PL 222528 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 222528 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 398670 (22) Data zgłoszenia: 30.03.2012 (51) Int.Cl. C12J 1/04 (2006.01) C12P 7/54 (2006.01) C12R 1/02 (2006.01) (54) Sposób uruchomienia fermentacji octowej w warunkach przemysłowych (43) Zgłoszenie ogłoszono: 14.10.2013 BUP 21/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.08.2016 WUP 08/16 (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOTECHNOLOGII PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO IM. PROF. WACŁAWA DĄBROWSKIEGO, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: MARIA SPERA, Mysiadło, PL IRENA SIKORSKA, Warszawa, PL ANNA MISIEWICZ, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Maria Rożkowicz
2 PL 222 528 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób uruchomienia fermentacji octowej prowadzony w warunkach przemysłowych. Wynalazek należy do dziedziny procesów biotechnologicznych stosowanych w przemyśle spożywczym. Bakterie kwasu octowego są znane ze zdolności do szybkiego i niecałkowitego utleniania substratów będących źródłem węgla, szczególnie cukrów i alkoholi. Te właściwości są wykorzystywane w wielu procesach biotechnologicznych w szczególności w procesie otrzymywania octu, w którym kwas octowy jest wytwarzany z etanolu. Ocet jest produktem otrzymanym przez fermentację alkoholową, a następnie octową z odpowiednich surowców pochodzenia roślinnego zawierających węglowodany lub przez fermentację octową produktów zawierających alkohol etylowy, otrzymanych z surowców pochodzenia roślinnego. Ocet zawiera kwas octowy w określonym stężeniu: od 50 g/l do maksymalnego, możliwego do osiągnięcia w wyniku biologicznego procesu. Ocet może zawierać dodatki smakowo-aromatyczne takie jak: soki lub/i koncentraty soków lub/i wyciągi z owoców, warzyw, ziół, korzeni i innych dopuszczonych do spożycia roślin lub/i części tych roślin. Ocet cydrowy (jabłkowy) jest używany jako składnik środków parafarmaceutycznych, odchudzających, obniżających ciśnienie krwi, może być stosowany jako środek spożywczy lub naturalny środek bądź składnik środków czyszczących. Do produkcji octu stosuje się różne surowce w zależności od ich dostępności i regionalnej tradycji. Substraty zawierające etanol: wino, piwo, przefermentowany sok owocowy mogą być poddawane bezpośrednio fermentacji octowej. Inne surowce wymagają uprzedniego przefermentowania węglowodorów do etanolu. Surowce zawierające skrobię muszą być odpowiednio przygotowane przed fermentacją alkoholową. W produkcji octu stosuje się również rozcieńczony spirytus różnego pochodzenia. Najlepszy do produkcji octu spirytusowego jest spirytus rektyfikowany. Produkt otrzymany przez rozcieńczenie kwasu octowego, otrzymanego na drodze syntezy chemicznej nie jest octem. Alkohol etylowy jest biokatalizowany przez odpowiednie szczepy bakterii kwasu octowego (AAB acetic acid bacteria) do kwasu octowego. Bakterie kwasu octowego są chemoorganotrofami mogą wykorzystywać tylko energię uwalnianą ze związków organicznych. Nie są zdolne do metabolizmu beztlenowego zawsze ostatecznym akceptorem elektronów jest tlen. Fermentacja octowa nie jest w pełnym tego słowa znaczeniu fermentacją lecz procesem oddychania. Główną cechą bakterii fermentacji octowej jest zdolność utleniania etanolu do kwasu octowego. Obecnie bakterie kwasu octowego klasyfikowane są w 5 rodzajach: Acetobacter (A.), Gluconacetobacter (Ga.), Gluconobacter (G.), Acidomonas (Ac.) i Asaia (As.). W niniejszym dokumencie wykorzystano podział starszy bakterii na Gluconobacter i Acerobacter. Wśród bakterii mających zastosowanie przemysłowe wymienia się rodzaje: Gluconobacter, Gluconacetobacter i Acetobacter, Gluconobacter są bezwzględnymi tlenowcami, utleniają etanol tylko do kwasu octowego. Cukry rozkładają z wytworzeniem kwasów Gluconobacter występują na kwiatach, owocach warzywach, w południowo-afrykańskim piwie kefirowym, jabłeczniku, winie, winnym occie, drożdżach piekarskich oraz glebie ogrodowej. Bakterie rodzajów Gluconacetobacter i Acetobacter utleniają etanol do kwasu octowego i dalej do CO 2 i H 2 O. Octany i laktozę utleniają do dwutlenku węgla i wody. Bakterie rodzaju Acetobacter występują na owocach, warzywach, w skwaśniałych sokach owocowych i napojach alkoholowych oraz w occie. Acetobacter xylinum zdolne są do wytwarzania celulozy, rosną na powierzchniach cieczy w postaci kożuszka. W przemyśle octowniczym, szczególnie w fermentorach z wypełnieniem są niepożądane ponieważ zalepiają złoże wypełnienia. Większość gatunków bakterii octowych utlenia glukozę do kwasu glukonowego lub nawet ketoglukonowego. Niektóre utleniają maltozę oraz sacharozę. Mogą wytwarzać kwas szczawiowy z wielu cukrów i kwasów organicznych. Szczepy bakterii kwasu octowego zazwyczaj wykazują wzrost w temperaturach od kilku do 40 C. Większość szczepów nie toleruje jednak temperatur wyższych niż 37 C. Optymalna temperatura zależy od warunków hodowli: stężeń alkoholu etylowego i kwasu octowego, dostępności składników pożywki, stężenia tlenu i zazwyczaj mieści się w przedziale 25 30 C. Optymalny odczyn podłoża dla wzrostu bakterii kwasu octowego mieści się w zakresie ph 5,0 6,0. Bakterie rosną i tworzą kwas octowy w podłożach o ph 4,0 4,5. W podłożach obojętnych lub słabo alkalicznych wzrost mikroorganizmów jest bardzo słaby. W warunkach przemysłowych za-
PL 222 528 B1 3 adaptowane szczepy bakterii octowych rozmnażają się i wytwarzają kwas octowy przy ph około 3 i niższym. Tlen jest substratem fermentacji octowej. W zależności od sumarycznego stężenia cieczy w fermentorze, metody prowadzenia fermentacji i jej intensywności w danej chwili przerwy w napowietrzaniu hamują przebieg fermentacji i mogą doprowadzić do obumarcia bakterii. Zarówno substrat etanol jak i kwas octowy są inhibitorami wzrostu bakterii octowych. Z tego względu wzrost bakterii i fermentacja są możliwe jedynie w pewnych zakresach stężeń tych substancji. Stężenie etanolu w czasie fermentacji nie powinno przekraczać 4 5% obj. Niektóre szczepy, w zależności od podłoża mogą wytrzymywać stężenie etanolu 10 16% obj., ale im wyższe stężenie alkoholu tym niższe powinno być stężenie kwasu octowego w podłożu. Acetobacter i Gluconacetobacter są zdolne do nadoksydacji po wyczerpaniu etanolu mogą utleniać kwas octowy do CO 2 i H 2 O (przy sumarycznym stężeniu podłoża około 6 7%). Proces ten jest bardzo niekorzystny w przemyśle i może prowadzić do dużych strat produktu. Fermentacja octowa może być prowadzona w zbiornikach z wypełnieniem drobnoustroje wzrastają na powierzchni wypełnienia bądź w fermentorach wgłębnych drobnoustroje są zawieszone w cieczy. W metodach powierzchniowych bakterie hodowane są na powierzchni cieczy w postaci kożuszka mogą też wpełzać na ścianki naczynia. Jest to metoda najstarsza, przy jej wykorzystaniu można otrzymywać ocet winny lub owocowy o mocy do 8%. Pewną modyfikacją metody powierzchniowej, w której powierzchnia kontaktu faz gazowej i ciekłej zostaje rozwinięta, są metody ociekowe. W metodach ociekowych ciecz spływa po porowatym materiale (najczęściej są to wióry bukowe), uzyskuje się rozwinięcie powierzchni kontaktu fazy ciekłej i gazowej. Przykładem metody ociekowej stosowanej na skalę przemysłową jest metoda generatorowa, w której fermentację prowadzi się w drewnianej kadzi zaopatrzonej w ruszt. Przestrzeń nad rusztem jest wypełniona wiórami, na których rosną bakterie octowe. Złoże okresowo przy użyciu pompy zraszane jest cieczą gromadzącą się pod rusztem. Dmuchawą podaje się powietrze do wnętrza kadzi. Metoda ta w 1932 roku została usprawniona przez Fringsa. W metodzie wgłębnej wzrost bakterii i fermentacja prowadzone są w cieczy w zbiornikach o objętości roboczej od kilku litrów do kilkudziesięciu metrów sześciennych. W tej metodzie powietrze dostarczane przez mieszadło samozasysające rozpraszane jest w postaci drobniutkich pęcherzyków. W fermentorze regulowane są temperatura, przepływ powietrza, może być mierzone stężenie alkoholu. Zainstalowane pompy umożliwiają automatyczne napełnianie i opróżnianie zbiornika. Metoda wgłębna pozwala na wytwarzanie octu z większą produktywnością i na większą skalę niż metody powierzchniowe. Fermentacja octowa w warunkach przemysłowych może być prowadzona z użyciem jednorodnej kultury bakterii, wyhodowanej z jednego wyjściowego szczepu, najczęściej w warunkach laboratoryjnych bądź też mieszaniny szczepów, pozyskanej w czasie kolejnych samorzutnych selekcji w czasie wielu fermentacji tzw. octu zarodowego ( matki octowej ). Ocet zarodowy pochodzi z prowadzonego wcześniej procesu fermentacji i jest często mieszanką niezidentyfikowanych szczepów otrzymaną poprzez samorzutną selekcję następującą podczas wcześniejszych fermentacji octowych. W occie zarodowym znajduje się nie odfermentowany całkowicie alkoholu etylowy, zazwyczaj 1 2% objętościowych. Ocet zarodowy jest przechowywany w temperaturze od kilkunastu do dwudziestu kilku stopni Celsjusza, z dostępem powietrza, bakterie mają dostęp do powietrza, ale w czasie przechowywania (kilka-kilkadziesiąt godzin, a niekiedy nawet dłużej) objętość cieczy nie jest stale mieszana i napowietrzana, co wpływa na zmniejszenie liczby żywych komórek i zmiany w składzie populacji mikroorganizmów. W czasie przechowywania bakterie kwasu octowego w dużej mierze tracą swą aktywność, są bowiem bardzo wrażliwe na niedobory tlenu. Stosowane obecnie sposoby uruchomienia fermentacji octowej w warunkach przemysłowych zależą od rodzaju otrzymywanego octu, jego mocy, posiadanych urządzeń, tradycji, dostępu do odpowiednich mikroorganizmów. W metodach powierzchniowych, w tym również i ociekowych, kiedy intensywność fermentacji jest mniejsza, a otrzymywany ocet ma niższą kwasowość do zaszczepienia fermentera stosuje się tzw. ocet zarodowy (matkę octową). Wykorzystanie octu zarodowego do rozpoczęcia fermentacji nie gwarantuje warunków, w których fermentacja będzie prowadzona przy użyciu najbardziej korzystnego szczepu bakterii, tym bardziej, że fermentacja octowa jest prowadzona w niesterylnych warunkach. W zbiornikach fermentorów wgłębnych o objętości od kilku do kilkudziesięciu metrów sześciennych lub większych uruchomienie fermentacji octowej można prowadzić przy użyciu kultury starterowej pochodzącej z innego, najlepiej sąsiedniego, działającego fermentera, bądź, z tzw. octu zarodo-
4 PL 222 528 B1 wego, pochodzącego z innej jednostki produkcyjnej, albo z wykorzystaniem kultury starterowej, zazwyczaj jednorodnej, pochodzącej z działającego fermentera pilotowego. W trakcie uruchamiania fermentera konieczne jest odpowiednie i nieprzerwane mieszanie i napowietrzanie cieczy w fermentorze, a także regulacja temperatury oraz okresowe monitorowanie kwasowości. Czas potrzebny do uruchamiania fermentera produkcyjnego, czyli do zaobserwowania zmian kwasowości możliwych do wykazania powszechnie znanymi metodami analitycznymi, zależy od ilości, stanu fizjologicznego i pochodzenia bakterii używanych do inokulacji, i trwa od kilku dni, nawet do kilku tygodni. Fermentacja octowa jest prowadzona przy użyciu szczepów bakterii, które można zaliczyć do ekstremofilii, charakteryzujących się zdolnością do wzrostu i fermentacji w środowisku o niskim odczynie ph. W przemyśle proces odbywa się w warunkach niesterylnych. Nie sterylizuje się powietrza, jedynie można je filtrować w celu oddzielenia większych cząstek stałych. W przemyśle, przede wszystkim ze względu na ograniczenie strat alkoholu przez odparowanie, wpływające na ogólną wydajność procesu, fermentację prowadzi się w dość szczelnych zbiornikach. W fermentorach produkcyjnych po zaszczepieniu brzeczki kulturą starterową bakterii octowych i następnie namnożeniu ich, można prowadzić proces fermentacji jedną z metod powtarzalno-okresową albo ciągłą. Ze stanu techniki znane jest szczepienie przemysłowych fermentorów octowych prowadzone okresowo tj. z wykorzystaniem metody powtarzalno-okresowej. W metodzie powtarzalno-okresowej proces dzieli się na szarże. Szarża trwa od chwili wlania do fermentora brzeczki do momentu odfermentowania alkoholu do określonego stężenia (możliwie najniższego ze względu na posiadane warunki technologiczne, nawet 0,3 0,2% obj.). Pod koniec szarży z fermentora wypompowuje się część cieczy do fermentora produkcyjnego (zazwyczaj 1A) i natychmiast do fermentora dopompowuje się świeżą brzeczkę. Przy otrzymywaniu octu 10% brzeczka zawiera ok. 1 g/100 ml kwasu octowego, 10% obj. alkoholu etylowego i odpowiednio dobraną ilość pożywki. Metodą powtarzalno-okresową można otrzymywać różnego typu ocet. Przy produkcji octu spirytusowego o stężeniu 10 g/100 ml i wymianie 50% objętości podłoża w fermentorze szarże trwają ok. 20 24 godzin. Przy wytwarzaniu octów słabszych szarże są krótsze. Metodą powtarzalno- -okresową można otrzymywać ocet o mocy ok. 16 g/100 ml (fermentacja jednostopniowa, odpowiednio zaadaptowany szczep bakterii). Należy zwrócić uwagę na fakt, iż im wyższe sumaryczne stężenie w fermentorze tym groźniejsze są niedobory tlenu, przy fermentacji brzeczki o sumarycznym stężeniu 11% nawet 15 sekundowa przerwa w napowietrzaniu może znacznie spowolnić fermentację przedłużyć daną szarżę o kilka godzin i znacznie obniżyć szybkość fermentacji w 3 4 następnych szarżach. Ponadto w czasie fermentacji prowadzonej metodą powtarzalno-okresową nie można dopuścić do nadmiernego odfermentowania alkoholu etylowego wiąże się to z zamieraniem bakterii, koniecznością regeneracji kultury starterowej, wydłużeniem czasu namnażania bakterii w kilku kolejnych cyklach fermentacyjnych. Zazwyczaj czas upływający pomiędzy dodawaniem kolejnych porcji inokulum wynosi od kilku do dwudziestu kilku godzin i zależy od szybkości fermentacji, czyli głównie od sumarycznego stężenia cieczy w fermentorze pilotowym. Szczepienie fermentora przemysłowego prowadzone tym sposobem trwa kilka dni, przy czym czas zależy od sumarycznego stężenia brzeczki. Z publikacji SU 1337406 znany jest sposób hodowli bakterii do produkcji octu, w kaskadzie fermentorów, w którym bakterie kwasu octowego pobrane z probówki lub z głównego fermentora kaskady, hoduje się w fermentorze zarodowym o objętości roboczej stanowiącej 60 80% objętości głównego fermentora, aż do osiągnięcia stężenia kwasu octowego, równego stężeniu w fermentorze głównym, co odpowiada fazie wzrostu ustalonego bakterii. Jednocześnie z głównego fermentora przenosi się całą hodowlę do drugiego fermentora kaskady, a do głównego fermentora wprowadza się ciecz z fermentora zarodowego. Takie odnowienie populacji w fermentorze głównym powtarza się co 20 30 dób prowadzenia ciągłej hodowli. Hodowle w fermentorze zarodowym prowadzi się metodą okresową. Z opisu patentowego PL 164743 znany jest sposób wytwarzania octu przy zastosowaniu bakterii rodzaju Acetobacter aceti MW-2, w którym do zapoczątkowania fermentacji stosuje się szczep wyizolowany i przechowywany w stacjonarnej hodowli powierzchniowej na podłożu półciekłym. Bakterie namnożone na podłożach półciekłych są przenoszone do fermentora o objętości kilku litrów (objętość robocza 3 dm 3 ) zawierającego podłoże produkcyjne. Zawartością tego fermentora jest szczepiony fermentor produkcyjny, w którym fermentacja jest prowadzona w znany sposób, czyli po odfermentowaniu alkoholu do 0,2 0,5% obj., 20 50% zawartości fermentora wymienia się na świeżą brzeczkę o zawartości alkoholu 10 14% objętościowych i 1 2 g/100 ml kwasu octowego przy
PL 222 528 B1 5 nieprzerwanym napowietrzaniu. Sposób prowadzenia fermentacji w fermentorach pilotowym i przemysłowym jest taki sam. Po odfermentowaniu alkoholu do 0,5% objętościowych z fermentora pilotowego usuwa się część cieczy, pozostawiając 1,5 dm 3 i dodaje taką samą objętość brzeczki. Fermentor przemysłowy napełniony napowietrzoną i podgrzaną brzeczką o składzie takim samym jak skład brzeczki w fermentorze pilotowym szczepi się okresowo inoculum z fermentora pilotowego. Po wlaniu kilku partii cieczy z fermentora pilotowego do fermentora przemysłowego stwierdzono przyrost zawartości kwasu octowego. Po osiągnięciu przyrostu zawartości kwasu octowego powyżej 0,5 g/100 ml w ciągu doby proces szczepienia fermentora przemysłowego uznano za zakończony. Ocet otrzymany w fermentorze przemysłowym jest następnie stosowany do zapoczątkowania fermentacji w kolejnych fermentorach przemysłowych w znany sposób. Problemem w stanie techniki jest brak elastycznego procesu prowadzenia fermentacji octowej. W dotychczasowych technologiach, proces produkcji octu wymaga stałego monitorowania przebiegu fermentacji w fermentorze pilotowym podczas szczepienia fermentora produkcyjnego w celu zachowania właściwych warunków i niedopuszczenia do spadku wydajności prowadzonego procesu. Przykładowo w metodzie powtarzalno-okresowej przekroczenie zalecanych stężeń alkoholu powoduje obniżenie aktywności komórek bakterii, a nawet ich zamieranie. Ponadto konieczne jest powtarzanie procesu inokulacji, co nie pozwala na prowadzenie ciągłej produkcji i znacząco wydłuża czas uruchamiania fermentora produkcyjnego i tym samym otrzymania gotowego produktu. Nieoczekiwanie niniejszy wynalazek dostarcza rozwiązanie dla powyższych problemów. Przedmiotem wynalazku jest sposób uruchomienia fermentacji octowej w fermentorze produkcyjnym przy wykorzystaniu kultury starterowej hodowanej w fermentorze pilotowym, stanowiącej około 1 3% objętości roboczej fermentora produkcyjnego, charakteryzujący się tym, że fermentor przemysłowy jest szczepiony w sposób ciągły bakteriami fermentacji octowej hodowanymi w fermentorze pilotowym. Korzystnie, stężenie alkoholu w cieczy opuszczającej fermentor pilotowy wynosi od 0,3 do 3% objętościowych, a stężenie kwasu octowego wynosi od 3 do 7 g/100 ml. Korzystnie, stopień napowietrzenia cieczy w fermentorze pilotowym wynosi 30 80%. W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku sumaryczne stężenie cieczy stosowanej jako inokulum wynosi od 4 do 10%. Wynalazek dotyczy sposobu uruchomienia fermentacji octowej w fermentorze produkcyjnym o objętości kilka metrów sześciennych lub więcej przy wykorzystaniu kultury starterowej hodowanej w fermentorze pilotowym o objętości roboczej kilku kilkudziesięciu litrów (od 2 do 25 I), stanowiącej około 1 3% objętości roboczej fermentora przemysłowego. Zgodnie ze sposobem w fermentorze pilotowym prowadzona jest fermentacja metodą ciągłą ciecz wypływająca z fermentora pilotowego bezpośrednio wpływa do fermentora produkcyjnego, szczepiąc zawartość fermentora produkcyjnego. Po kilkudziesięciu godzinach, prowadzenia procesu inokulacji w fermentorze produkcyjnym obserwowane są zmiany stężeń alkoholu (obniża się) oraz kwasu octowego (jest coraz wyższe), co świadczy o rozpoczęciu fermentacji octowej. W tym momencie można zakończyć proces innokulacji. Po rozpoczęciu fermentacji w fermentorze produkcyjnym należy dolać do fermentora brzeczkę produkcyjną. Można odczekać do odfermentowania alkoholu do zaplanowanego stężenia, albo od razu rozpocząć dolewanie brzeczki. Brzeczkę można dolewać ciągle, ze stałą albo zmienną szybkością przepływu, albo w jednej albo w kilku porcjach. Po pewnym czasie od rozpoczęcia szczepienia liczba bakterii w fermentorze przemysłowym w wyniku namnażania się wzrasta i staje się wystarczająca, aby prowadzić fermentację metodą powtarzalno-okresową (periodyczną) bądź ciągłą. Po rozpoczęciu fermentacji można również podwyższać sumaryczne stężenie fermentującej cieczy poprzez dodawanie brzeczki o coraz wyższym stężeniu sumarycznym i uzyskać ocet o wyższej mocy (stężeniu kwasu octowego nawet do 12,5 13 g/100 ml). Metodę stosuje się w procesie otrzymania octu cydrowego, ale może być ona wykorzystywana do uruchamiania fermentacji przy użyciu dowolnego surowca. W fermentorze pilotowym, gdzie prowadzona jest fermentacja metodą ciągłą sumaryczne stężenie cieczy w fermentorze obejmujące stężenie kwasu octowego i stężenie alkoholu etylowego oraz brzeczki zasilającej fermentor może wynosić od kilku do 10%. W fermentorze pilotowym alkohol etylowy nie jest odfermentowywany całkowicie, co oznacza że jego stężenie w cieczy wypływającej z fermentora wynosi 0,3 3% obj. W fermentorze produkcyjnym przygotowana jest brzeczka, która ma objętość przystosowaną do warunków technicznych (np. poziom umożliwiający zakrycie turbiny mieszadła, poziom umożliwiający
6 PL 222 528 B1 odpowiednie napowietrzanie zassanie powietrza, poziom umożliwiający wymianę ciepła między fermentującą cieczą i chłodnicą ( wężownicą ) podgrzanie i albo chłodzenie cieczy). Jest to objętość zazwyczaj kilka m 3, mniej niż połowa objętości roboczej fermentora. Sumaryczne stężenie brzeczki wynosi 4 10%. Brzeczka jest podgrzewana do temperatury, w której prowadzona jest fermentacja (25 35 C), w zależności od stężenia sumarycznego cieczy w fermentorze. Brzeczka poddana jest stałemu mieszaniu i napowietrzaniu. Brzeczki stosowane do fermentorów pilotowego i produkcyjnego mogą mieć różne stężenia sumaryczne i skład. Stosowana brzeczka, zarówno ta używana do zasilania fermentora pilotowego jak i produkcyjnego może zawierać alkohol etylowy pochodzący z dowolnego surowca (wina) lub ze spirytusu rektyfikowanego, oprócz alkoholu może zawierać kwas octowy otrzymany w wyniku fermentacji. Sumaryczne stężenie dozowanej brzeczki może wynosić od 4,0 do 10% w przypadku prowadzenia fermentacji metodą ciągłą, oraz od 6,0 do 13,5% w przypadku uruchamiana fermentora produkcyjnego, z zamiarem prowadzenia po uruchomieniu fermentacji metodą powtarzalno-okresową. Proporcje między alkoholem etylowym i kwasem octowym zawartymi w brzeczce wynoszą od 10:1 do 5:1,5. Brzeczka, w zależności od pochodzenia i składu surowca stosowanego do jej otrzymania może być wzbogacona odpowiednim dodatkiem składników, które są źródłem węgla i azotu, dodatkiem składników mineralnych, oraz biostymulatorów, jeśli są one nieobecne lub występują w niewystarczającej ilości w zastosowanym surowcu. Szybkość rozcieńczania stosowana w fermentorze pilotowym musi być dobrana tak, żeby nie powodować wymywania bakterii z fermentora. Szybkość rozcieńczania zależy od sumarycznego stężenia cieczy w fermentorze, sumarycznego stężenia dozowanej brzeczki, składu brzeczki, temperatury prowadzenia fermentacji, szybkości napowietrzania. Zaletą rozwiązania według wynalazku jest skrócenie procedury uruchamiania fermentora produkcyjnego w porównaniu ze znanymi metodami oraz brak konieczności ciągłego monitorowania przebiegu fermentacji w fermentorze pilotowym podczas szczepienia fermentora przemysłowego. Po ustaleniu warunków pracy fermentora pilotowego proces innokulacji fermentora produkcyjnego można prowadzić ciągle i dowolnie długo przy zachowaniu stałego dopływu brzeczki zasilającej do fermentora pilotowego, zachowaniu odpowiedniego napowietrzania oraz temperatury. Proces realizowany zgodnie z ideą wynalazku jest elastyczny, pozwala bowiem na optymalizację korzystnych zakresów stężeń alkoholu etylowego w cieczy opuszczającej fermentor pilotowy (0,3 3%) ze względu na produktywność biomasy. Zastosowanie zbyt niskiej szybkości rozcieńczania nawet przez kilka do kilkudziesięciu godzin nie powoduje zamierania mikroorganizmów. Natomiast zastosowanie zbyt wysokiej szybkości rozcieńczania nie od razu spowoduje wypłukanie drobnoustrojów z fermentora pilotowego. Kolejno, nie trzeba powtarzać procedury szczepienia, innokulacja może być prowadzona stale, nie grozi nadmierne odfermentowanie. W czasie fermentacji octów winnych i zbożowych, z uwagi na właściwości zastosowanego surowca, niskie napięcie powierzchniowe stosowanej brzeczki oraz obecność związków pianotwórczych powstaje dużo piany. Przykładowo, w czasie fermentacji brzeczki cydrowej, w czasie mieszania w fermentorze fermentującej cieczy i dotłaczanej brzeczki cydrowej powstają duże ilości piany. W metodzie powtarzalno-okresowej piana powstaje tylko przez pewien czas (w ciągu 0,5 1,0 h), ale jest jej dużo i powoduje wypienianie się z fermentora nieodfermentowanego produktu. Prowadzenie procesu metodą ciągłą według wynalazku w znaczący sposób powoduje obniżenie stopnia spienienia. Fig. 1 Zapoczątkowanie fermentacji octowej przy użyciu szczepu O 4 w fermentorze laboratoryjnym. Fig. 2 Przebieg fermentacji w fermentorze pilotowym na dobę przed rozpoczęciem szczepienia fermentora przemysłowego do chwili zakończenia szczepienia fermentora przemysłowego. Szczepienie fermentora przemysłowego rozpoczęto w chwili oznaczonej na osi czasu jako 0. Fig. 3 Przebieg fermentacji w fermentorze przemysłowym w trakcie szczepienia bakteriami z fermentora pilotowego. Fig. 4 Przebieg fermentacji ciągłej w fermentorze przemysłowym. Przedmiot wynalazku został bliżej wyjaśniony w przykładzie wykonania. P r z y k ł a d Namnażanie bakterii ze skosu przeprowadzono w fermentorze mikrotechnicznym (laboratoryjnym) o objętości roboczej 3 litry. Fermentor inokulowano jednorazowo szczepem O 4 bakterii Acetobacter pasteurianus, zarejestrowanym w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS pod numerem katalogowym KKP 674. Szczep ten charakteryzował się najwyższymi parametrami technologicznymi w czasie prowadzenia hodowli wstrząsanych. Bakterie kwasu octowego są hodowane na podłożu oznaczanym symbolem SS(1+3) jest to podłoże stałe o kwasowości około 1 g/100 ml (jako
PL 222 528 B1 7 kwas octowy) i zawierające około 3% obj. etanolu. Skosy po zaszczepieniu termostatowano w cieplarce, w temperaturze 28 30 C przez 4 5 dób. Po tym czasie wyhodowana biomasa bakterii była wykorzystywana do szczepienia kolejnych skosów, biomasę bakterii z jednego skosu przeszczepiano na 5 6 kolejnych skosów. Następnie zaszczepiono brzeczkę startową, w fermentorze mikrotechnicznym biomasą bakterii ze skosów agarowych w dawce: biomasa z jednego skosu na 100 ml brzeczki. Fermentor napełniono w połowie objętości roboczej spasteryzowaną brzeczką startową, którą stanowiło podłoże ciekłe CC(3+4) (mieszanina cydru, nie utrwalanego chemicznie octu cydrowego i wody w takich proporcjach, aby kwasowość podłoża wyniosła około 3 g/100 ml (jako kwas octowy), a zawartość alkoholu około 4% obj.; brzeczkę wzbogacano składnikami pożywki w dawkach: glukoza 1 g/l i fosforan diamonowy 0,45 g/l.). Brzeczkę podgrzewano do temperatury 30 C. Uruchomiono mieszanie, zawór regulujący przepływ powietrza zamknięto do momentu osiągnięcia szybkości kwaszenia około 0,1 g/100 ml w przeliczeniu na dobę, a następnie regulowano dopływ powietrza z rezerwą na przewidywany wzrost zapotrzebowania. Po odfermentowaniu alkoholu do stężenia 1% obj. dopełniono fermentor cydrową brzeczką produkcyjną CC(1+6) do pełnej objętości roboczej. Cydrową brzeczkę produkcyjną stanowiło podłoże CC(1+6) uzyskane przez zakwaszenie cydru octem cydrowym i rozcieńczenie wodą, w taki sposób by uzyskać zakładaną kwasowość i stężenie alkoholu; brzeczkę wzbogacono glukozą w dawce 1 g/l i fosforanem diamonowym w dawce 0,45 g/l. Na Fig. 1 przedstawiono zmiany kwasowości (k), stężenia alkoholu (a wartość uzyskana na podstawie analiz) w trakcie namnażania bakterii szczepu O 4 w fermentorze mikrotechnicznym. Na wykresie naniesiono również zmiany sumarycznego stężenia (S) cieczy w fermentorze uzyskane na podstawie analiz i obliczeń ( =k+a). Po upływie kilkudziesięciu (70 90) godzin od szczepienia zaobserwowano obniżanie się stopnia nasycenia brzeczki tlenem, co świadczyło o jego zużywaniu przez bakterie. Po upływie 3 4 dób stopień nasycenia brzeczki tlenem zmniejszył się do kilkunastu procent, co oznacza silne ograniczanie szybkości fermentacji niedoborem tlenu. W tym czasie szybkość kwaszenia wyniosła około 0,004 g/(lh). Od tego momentu otwarto zawór dopływu powietrza i uruchomiono sterowanie obrotami mieszadła w zależności od kształtującego się stopnia nasycenia brzeczki tlenem w taki sposób by stężenie tlenu nie spadało poniżej 50% nasycenia. W miarę przyrostu kwasowości dopełniano fermentor partiami cydrową brzeczką produkcyjną podłoże CC(1+6) do uzyskania objętości 2,5 litra. Następnie, biorąc pod uwagę jednostkową produktywność i objętość cieczy w fermentorze uruchomiono ciągły dopływ brzeczki produkcyjnej z szybkością początkową 0,03 h -1 korygując ją w zależności od obserwowanych zmian kwasowości. Po osiągnięciu zakładanej objętości cieczy w fermentorze, 2,5 litra, kontynuowano ciągły dopływ brzeczki i rozpoczęto ciągły odbiór octu z fermentora, w taki sposób by utrzymywać objętość cieczy w fermentorze na stałym poziomie, a stężenie alkoholu resztkowego utrzymywało się w granicach 0,3 0,5% obj. Przepływ powietrza regulowano w zależności od wskazań elektrody tlenowej. Przed przeniesieniem bakterii z fermentora laboratoryjnego do fermentora pilotowego zwiększono szybkość rozcieńczania, tak aby stężenie alkoholu etylowego w fermentorze wzrosło do 1% obj. Następnie zawartość fermentora mikrotechnicznego przeniesiono do uruchomionego fermentora pilotowego i prowadzono fermentację w sposób ciągły. W warunkach przemysłowych stosowano brzeczkę otrzymaną z wina cydrowego, zakwaszonego octem cydrowym. Przygotowano dwa typy brzeczek: startową i produkcyjną. Do każdej z brzeczek dodawano pożywkę w dawce podstawowej, czyli: glukozę 1 g/l oraz fosforan dwuamonowy 0,45 g/l. W celu uruchomienia fermentacji octowej, w fermentorze produkcyjnym przygotowano 3 000 I mieszaniny o zawartości alkoholu 3,98% obj. i kwasu octowego 3,36 g/100 ml. Mieszanina ta składała się z brzeczki cydrowej, octu spirytusowego i wody. Zawartość fermentora po doprowadzeniu do temperatury 30 C i po uruchomieniu turbiny napowietrzającej szczepiono bakteriami Acetobacter pasteurianus KKP 674 pochodzącymi z fermentora pilotowego. Fermentor pilotowy umieszczono na przygotowanym w tym celu podeście w pobliżu górnej pokrywy fermentora produkcyjnego. Po przygotowaniu fermentora produkcyjnego do uruchomienia rozpoczęto szczepienie fermentora produkcyjnego bakteriami z fermentora pilotowego. Zastosowano szczepienie z użyciem metody ciągłej. Aby nie dopuścić do nadmiernego odfermentowania alkoholu, tak dobrano szybkość rozcieńczania, aby stężenie alkoholu w occie zarodowym opuszczającym fermentor pilotowy wynosiło około 1% objętościowy.
8 PL 222 528 B1 Na Fig. 2 i 3 przedstawiono zmiany kwasowości (k) i stężeń alkoholu (a), oraz sumarycznego stężenia cieczy w fermentorze E (S) w czasie szczepienia fermentora produkcyjnego. Po upływie 70 h od rozpoczęcia szczepienia zaobserwowano zmiany stężenia kwasu octowego w fermentorze produkcyjnym. Szczepienie fermentora produkcyjnego zakończono po 96 godzinach. W sumie ciecz o objętości 3000 I znajdującą się w fermentorze produkcyjnym została zaszczepiona 20 litrami cieczy zawierającej bakterie szczepu KKP 674, pochodzącymi z fermentora pilotowego. W momencie osiągnięcia stężenia kwasu octowego na poziomie około 6 g/100 ml uruchomiono ciągły dopływ brzeczki. Fermentację octową prowadzono metodą ciągłą, jednostopniową, w fermentorze przemysłowym, wgłębnym z zastosowaniem brzeczki o sumarycznym stężeniu 7,1% z dodatkiem pożywki w dawce podstawowej. Szybkość dopływu brzeczki regulowano w zależności od kwasowości cieczy w fermentorze, a następnie w zależności od kwasowości octu odpływającego w postaci piany z fermentora, dążąc do otrzymywania mocy powyżej 6 g/100 ml i możliwie maksymalnego odfermentowania alkoholu. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób uruchomienia fermentacji octowej w fermentorze produkcyjnym przy wykorzystaniu kultury starterowej hodowanej w fermentorze pilotowym, stanowiącej 1 3% objętości roboczej fermentora produkcyjnego, znamienny tym, że fermentor produkcyjny jest szczepiony w sposób ciągły bakteriami kwasu octowego hodowanymi w fermentorze pilotowym przy czym stężenie alkoholu w cieczy opuszczającej fermentor pilotowy wynosi od 0,3 do 3% objętościowych a stężenie kwasu octowego wynosi od 3 do 7 g/100 ml. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stopień napowietrzenia cieczy w fermentorze pilotowym wynosi 30 80%.
PL 222 528 B1 9 Rysunki
10 PL 222 528 B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)