu... 10 1.1.1 Właściwości chemiczne i fizyczne... 10 1.1.2 Właściwości fizjologiczne i odżywcze... 12 1.1.3 Występowanie erytrytolu i jego spożycie z naturalnych źródeł... 13 1.2. Zastosowanie erytrytolu... 14 1.2.1 Bezpieczeństwo spożywania i zastosowanie w przemyśle spożywczym... 14 1.2.2 Zastosowanie erytrytolu i jego pochodnych w pozostałych gałęziach przemysłu... 16 1.3. Produkcja erytrytolu... 19 1.3.1 Dane ekonomiczne... 19 1.3.2 Produkcja chemiczna... 22 1.3.3 Produkcja biotechnologiczna... 23 1.3.3.1 Mikroorganizmy... 24 1.3.3.2 Analiza składników podłoża do produkcji erytrytolu i wpływ ciśnienia osmotycznego... 26 1.3.3.3 Szlak biochemiczny powstawania erytrytolu w komórkach drożdżowych z udziałem dwóch rodzajów substratów... 28 1.3.3.4 Warunki hodowli, systemy hodowlane, skala produkcji i oczyszczanie erytrytolu... 31 1.4 Glicerol... 34 1.4.1 Właściwości, zastosowanie, metody produkcji... 34 1.4.2 Problemy z zagospodarowaniem glicerolu odpadowego z produkcji biopaliw... 35 1.4.3 Glicerol jako substrat w procesach biotechnologicznych... 36 1.5 Biotechnologiczne znaczenie niekonwencjonalnych drożdży Y. lipolytica... 39 1.5.1 Utylizacja różnych substratów... 39 1.5.2 Możliwości aplikacyjne... 40 2. CEL PRACY... 44 3. MATERIAŁY I METODY BADAŃ... 46 3.1 Mikroorganizmy... 46 3.2 Podłoża hodowlane i surowce... 47 3.2.1 Substrat... 47 3.2.1.1 Składniki glicerolu odpadowego... 47 3.2.2 Podłoże inokulacyjne- YM... 48 3.2.3 Podłoża do selekcji Y. lipolytica... 48 3.2.4 Podłoże do doboru źródła azotu... 48 3.2.5 Podłoże do doboru źródła fosforu... 49 3.2.6 Podłoże do doboru chlorków metali... 49 3.2.7 Podłoże do doboru substratu... 49 3.2.8 Podłoże do optymalizacji składu... 49 3.2.9 Podłoże do optymalizacji stężenia substratu... 49 3.2.10 Podłoże do optymalizacji warunków hodowlanych... 50 3.2.11 Pochodzenie składników podłoża... 50 3.3 Warunki hodowli... 50 3.4 Metody analityczne... 51 3.4.1 HPLC... 51 3.4.2 Oznaczenie biomasy... 52 3.4.3 Ciśnienie osmotyczne... 52 3.4.4 Natlenienie... 53 3.4.5 Zdjęcia mikroskopowe... 53 3.4.6 Oznaczenie zawartości białka w biomasie po produkcji erytrytolu... 53

3.4.7 Oznaczenie zawartości tłuszczu i kwasów tłuszczowych w biomasie po produkcji erytrytolu... 53 3.4.7.1 Oznaczenie zawartości tłuszczu wewnątrzkomórkowego... 53 3.4.7.2 Oznaczenie zawartości kwasów tłuszczowych... 54 3.5. Wykaz skrótów i wzorów użytych do obliczeń... 54 4. OMÓWIENIE WYNIKÓW... 56 4.1 Wybór szczepu drożdży Y.lipolytica do biosyntezy erytrytolu z glicerolu... 56 4.2 Dobór składników podłoża... 60 4.2.1 Dobór źródła azotu... 60 4.2.2 Dobór źródła fosforu... 62 4.2.3 Dobór chlorków metali... 64 4.2.4 Dobór jonów Cu +2 i Mn +2... 66 4.3 Wpływ stężenia poszczególnych składników podłoża... 68 4.3.1 Wpływ stężenia NH 4 Cl jako źródła azotu... 68 4.3.2 Wpływ stężenia KH 2 PO 4 jako źródła fosforu... 70 4.3.3 Wpływ stężenia NaCl... 72 4.3.4 Wpływ stężenia jonów Cu +2 i Mn +2... 74 4.3.5 Wpływ stężenia substratu... 77 4.4 Stosunek węgla do azotu (C/N)... 80 4.5 Biosynteza erytrytolu z udziałem różnych substratów... 82 4.6 Wpływ warunków hodowli... 84 4.6.1 Wpływ temperatury... 84 4.6.2 Wpływ odczynu środowiska hodowlanego... 86 4.6.3 Wpływ szybkości obrotów mieszadła... 88 4.7 Charakterystyka procesu biosyntezy erytrytolu przez Y. lipolytica Wratislavia K1 w warunkach optymalnego składu podłoża i warunków hodowlanych... 92 5. DYSKUSJA WYNIKÓW... 97 6. WNIOSKI... 122 7. BIBLIOGRAFIA... 124 SPIS TABEL I RYSUNKÓW Tytuł tabeli Str. Tabela 1. Porównanie właściwości fizycznych i chemicznych różnych polioli i 11 sacharozy Tabela 2. Efekt przeczyszczający poszczególnych polioli 13 Tabela 3. Występowanie erytrytolu w żywności 14 Tabela 4. Redukcja kalorii dla poszczególnych środków spożywczych poprzez 16 zastąpienie tradycyjnych substancji słodzących erytrytolem Tabela 5. Spożycie erytrytolu w Europie i Chinach w poszczególnych latach 19 Tabela 6. Struktura sprzedaży oraz informacja o zakładach firmy Binzhou-Sanyuan- 22 Biotechnology Tabela 7. Źródła izolacji mikroorganizmów produkujących erytrytol 25 Tabela 8. Skład chemiczny odpadowego glicerolu produkowanego przez włoską firmę 35 NOVAOL Tabela 9. Konwersja odpadowego glicerolu do cennych produktów na drodze 38 beztlenowego metabolizmu poszczególnych gatunków bakterii Tabela 10. Szczepy drożdży Y.lipolytica użyte w badaniach 46 Tabela 11. Skład glicerolu odpadowego (LOTOS) 48 Tabela 12. Wykaz składników standardów z poszczególnymi parametrami związanymi z 52 chromatografią Tabela 13. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 59 wybrane szczepy Y. lipolytica

Tytuł tabeli Str. Tabela 14. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 62 Y. lipolytica Wratislavia K1w podłożach zawierających różne źródła azotu Tabela 15. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 64 Y. lipolytica Wratislavia K1 w podłożach zawierających różne źródła fosforu Tabela 16. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 65 Y. lipolytica Wratislavia K1w podłożach zawierających różne chlorki metali Tabela 17. Porównanie ciśnienia osmotycznego w hodowlach zawierających różne 66 chlorki metali w podłożu Tabela 18. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 68 Y. lipolytica Wratislavia K1w podłożach zawierających jony Cu +2 i Mn +2 Tabela 19. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 70 Y. lipolytica Wratislavia K1w podłożach zawierających różne stężenia NH 4 Cl Tabela 20. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 71 Y. lipolytica Wratislavia K1w podłożach zawierających różne stężenia KH 2 PO 4 Tabela 21. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 73 Y. lipolytica Wratislavia K1w podłożach zawierających różne stężenia NaCl Tabela 22. Zależność pomiędzy ciśnieniem osmotycznym panującym na początku i na 74 końcu hodowli a stężeniem NaCl w podłożu produkcyjnym Tabela 23. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 77 Y. lipolytica Wratislavia K1 w podłożach zawierających różne stężenia: a) CuSO 4 i b) MnSO 4 Tabela 24. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 79 Y. lipolytica Wratislavia K1w podłożach zawierających różne stężenia substratu Tabela 25. Zależność pomiędzy ciśnieniem osmotycznym panującym w podłożu na 80 początku i na końcu hodowli, a stężeniem początkowym substratu Tabela 26. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 83 Y. lipolytica Wratislavia K1 w podłożach zawierających różne substraty Tabela 27. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 86 Y. lipolytica Wratislavia K1 w hodowlach prowadzonych w różnych temperaturach Tabela 28. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 88 Y. lipolytica Wratislavia K1 w hodowlach prowadzonych w różnym ph Tabela 29. Porównanie szybkości produkcji i wydajności erytrytolu z glicerolu przez 90 Y. lipolytica Wratislavia K1 w hodowlach prowadzonych przy różnych szybkościach obrotowych mieszadła Tabela 30. Selektywność, całkowita szybkość produkcji i wydajność erytrytolu z 94 glicerolu w hodowli periodycznej Y. lipolytica Wratislavia K1 Tabela 31. Zawartość białka i tłuszczu zawartych w biomasie drożdży Y. lipolytica 95 Wratislavia K1 po produkcji erytrytolu Tabela 32. Udział poszczególnych kwasów tłuszczowych zawartych w biomasie 96 drożdży Y. lipolytica Wratislavia K1 po produkcji erytrytolu Tabela 33. Porównanie produkcji erytrytolu z udziałem różnych mikroorganizmów i 110 podłoży hodowlanych Tabela 34. Porównanie produkcji erytrytolu z udziałem różnych mikroorganizmów i 117 warunków hodowlanych Tabela 35. Produkcja erytrytolu z udziałem różnych mikroorganizmów 121 Tytuł rysunku Str. Rys. 1 Wzór strukturalny erytrytolu [(2R,3S)-butano-1,2,3,4-tetraol] 10 Rys. 2 Wzór strukturalny treitolu [(2R,3R)-butano-1,2,3,4-tetraol] 10 Rys. 3 Pochodne erytrytolu wykorzystywane w przemyśle chemicznym i 18 farmaceutycznym Rys. 4 Produkcja chemiczna erytrytolu z udziałem różnych substratów 23

Tytuł rysunku Str. Rys. 5 Aktywny transport mannitolu u C. halophila 27 Rys. 6 Szlak produkcji erytrytolu z glukozy 29 Rys. 7 Hipotetyczny szlak produkcji erytrytolu i produktów ubocznych (mannitol, 31 arabitol) z glicerolu przez drożdże Y. lipolytica Rys. 8 Zakres badań- schemat 45 Rys.9 Przykładowy chromatogram standardu na kanale zawierającym odpowiedź z detektora RI Rys. 10 Biosynteza erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez wybrane szczepy Y. lipolytica na glicerolu: a) odpadowym b) technicznym Rys. 11 Wpływ źródła azotu na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 12 Wpływ źródła fosforu na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1. Rys. 13 Wpływ chlorków metali na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 14 Wpływ jonów Cu +2 i Mn +2 na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 15 Wpływ stężenia NH 4 Cl na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 16 Wpływ stężenia KH 2 PO 4 na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 17 Wpływ stężenia NaCl na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 18 Wpływ stężenia jonów: a) Cu +2 i b) Mn +2 w podłożu z dodatkiem chlorku sodu na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 19 Wpływ stężenia początkowego substratu na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 20 Porównanie parametrów produkcji erytrytolu z glicerolu przez Y. lipolytica Wratislavia K1 przy różnym stosunku węgla do azotu (C/N) Rys. 21 Wpływ rodzaju substratu na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 22 Wpływ temperatury na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 23 Wpływ ph na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 24 Wpływ szybkości obrotowej mieszadła na produkcję erytrytolu, biomasy i produktów ubocznych przez Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 25 Wpływ szybkości obrotów mieszadła na stopień nasycenia tlenem podłoża produkcyjnego w procesie biosyntezy erytrytolu z glicerolu przez drożdże Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 26 Utylizacja glicerolu, wzrost i tworzenie produktów ubocznych podczas biosyntezy erytrytolu z udziałem szczepu Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 27 Porównanie wydajności i szybkości produkcji w czasie procesu biosyntezy erytrytolu z glicerolu przez szczep Y. lipolytica Wratislavia K1 Rys. 28 Ciśnienie osmotyczne i stopień nasycenia tlenem podłoża mierzone w trakcie produkcji erytrytolu z udziałem szczepu Y. lipolytica Wratislavia K1 Zdjęcia Str. Fot. 1 Produkty firmy FITO PHARM zawierające erytrytol 20 Fot.2 Stan fizjologiczny komórek drożdży Y. lipolytica Wratislavia K1 pochodzących z 92 hodowli o różnych szybkościach obrotowych mieszadła 51 58 61 63 65 67 69 71 73 76 78 81 83 85 87 89 91 93 94 95

Przegląd literatury 1. PRZEGLĄD LITERATURY W ostatnich latach nastąpił wzrost zainteresowania żywnością specjalnego przeznaczenia, między innymi o obniżonej kaloryczności oraz dla diabetyków. Konsumenci coraz częściej zdają sobie sprawę z tego, że regularne spożywanie cukrów prostych, głównie sacharozy, powoduje duże szkody w organizmie. Prowadzą one do nadwagi, zaburzają gospodarkę cukrowo-lipidową, zwiększają ryzyko chorób układu krążenia (zawał serca, udar mózgu, nadciśnienie tętnicze) i sprzyjają występowaniu cukrzycy typu II (Kowalowski i wsp. 2004; Pregiel i wsp. 2010). Najskuteczniejszym sposobem ograniczenia energii pochodzącej z sacharozy jest stosowanie innych środków słodzących. Taka zmiana w składzie surowcowym produktów spożywczych może przyczynić się do poprawy zwyczajów żywieniowych. Bardzo popularne do tej pory słodziki, takie jak aspartam, acesulfan czy sacharyna obarczone są podejrzeniem o powodowanie groźnych chorób, dlatego obecnie poszukuje się obojętnych dla organizmu zamienników sacharozy (Pregiel i wsp. 2010). Jednym z takich związków jest erytrytol- niskokaloryczny słodzik z grupy polioli, który jako jedyny z nielicznych tego typu substancji produkowany jest metodami naturalnymi i posiada w stosunku do nich konkurencyjne właściwości. Dzięki temu znajduje on zastosowanie nie tylko jako substancja słodząca, ale także bardzo obiecujące wydaje się być zapotrzebowanie na erytrytol ze strony innych gałęzi przemysłu. W niniejszej dysertacji przedstawiono innowacyjny sposób otrzymywania erytrytolu z glicerolu przy udziale drożdży Yarrowia lipolytica. Podkreślenia wymaga fakt, że zarówno substrat (glicerol) jak i mikroorganizm nie były w zasadzie brane wcześniej pod uwagę przy tego rodzaju biosyntezie. Ponadto zastosowanie w takim procesie taniego surowca, jakim jest niewątpliwie odpadowy glicerol pochodzący z produkcji biopaliw, może w znacznym stopniu obniżyć koszty związane z wytworzeniem tego słodzika. Opracowanie technologii produkcji erytrytolu z taniej gliceryny przez drożdże Y. lipolytica jest uzasadnione i ważne zarówno od strony ekonomicznej jak i prozdrowotnej. 9

Przegląd literatury 1.1 Właściwości i występowanie erytrytolu 1.1.1 Właściwości chemiczne i fizyczne Erytrytol jest alkoholem cukrowym należącym do grupy polioli i posiadającym cztery atomy węgla, z których każdy zawiera grupę hydroksylową. Ze względu na symetryczność swojej cząsteczki występuje tylko w formie mezo- i jest diastereoizomerom treitolu (rys. 1, 2). Rys. 1 Wzór strukturalny erytrytolu [(2R,3S)-butano-1,2,3,4-tetraol] Rys. 2 Wzór strukturalny treitolu [(2R,3R)-butano-1,2,3,4-tetraol] Związek ten jest niehigroskopijny, bardzo łatwo i szybko ulega krystalizacji. Jego bezwodne kryształy charakteryzują się słodkim smakiem, bez żadnych obcych nieprzyjemnych posmaków. Forma krystaliczna odznacza się białym kolorem i wyglądem zbliżonym do kryształów sacharozy. Po rozpuszczeniu w wodzie forma ta będzie tworzyć bezbarwne i pozbawione lepkości roztwory. Kryształy topią się w 122ºC przekształcając się w formę, która także jest pozbawiona koloru i lepkości. Chemiczne właściwości erytrytolu są podobne w stosunku do innych polioli dzięki braku obecności grup redukujących, co zapewnia znakomitą termostabilność, a także odporność na środowisko o odczynie kwaśnym. Różnice wynikają przede wszystkim z różnej rozpuszczalności, którą erytrytol ma zbliżoną do mannitolu (Gossens i Gonze 1996). Ze względu na wysoce ujemne ciepło rozpuszczania, erytrytol przyczynia się do ochłodzenia danego układu, którego jest składnikiem (www.jungbunzlauer.com). Przejawia się to w jego delikatnie chłodzącym smaku. W stosunku do pozostałych polioli, stosowanych jako zamienniki cukru, ma on najmniejszą masę cząsteczkową i dzięki temu posiada szereg interesujących właściwości takich jak: wysoką aktywność wody i ciśnienie osmotyczne w roztworze. Podsumowanie tych właściwości i porównanie ich w stosunku do innych polioli oraz sacharozy przedstawiono w tab. 1. 10

Tabela 1. Porównanie właściwości fizycznych i chemicznych różnych polioli i sacharozy (Źródło: www.jungbunzlauer.com) Erytrytol Treitol Xylitol Mannitol Sorbitol Maltitol Palatynit Lactitol Sacharoza Ilość atomów węgla [nº] 4 4 5 6 6 12 12 12 12 Masa cząsteczkowa [g/mol] 122 122 152 182 182 344 344 344 342 Kaloryczność [kcal/g] 0,2-2,4 1,6 2,6 2,1 2,0 2,0 4,0 Słodkość w stosunku do sacharozy 0,7-1 0,4-0,5 0,4-0,5 0,9 0,45 0,3 1,0 Efekt chłodzenia dobry - bardzo dobry dobry dobry brak brak słaby brak Punkt topnienia [ºC] 120 78-90 94 166-168 95 150 145-150 122 190 Temperatura krystalizacji [ºC] 53,3-46,5 40 43,5 34,5 35,5-32 Ciepło rozpuszczania [cal/g] -43,0 - -36,5-28,5-26,5-19,0 - - -4,3 Termostabilność [ºC] >160 - >160 >160 >160 >160 >160 >160 160 Stabilność ph 2-10 - 2-10 2-10 2-10 2-10 2-10 >3 hydroliza Długość cząsteczki [Å] 8,0-9,3-9,6-9,9 10,1-10,7 - - - - - Przegląd literatury Szerokość cząsteczki [Å] 3,1-3,2-3,2-3,3 3,4 - - - - - Lepkość bardzo niska - bardzo niska niska średnia średnia wysoka bardzo niska niska Higroskopijność bardzo niska - wysoka niska średnia średnia niska średnia średnia Rozpuszczalność w 25ºC [% w/w] 37-64 20 70 60 25 57 67 Rozpuszczalność w 50ºC [% w/w] 55-80 31 83 70 45 74 72 11

Przegląd literatury 1.1.2 Właściwości fizjologiczne i odżywcze Większość ważnych właściwości odżywczych i fizjologicznych, które wyróżniają erytrytol spośród pozostałych substancji słodzących, wynika z małego rozmiaru jego cząsteczki. Należy również zdawać sobie sprawę, że są one niezmiernie atrakcyjne dla jego konsumentów. Związek ten posiada podobny profil smakowy w stosunku do sacharozy. W przeliczeniu na masę daje to około 60-70% uczucia słodkiego smaku spowodowanego przez sacharozę. Oznacza to, że np. dla uzyskania słodkości powodowanej przez 5g sacharozy konieczne jest spożycie około 6,5-7 g erytrytolu (Tatoń i wsp. 2009). W odróżnieniu od pozostałych tego typu substancji nie pozostawia on obcych posmaków, dlatego też jest bardzo często mieszany z innymi słodzikami (m in. stewiozydy, taumatyna, aspartam), aby zamaskować ich niepożądany smak i poprawić słodkość. Dzięki takiemu zabiegowi będzie ona wyższa w przypadku mieszaniny erytrytolu i danej substancji słodzącej, niż sumy poszczególnych składników (Gossens i Gonze 1996). Kaloryczność erytrytolu odpowiada ok. 5% wartości sacharozy i wynosi 0,2-0,4 kcal/g. Wartość ta jest zdecydowanie najniższa wśród wszystkich polioli i środków słodzących, dlatego też większość krajów, w tym Unia Europejska (dopiero w 2008 r.), uznała za dopuszczalne podawanie informacji dotyczących braku kalorii na produktach zawierających tę substancję. Dostępność energii dla organizmu stanowi tylko 10% kaloryczności erytrytolu. Niski ciężar cząsteczkowy tego związku i brak enzymów odpowiedzialnych za jego degradację w organizmie sprawia, że około 80% tej substancji wydalane jest w niezmienionej formie wraz z moczem. Natomiast z pozostałych 20% tylko połowa jest przekształcana do wolnych kwasów tłuszczowych w okrężnicy (van Es 1987). Dzięki prawie całkowitemu braku obecności tych niezaabsorbowanych związków i gazów z reguły nie dochodzi w organizmie do wzdęć ani biegunek (Oku i Noda 1990). W przypadku trawienia pozostałych słodzików następuje degradacja tych substancji, które następnie są fermentowane przez mikroflorę przewodu pokarmowego (de Groot 1974). Tym samym, efekt przeczyszczający pozostałych polioli jest znacznie wyższy niż erytrytolu, co przedstawia tab. 2. Wartości dla erytrytolu są dwukrotnie wyższe w stosunku do maltitolu, ksylitolu i izomaltu i pięciokrotnie dla sorbitolu. 12

Przegląd literatury Tabela 2. Efekt przeczyszczający poszczególnych polioli (Źródło: de Cock i Bechert 2002) Maksymalna dawka nie powodująca efektu Poliol przeczyszczającego u [g/kg masy ciała]: Mężczyzn Kobiet Erytrytol 0,66 0,80 Sorbitol 0,17 0,24 Maltitol 0,30 0,30 Izomalt 0,30 - Xylitol 0,30 0,30 Indeks glikemiczny erytrytolu wynosi zero. Oznacza to, że nie wpływa na poziom glukozy i insuliny we krwi, zatem może być bez przeszkód stosowany przez osoby cierpiące na cukrzycę (Bornet i wsp. 1996). Ponadto może hamować proces fermentacji niektórych cukrów przez bakterie w jamie ustnej głównie z rodzaju Streptococcus i tym samym ograniczyć możliwości rozwoju próchnicy zębów (de Cock i Bechert 2002). Innym efektem stosowania erytrytolu jest spadek masy ciała w wyniku redukcji wartości kalorycznej diety zawierającej erytrytol zamiast sacharozy (Tatoń i wsp. 2009). Ze względu na obecność grup hydroksylowych związek ten może również pełnić funkcję antyoksydacyjną, dzięki której będzie łączyć się z wolnymi rodnikami i chronić w ten sposób komórkę przed ich szkodliwym działaniem (de Cock i Bechert 2002; den Hartog i wsp. 2010). 1.1.3 Występowanie erytrytolu i jego spożycie z naturalnych źródeł Erytrytol po raz pierwszy został wyizolowany z porostów (Huneck i wsp. 1967) oraz alg morskich (Lamy 1852; Bamberger i Landsiedl 1900). Oprócz tego występuje również w: pyłkach kwiatów; owocach takich jak: melony, gruszki i winogrona (Shindou i wsp. 1989); grzybach kapeluszowych (Yoshida i wsp. 1984); fermentowanych napojach takich jak: wino (Dubernet i wsp. 1974), sake (Masuda i wsp. 1967); zupa i pasta Miso na bazie fasoli, a także w starterach serowarskich (Shindou i Ishizuka 1996) i sosie sojowym (Onishi i Saito 1959). Zawartość erytrytolu w poszczególnych produktach spożywczych przedstawia tab. 3. 13

Przegląd literatury Tabela 3. Występowanie erytrytolu w żywności (Źródło: Goossens i Gonze 1996) Żywność Ilość erytrytolu [mg/kg,l*] Melony 22-47 Gruszki 0-40 Winogrona 0-42 Wino 130-300* Sos sojowy 910* Pasta fasolowa Miso 1310 Jego spożycie z naturalnych źródeł (głównie ser i wino) wynosi 1,3 mg/kg masy ciała/ dobę w Stanach Zjednoczonych, natomiast w Japonii 0,7 mg/kg masy ciała/dobę (Bernt i wsp. 1996). W organizmie człowieka oraz zwierząt substancja ta występuje w tkankach wchodzących w skład soczewki oka (Tomana i wsp. 1984) i płynach ustrojowych takich jak: osocze (1,2 mg/l) (Niwa i wsp. 1993), krew (Britton i wsp. 1967), sperma (ok. 69 mg/l) (Storset i wsp. 1978), mocz (10-100 mg/l) (Imanari i wsp. 1975), płyn mózgowo-rdzeniowy (Servo i wsp. 1977) i owodniowy (Roberts i wsp. 1976). 1.2. Zastosowanie erytrytolu Erytrytol został uznany za zamiennik sacharozy czwartej generacji po sorbitolu (pierwszej generacji), izomalcie (drugiej generacji) i preparacie zawierającym ekstrakty roślinne o nazwie Alveosweet (trzeciej generacji) (Clarke 1995). 1.2.1 Bezpieczeństwo spożywania i zastosowanie w przemyśle spożywczym Erytrytol był przedmiotem obszernych badań metabolicznych, toksykologicznych i klinicznych mających ocenić bezpieczeństwo jego stosowania w żywności (Bernt i wsp. 1996). W tym celu przeprowadzono liczne badania dotyczące oceny metabolizmu i toksyczności ostrej, podprzewlekłej i przewlekłej u myszy, szczurów i psów, a także u ludzi. We wszystkich badaniach substancja ta była dobrze tolerowana, nawet w bardzo dużych dawkach nie wykazywała efektów toksycznych. Nie stwierdzono działania kancerogennego, mutagennego czy teratogennego. Poza tym 14

Przegląd literatury wiele badań wykazało, że nie wpływa ona na reprodukcję czy płodność. W żadnych badaniach nie zanotowano histologicznych dowodów toksyczności erytrytolu dla takich narządów jak wątroba czy nerki (Munro i wsp. 1998; Tatoń i wsp. 2009). Uznano, że wszystkie działania uboczne tego poliola stanowią fizjologiczną odpowiedź na aktywność osmotyczną podawanego związku, a nie są znaczącym efektem toksycznym. Potwierdziła to Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) w swoim specjalnym oświadczeniu i uznała erytrytol za całkowicie bezpieczny dodatek do żywności (WHO Setting ADI. In Principles for the Safety Assessment of Food Additives and Contaminants in Foods, 1987). W USA w roku 1997 związek ten otrzymał status GRAS (Generally Recognized As Safe), ponadto monografia erytrytolu znajduje się w Farmakopei Europejskiej- European Pharmacopoeia Monographs- Erythritol. Związek ten został zaakceptowany do zastosowania w żywności także w innych krajach w latach: 1990 (Japonia); 1999 (Australia, Nowa Zelandia, Tajwan); 2000 (Singapur, Korea Południowa); 2001 (Rosja, Izrael, Republika Południowej Afryki, Chiny); 2002 (Meksyk); 2004 (Urugwaj, Filipiny, Kanada); 2005 (Paragwaj, Argentyna, Brazylia). W Polsce Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 18 września 2008 roku w sprawie dozwolonych substancji dodatkowych erytrytol (E968) został dopuszczony do stosowania, jako dodatek do żywności zgodnie z Dyrektywą 2006/52/WE Parlamentu Europejskiego i Rady Europy z dnia 5 lipca 2006 roku w sprawie substancji słodzących używanych w środkach spożywczych. Na mocy tego rozporządzenia w Polsce może być on stosowany w różnego rodzaju deserach jajecznych, opartych na zbożach lub tłuszczach, śniadaniowych przetworach zbożowych, lodach, dżemach, galaretkach, marmoladach, owocach kandyzowanych oraz preparatach owocowych. Ponadto może być dodawany do wyrobów cukierniczych: opartych na skrobi lub owocach suszonych, produktów kakaowych, produktów do smarowania pieczywa opartych na kakao lub mleku, suszonych owocach lub tłuszczach; pieczywa cukierniczego i wyrobów ciastkarskich. Znajduje również zastosowanie jako dodatek do gum do żucia, musztard, środków specjalnego żywieniowego przeznaczenia, a także suplementów diety (Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 18 września 2008 roku w sprawie dozwolonych substancji dodatkowych). Obniżenie kaloryczności w poszczególnych produktach spożywczych przy zastosowaniu erytrytolu przedstawia tab. 4. 15

Przegląd literatury Tabela 4. Redukcja kalorii dla poszczególnych środków spożywczych poprzez zastąpienie tradycyjnych substancji słodzących erytrytolem (Źródło: Gossens i Gonze 1996) Produkt spożywczy Obniżenie kaloryczności [%] Słodzik stołowy 90 Twarde karmelki 90 Suplement diety 85 Guma do żucia 85 Pomada 65 Krem do ciast na bazie tłuszczu 36 Czekolada 34 Krem do ciast typu instant 31 Ciasto biszkoptowe 25 W Stanach Zjednoczonych i w Azji Południowo-Wschodniej erytrytol może być również stosowany jako zamiennik substancji słodzących w napojach i jogurtach, jednakże Unia Europejska jak do tej pory nie wyraziła zgody na taką aplikację. Europejski Urząd do spraw Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) po raz kolejny dokonał przeglądu i analizy nowych testów m in. dotyczących tolerancji pokarmowej u dzieci pod kątem rozszerzenia zezwolenia na stosowanie erytrytolu w napojach. Mimo wszystko w opinii opublikowanej 9 lipca 2010 r. Urząd stwierdził, że wciąż istnieją wątpliwości odnośnie bezpieczeństwa erytrytolu używanego do napojów w celach innych niż słodzenie na zaproponowanym poziomie 2,5% (www.foodie.pl/informacje.html). Oprócz funkcji słodzącej związek ten może znaleźć zastosowanie w produktach spożywczych: jako wzmacniacz lub nośnik aromatu; substancja wypełniająca lub absorbująca jony i zapobiegająca zmianom smaku, konsystencji i barwy produktu; przy utrzymywaniu wilgotności, stabilizacji i zagęszczeniu produktu (Dyrektywa 2006/52/WE Parlamentu Europejskiego i Rady Unii Europejskiej 2006 r.). 1.2.2 Zastosowanie erytrytolu i jego pochodnych w pozostałych gałęziach przemysłu Erytrytol wykorzystywany jest także w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym i chemicznym. W przemyśle farmaceutycznym stosowany jest do 16

Przegląd literatury produkcji osłonek cukrowych na tabletki (Ohmori i wsp. 2004), ale przede wszystkim jest prekursorem dla wszelkiego rodzaju substancji chiralnych, tzw. building blocks, o czterech atomach węgla (Pottie i wsp. 1994). Jego optycznie czynny izomer- treitol jest substancją wyjściową dla szeregu leków cytostatycznych (Bemis i Chaturvedi 1997). Pochodne nitrowe erytrytolu, takie jak tetraazotan pentaerytrytolu (rys. 3a), rozszerzają naczynia wieńcowe i są składnikami środków przeciwko dusznicy bolesnej (Angina pectoris) (Röper i Gossens 1993). Estry kwasu galusowego i erytrytolu (rys. 3b) wykazują właściwości antymutagenne (Romert i wsp. 1994) oraz przeciwnowotworowe (Gali i wsp. 1993). Oprócz tego związki te mogą być wykorzystane w przemyśle tekstylnym podczas obróbki skór. Jest to technologia korzystna dla środowiska, gdyż przyczynia się do eliminacji soli chromianowych z tego procesu (Tang i wsp. 2003). W kosmetologii erytrytol z powodzeniem może być stosowany jako zamiennik gliceryny w celach ochraniających kosmetyki przed zepsuciem, gdyż większość mikroorganizmów nie ma zdolności do utylizacji tego związku (http://www.sdspfjy.com.cn/zdyj/zdyj1-7e.htm). Jako składnik kremów utrzymuje właściwą wilgotność w rogowej warstwie naskórka (www.lumiere.pl). W przemyśle chemicznym stosowane są głównie pochodne erytrytolu lub jego polimery. Poliestry i polietery 1,4-anhydroerytrytolu (rys. 3c,d,e) używane są do produkcji tworzyw sztucznych takich jak: żywice epoksydowe będące składnikami farb (Kasumi 1995), pianki poliuretanowe (Li i wsp. 2003) oraz filmy będące składnikami materiałów optoelektronicznych (diody LED, fotokomórki) (Ouyang i wsp. 2005). Ponadto związki te mogą służyć jako dodatki podczas stabilizacji lub plastyfikatory podczas redukcji skrobi i celulozy (Bippes 2007). Natomiast pochodne erytrytolu mogą być wykorzystywane jako: prekursory dla innych związków chemicznych m.in. bicyklicznych dioksanów (Jensen i wsp. 1975) i sulfonianów (Halila i wsp. 2002), materiały wybuchowe (Tarver i wsp. 2003), rozpuszczalniki w elektrycznych izolatorach (Röper i Gossens 1993). Ze względu na swoją wysoka temperaturę topnienia erytrytol może być elementem materiałów zmiennofazowych (tzw. PCM), które mogą magazynować ciepło utajone (Hidaka i wsp. 2004) lub wchodzić w skład cieczowych kolektorów słonecznych (Sharma i wsp. 2005). Natomiast badania Kuroda i wsp. (2008) wykazały, że ten poliol wpływa na przyspieszenie wzrostu u niektórych roślin i grzybów, dlatego może znaleźć zastosowanie w rolnictwie jako regulator wzrostu. Na uwagę zasługuje również fakt, iż erytrytol może być także substratem w procesach mikrobiologicznych, w których powstają cenne produkty. Mogą nimi być 17

Przegląd literatury mannozyloerytrytololipidy (rys. 3f), które tworzą się na drodze mikrobiologicznej konwersji z udziałem Pseudozyma aphidis (Rau i wsp. 2005). Substancje te stosowane są: w leczeniu schizofrenii, jako zmienniki dopamin (Vértesy i wsp. 2002), przy oczyszczaniu białek (Im i wsp. 2003) i jako antyaglomeranty podczas krystalizacji lodu (Kitamoto i wsp. 2001). Natomiast w wyniku przekształcenia erytrytolu z udziałem bakterii z rodzaju Gluconobacter powstaje erytruloza, która może być cennym składnikiem kosmetyków nadających skórze brązową barwę (tzw. samoopalacze) (Shreier i Jermann 2000) lub też prekursorem w produkcji m in. butanotriolu, kwasu 4- amino-3-hydroksymasłowego oraz biotyny (Imfeld i wsp. 2001; de Wilde i wsp. 1987; van der Eycken i wsp. 1987). a) b) Tetranitroerytrytol Ester kwasu galusowego i erytrytolu c) d) 1,4- cisanhydroerytrytol Polieter erytrytolu e) f) Poliuretan polieteru erytrytolu Lipid mannolzyloerytrytolowy Rys. 3 Pochodne erytrytolu wykorzystywane w przemyśle chemicznym i farmaceutycznym (Źródło: Bippes 2007) 18

Przegląd literatury 1.3. Produkcja erytrytolu 1.3.1 Dane ekonomiczne Jak podaje portal internetowy Food-Navigator (www.food-navigator.com) w roku 2005 najwięcej alkoholi cukrowych spożywali Amerykanie- około 376 640 ton, co stanowiło 79% globalnej produkcji tych słodzików. W ogólnodostępnych źródłach nie znaleziono informacji odnośnie samego erytrytolu. Wiadomo natomiast, że konsumpcja tego związku w Chinach w roku 2012 wzrośnie szacunkowo 6-krotnie w stosunku do roku 2002 (tab. 5). W przypadku Europy nie jest to zjawisko na tak wysoką skalę, ale obserwuje się w ostatnich latach wzrost spożycia tego słodzika w Europie Zachodniej o 1,5%, natomiast w Europie Wschodniej o 5% (tab. 5). Najwięcej tego związku w Europie spożywają Brytyjczycy (około 1 517 ton). Tabela 5. Spożycie erytrytolu w Europie i Chinach w poszczególnych latach (Źródło: www.foodnavigator.com, Euromonitor International Report 2008) Europa Chiny Rok Wschodnia Zachodnia [tony] [tony] [tony] 2002 brak akceptacji Unii Europejskiej 153 2006 2 420 5 308-2007 2 544 5 391 321 2008 2 666 5 467-2012 brak ogólnodostępnych prognoz 634 Z uwagi na rosnącą popularność erytrytolu szacuje się, że jego światowa produkcja będzie stale wzrastać z 20 tysięcy ton w roku 2006 do spodziewanych 23 tysięcy ton w 2011 (Frost i Sullivan 2007; Moon i wsp. 2010). Do czołowych producentów tego związku należą m.in. Bolak Corporation (Washung, Kyungki-do, Korea Południowa), Baolingbao Biotechnology Co.,Ltd (Shandong, Chiny), Titanbiotech (Dehli, Indie), Cargill Food & Pharm Specialities (Blair, Nebraska, USA) i Mitsubishi Chemical Corporation (Tokyo, Japonia). Jedyną firmą produkującą ten związek w Europie jest Jungbunzlauer (Bazylea, Szwajcaria). W chwili obecnej na polskim rynku pojawiły się 2 produkty o nazwach Ekstra-Line i Diabex (FITO PHARM 19

Przegląd literatury Sp. z o.o., Mysiadło, powiat Piaseczno) zawierające erytrytol w swoim składzie. Ich ceny wahają się w granicach około 10-15zł za 125g produktu (http://www.okazje.info.pl/okazja/zdrowie-i-uroda/fitofarm-extra-linieniskokaloryczny-cukier.html; http://www.alejahandlowa.pl/tr/produkt/fitofarm-diabex-- -niskokaloryczny-cukier-dla-zabierzow_2841527.html). Fot. 1 Produkty firmy FITO PHARM zawierające erytrytol (Źródło:http://www.domzdrowia.pl/92873,diabex-niskokalorycznycukier-dla-diabetykow-400-g.html; http://www.domzdrowia.pl/69718,extra-linie-niskokalorycznycukier-25-saszetek-5-g.html) Według raportu Frost i Sullivan (2007) wzrastające zapotrzebowanie na żywność niskokaloryczną poszerzyło możliwości aplikacji alkoholi cukrowych i pozytywnie wpłynęło na ich wzrost produkcji w Europie. Spowodowało to również, że na europejskim rynku polioli zaznaczyła się rosnąca konkurencja ze strony azjatyckich producentów, co wywarło znaczący wpływ na cenę tych produktów. Autorzy tego raportu podkreślają, że koncentrując się na jakości, obsłudze klienta i nowych produktach, europejscy producenci polioli będą w stanie sprostać konkurencji wynikającej z tanich produktów oferowanych przez firmy azjatyckie. Według tego raportu w przyszłości ma zachodzić jeszcze większa intensyfikacja tej konkurencji, dlatego też, producenci z Europy będą musieli szukać tańszych surowców w celu obniżenia kosztów produkcji. Jak podaje chiński Instytut Shandong Food & Fermentation Industry na swojej stronie internetowej (http://www.sdspfjy.com.cn/zdyj/zdyj1-7e.htm), cena erytrytolu wynosi ok. 6,5-7 tyś. dolarów/tonę, natomiast koszt produkcji jednej tony wynosi 2,5 tyś. dolarów. Przy rocznej produkcji 5 tysięcy ton można osiągnąć dochód w wysokości 35 mln. dolarów, przy czym zysk wynosi 22 mln. dolarów. Warto także 20

Przegląd literatury podkreślić, że według tych kalkulacji koszty produkcji erytrytolu stanowią około jedną trzeciej ceny tego związku. Dokładna analiza ekonomiczna związana z biosyntezą erytrytolu z sacharozy została przedstawiona przez Bippesa (2007). Otóż według tego badacza koszty produkcji 1 tony erytrytolu wynoszą około 2,5 tyś. euro (co odpowiada około 3,5 tyś. dolarów), zakładając roczną produkcję na poziomie 5 tyś. ton. Dogłębna analiza kosztów zużycia materiałów i energii wykazała, że 80% tych kosztów stanowią składniki podłoża, natomiast 20% koszty związane z energią. Wśród składników podłoża najdroższymi okazały się substrat- sacharoza, której cena (450 euro/tonę) stanowiła 74% kosztów, a także ekstrakt drożdżowy (20%). Oprócz tych kosztów największy wpływ na cenę erytrytolu miały także: czas fermentacji, stężenie substratu, produktu oraz wydajność jego tworzenia. Stąd autor podkreśla, że znaczącą rolę w realizacji tego typu inwestycji mają badania uwzględniające wyżej wymienione aspekty i głównie należy obniżyć koszty związane ze składnikami podłoża. Idealnym rozwiązaniem wydaje się być zastąpienie węglowodanowego substratu tanim i łatwo dostępnym surowcem, jakim niewątpliwie może być glicerol odpadowy. Jak podaje portal http://www.icispricing.com cena odpadowego glicerolu w Europie w 2010 roku wahała się w granicach 180-220 euro/tonę czyli była o połowę niższa niż cena sacharozy. Analizując dane z tab. 6 można zaobserwować jak wygląda struktura sprzedaży, wielkość zakładów i struktura zatrudnienia w firmie Binzhou Sanyuan Biotechnology, która posiada najnowsze i największe zakłady produkujące erytrytol w Chinach. Oceniając materiały promocyjne zamieszczone na stronie internetowej www.jungbunzlauer.com można zauważyć, że strategia reklamy dla produktów zawierających erytrytol opiera się w głównej mierze na jego doskonałych właściwościach odżywczych oraz naturalności czyli naturalnym pochodzeniu i metodzie produkcji. 21

Przegląd literatury Tabela 6. Struktura sprzedaży oraz informacja o zakładach firmy Binzhou-Sanyuan- Biotechnology, Binzhou, Chiny (Źródło: http://www.trademanager.mobi/binzhousanyuan-biotechnology-co-ltd.html) Sprzedaż Główne rynki sprzedaży Sprzedaż roczna Ameryka Północna, Południowa, Europa Zachodnia, Azja Południowo- Wschodnia, Afryka, Oceania, Środkowy Wschód, Azja Zachodnia, Europa Wschodnia 5-10 mln dolarów Eksport 81%-90% Informacje o zakładach Wielkość 3000-5000 m 2 Liczba linii produkcyjnych 4 Liczba pracowników pracujących umysłowo 21-30 Liczba pracowników pracujących fizycznie 11-20 Systemy zarządzania jakością HACCP ISO 9001:2000 ISO 14001:2004 1.3.2 Produkcja chemiczna Erytrytol można uzyskać różnymi metodami chemicznymi. Jedną z możliwości syntezy erytrytolu na drodze chemicznej jest reakcja chlorowcowania 2-buten-1,4-diolu z uwodnionym węglanem w środowisku alkalicznym. Końcowy etap to reakcja zmydlania powstającej erytro-2-chlorohydryny z alkalicznym węglanem sodu (rys. 4a). Proces ten stanowi alternatywę dla reakcji bromowania tego substratu, po którym następuje rozdzielenie bromianów i przekształcenie w środowisku wodnym dioksybutadienu w erytrytol. Metoda ta jest droższa, bardziej skomplikowana i odznacza się gorszą wydajnością (Reppe i Schnabel 1943). Erytrytol może również powstać w wyniku redukcji dialkiloestru kwasu winowego w obecności katalizatora miedziowo-chromianowego. Jednak drugim tworzącym się produktem jest odpowiedni alkohol alkilowy, który występuje w ilościach dwukrotnie większych w stosunku do erytrytolu (rys. 4b) (Trenner i Bcher 1951). Hydratacja samego kwasu winowego przy udziale katalizatora niklowego Raneya prowadzi natomiast do powstania mieszaniny 22

Przegląd literatury erytrytolu i treitolu, która wymaga rozdzielenia lub też katalitycznej izomeryzacji (rys. 4c) (Elseviers i wsp. 1998). Kolejną metodą jest hydroliza skrobi dialdehydowej do równomolowej mieszaniny erytrytolu i glikolu etylenowego (rys. 4d). W tym przypadku substrat wymaga odpowiedniego przygotowania polegającego na zastosowaniu wysokich temperatur (200-300ºC) i wysokiego ciśnienia (12-14 MPa), a także użyciu odpowiedniego katalizatora niklowego (Sloan i wsp. 1957; Pfeifer i wsp. 1960). a) b) Buten-2-1,4-diol Erytrolo-2- Erytrytol chlorohydryna c) d) Dialkiloester kwasu winowego Erytrytol Kwas winowy Treitol Erytrytol Skrobia Erytrytol Glikol dialdehydowa etylenowy Rys. 4 Produkcja chemiczna erytrytolu z udziałem różnych substratów (Źródło: Bippes 2007) Reasumując, produkcja chemiczna erytrytolu jest całkowicie nieopłacalna w procesie przemysłowym ze względu na: wysokie koszty energii i substratów, problemy z rozdziałem dodatkowych produktów, a także obecność szkodliwych substancji powstających lub towarzyszących temu procesowi. Tym samym jedynym prostym rozwiązaniem wydaje się być użycie do tego celu metod biologicznych z użyciem mikroorganizmów 1.3.3 Produkcja biotechnologiczna Erytrytol jako jedyny ze wszystkich alkoholi wielowodorotlenowych jest produkowany na skalę przemysłową w procesie biotechnologicznym, w którym 23

Przegląd literatury wykorzystuje się zdolność niektórych drożdży oraz grzybów, szczególnie gatunków osmofilnych, do nadprodukcji tego związku. W roku 1953 Binkley i Wolform po raz pierwszy zasugerowali, że erytrytol może być produkowany przez drożdże na podstawie analizy śladowych jego ilości znajdujących się w melasie po procesie fermentacji. W kolejnych latach Spencer i Sallans (1956) oraz Onishi (1960, 1961) w swoich badaniach wykazali, iż to głównie osmofilne drożdże są zdolne do produkcji polioli, w tym erytrytolu. Od tamtego czasu trwają intensywne badania nad selekcją mikroorganizmów i doskonaleniem procesu biosyntezy tego związku. W opracowaniach naukowych wiele uwagi poświęcono izolacji i udoskonalaniu szczepów (Ishizuka i wsp. 1989), optymalizacji składu podłoża i warunków hodowlanych (Hajny i wsp. 1964, Ishizuka i wsp. 1989, Park i wsp. 1998a). 1.3.3.1 Mikroorganizmy Uzdolnienia do nadprodukcji erytrytolu zaobserwowano u osmofilnych drożdży należących do rodzajów Pichia, Zygopichia, Candida, Debaryomyces, Moniliella, Torula, Torulopsis, Trigonopsis, Trichosporon, Trichosporonoides, Pseudozyma (Onishi i wsp. 1960; Chida i Ochiai 1998; Suh i wsp. 1999a; Lin i wsp. 2002; Park i wsp. 2005; Jeya i wsp. 2009), a także u niektórych grzybów (Aspergillus, Penicillium, Beauveria, Ustilago) (JL Yuill 1948; Hirata i wsp. 1999; Lee i Lim 2003; Tarocco i wsp. 2005) i bakterii np. Leuconostoc oenos (Veiga-Da-Cunha i wsp. 1992). Według Hattori i Suzuki (1974) oraz Dezeeuw i Tynan (1973) takie predyspozycje wykazują również drożdże Y. lipolytica. W procesie przemysłowym wykorzystywany jest szczep Trichosporonoides megachiliensis SN-G42 (dawniej Aureobasidium sp. SN-G42), który może produkować erytrytol z 335 g/l glukozy z wydajnością 0,47 g/g i szybkością objętościową równą 2 g/lh, czas trwania tego procesu to 96 godzin (Sawada i wsp. 2009). W zależności od danego szczepu jak i jego warunków wzrostu oprócz erytrytolu mogą tworzyć się w różnych proporcjach inne poliole, stanowiące produkty uboczne, takie jak: glicerol, rybitol, arabitol lub mannitol. W badaniach nad produkcją erytrytolu stosowano zarówno szczepy pochodzące z różnych kolekcji (m in. American Type Culture Collection, Korean Culture Center for Microorganism, Central Bureau voor Shimmelcultures- Holandia, National Institute of Bioscience and Technology, Ministry 24

Przegląd literatury of Trade and Industry- Japonia) jak i szczepy dzikie. Źródła ich izolacji przedstawiono w tab. 7. Ilość wyizolowanych szczepów zdolnych do produkcji erytrytolu spośród wszystkich izolatów wahała się w granicach od 0,3 (Wako i wsp. 1988) do 5,47% (Aoki i wsp. 1993). Większość z tych mikroorganizmów odznaczała się wysoką osmotolerancyjnością ze względu na środowisko występowania. W celu poprawy tych predyspozycji, zmniejszenia zdolności do tworzenia piany i w efekcie poprawienia wydajności całego procesu biosyntezy, dokonywano mutacji wyizolowanych szczepów promieniami UV, środkami chemicznymi (głównie NTG- N-metylo-N-nitrozoguanidyna) (Ishizuka i wsp. 1989; Lee i Lim 2003) lub za pomocą fuzji protoplastów (Liu i wsp 2008). Zazwyczaj stosowano metody polegające na łączeniu obu rodzajów mutacji i ich wielokrotnym powtarzaniu (Park i wsp. 2005, Abe i Morioka 1999). Tabela 7. Źródła izolacji mikroorganizmów produkujących erytrytol Źródło izolacji Mikroorganizm Literatura owoce świeże i kandyzowane miód plastry miodu pyłki kwiatów roztwory sacharozy pasta fasolowa Miso sos sojowy Moniliella sp. Lin i wsp. (2002) Moniliella sp. Trichosporon sp. Trichosporonoides sp. Trichosporon sp. Candida sp. Moniliella sp. Trichosporon sp. Trichosporonoides sp. Ustilago sp. Torula sp. Pichia sp. Pichia miso, Debaryomyces mogii P. mogii Pichia sp. Debaryomyces hansenii Lin i wsp. (2002) Aoki i wsp. (1993) Aoki i wsp. (1993) Park i wsp. (1998b) Kim i wsp. (1996) Lin i wsp. (2002) Aoki i wsp. (1993) Aoki i wsp. (1993) Hirata i wsp. (1999) Kim i wsp. (1999) Cho i wsp. (1999a) Mogi (1939) Ohara i Nonomura (1954) Onishi (1961) ścieki z cukrowni Moniliella sp. Lin i wsp. (2002) szlamy Pseudozyma tsukubaensis Jeya i wsp. (2009) gleba po uprawie: a) trzciny cukrowej w Okinawie b) kukurydzy Aureobasidium sp. Penicillum sp. Ishizuka i wsp. (1989) Lee i wsp. (1997) 25

Przegląd literatury 1.3.3.2 Analiza składników podłoża do produkcji erytrytolu i wpływ ciśnienia osmotycznego Okazuje się, że skład podłoża produkcyjnego może mieć kluczowe znaczenie w biosyntezie erytrytolu przez drożdże. Produkcja tego zamiennika sacharozy zależy między innymi od: wysokiego stężenia substratu, odpowiedniego źródła azotu i fosforu, a także dodatkowych substancji takich jak: chlorki czy jony miedzi i manganu. Głównymi substratami biorącymi udział w procesie tworzenia erytrytolu przez drożdże są: glukoza, fruktoza, sacharoza, czy hydrolizaty skrobiowe (Aoki i wsp. 1993; Yang i wsp. 1999; Yu i wsp. 2006). Próbowano także zastosować inne substraty takie jak glicerol (Jeya i wsp. 2009) oraz n-alkany (Hattori i Suzuki 1974a), ale produkcja z ich udziałem nie była na tyle korzystna niż w przypadku węglowodanów. W podłożach produkcyjnych najczęściej stosowane były organiczne źródła azotu takie jak: ekstrakt drożdżowy, słodowy, namok kukurydziany, mocznik lub pepton (Sasaki i wsp. 1990; Horikita i wsp. 1990; Burschäpers i wsp. 2002). Pozostałe składniki podłoża, zawierające inne pierwiastki biogenne takie jak fosfor czy siarkę, dodawane były do podłoża w postaci połączeń nieorganicznych pod postacią wodorofosforanu potasu i siarczanu magnezu. Jedynym alternatywnym źródłem fosforu w stosunku do KH 2 PO 4, który przyczynił się do polepszenia produkcji erytrytolu był kwas fitynowy (Lee i wsp. 2001 a). W oparciu o dane literaturowe do większości podłoży hodowlanych dodawano ekstrakt drożdżowy, który jest bogatym i pełnowartościowym źródłem witamin dla drożdży. Oceniono także wpływ poszczególnych witamin, zwłaszcza z grupy B i wśród tego rodzaju związków największe znaczenie dla produkcji erytrytolu miała tiamina (Sawada i wsp. 2009). Ponadto badacze zaobserwowali, że wysokie stężenie substratu lub jony chlorkowe mogą powodować wzrost ciśnienia osmotycznego w podłożu, które wywołuje w komórkach drożdżowych akumulację polioli, w tym erytrytolu (Kayingo i wsp. 2001, van Eck i wsp. 1993). Związek ten jest produkowany w odpowiedzi na stres osmotyczny komórki, a następnie akumulowany w jej wnętrzu jako roztwór chroniący przed wyciekiem wody. Do tego rodzaju substancji należą również glicerol i inne poliole takie jak: arabitol, sorbitol i mannitol (Canh i wsp. 1975). Jednakże ze względu na swój niski ciężar cząsteczkowy erytrytol, podobnie jak glicerol są uważane za bardziej skuteczne w regulacji ciśnienia osmotycznego, niż związki o wyższym ciężarze takie jak np. mannitol (Hallsworth i Magan 1996). Roztwory te nie mogą być dla komórki toksyczne nawet w wysokich stężeniach, niezbędnych podczas równowagi osmotycznej. Transport tego rodzaju związków w komórkach drożdżowych może 26

Przegląd literatury przebiegać w różny sposób w zależności od gatunku, a także rodzaju substancji uczestniczącej w osmoregulacji. U drożdży S. cerevisiae funkcję osmoregulacyjną pełni glicerol. Jest on transportowany na zasadzie dyfuzji ułatwionej za pomocą specjalnych białek transportujących, które po aktywacji umożliwiają wyciek glicerolu oraz jonów z komórki aż do obniżenia poziomu regulacyjnego (Chamberlin i Strange 1989). Kanały białkowe otwierają się w warunkach hipoosmotycznych, a zamykają w warunkach hiperosmotycznych tak, aby kontrolować wyciek bądź gromadzenie tego alkoholu (Luyten i wsp. 1995, Tamás i wsp. 1999). Inne poliole takie jak: ksylitol, rybitol, arabinitol, mannitol, sorbitol i galaktitol, nie są utylizowane przez te drożdże, ale mogą być transportowane na zasadzie dyfuzji prostej poprzez pory w membranie. Inaczej natomiast jest przenoszony erytrytol, gdyż jest on wychwytywany przez komórkę i zamykany tuż przy powierzchni błony (Canh i wsp. 1975). U drożdży Rhodotorula gracilis, Torulopsis candida i Candida intermedia zaobserwowano natomiast aktywny transport polioli (Klöppel i Höfer 1976; Haškovec i Kotyk 1973; Loureiro-Dias 1987). U R. gracilis były to dwa systemy transportujące: konstytucyjny o niskim powinowactwie i charakterystyczny dla pentitoli indukcyjny o wysokim powinowactwie (Klöppel i Höfer 1976). W komórkach C. intermedia dochodziło do aktywnego transportu polioli (sorbitol, xylitol, arabinitol i mannitol) na zasadzie specyficznego systemu symportu H + -poliol (Loureiro-Dias 1987). Według Silva-Graça (2004) u halofilnych drożdży C. halophila aktywny transport mannitolu odbywa się przypuszczalnie także na zasadzie symportu (rys. 5), który wykazuje słabe powinowactwo w stosunku do mannitolu, odbywa się bez wycieku protonów i jest wysoce specyficzny w stosunku do zewnątrzkomórkowego ph. Rys. 5 Aktywny transport mannitolu u C. halophila (Źródło: Silva-Graça 2004) 27