Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 50 (1) 2010 ANALIZA PORÓWNAWCZA WPŁYWU NATURALNYCH OLEJKÓW ETERYCZNYCH NA OGRANICZENIE WZROSTU GRZYBA TRICHODERMA HARZIANUM WYSTĘPUJĄCEGO W UPRAWIE PIECZARKI DWUZARODNIKOWEJ (AGARICUS BISPORUS) ROMUALD GÓRSKI 1, MARIA KOZŁOWSKA 2, KATARZYNA GÓRA 1, RADOSŁAW J. KOZŁOWSKI 3 Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu 1 Katedra Metod Ochrony Roślin Zgorzelecka 4, 60-198 Poznań rgorski@up.poznan.pl 2 Katedra Metod Matematycznych i Statystycznych Wojska Polskiego 28, 60-638 Poznań markoz@up.poznan.pl 3 Instytut Inżynierii Rolniczej, Zakład Informatyki Stosowanej Wojska Polskiego 50, 60-638 Poznań rkozlowski@up.poznan.pl I. WSTĘP W uprawie grzybów jadalnych dużym zagrożeniem jest patogeniczny grzyb Trichoderma harzianum, sprawca zielonej pleśni atakującej podłoże z rozwijającą się grzybnią pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus) oraz jej owocniki (Benhamou i Chet 1993; Hermosa i wsp. 2000; Samuels i wsp. 2002; Szczech 2005). Brak skutecznych metod ochrony grzybów uprawnych przed zieloną pleśnią, a przy stosowaniu preparatów chemicznych występowanie ryzyka gromadzenia się w owocnikach substancji toksycznych (Ziombra 2001), skłaniają do badań nad ochroną uprawianych grzybów przy wykorzystaniu środków pochodzenia naturalnego (Górski i wsp. 2008a, b). Wśród naturalnych olejków eterycznych na uwagę zasługuje znany, ale jeszcze mało popularny, olejek paczulowy, a także jeden z najnowszych, tj. olejek manuka. Olejek paczulowy otrzymuje się z ziela brodźca palczatki (Pogostemon patchouli) uprawianej głównie w Indonezji, na Malajach, wyspach Mauritius i Reunion. Paczula powszechnie używana jest przeciw molom i innym szkodnikom. Wykorzystywane są także jej silne właściwości bakterio- i grzybobójcze. Z kolei olejek manuka pozyskuje się z liści drzewa manuka (Leptospermum scoparium) rosnącego w Nowej Zelandii i Australii, a także w Tasmanii i Nowej Gwinei. Charakteryzuje się on silnymi właściwościami antybakteryjnymi i antygrzybiczymi (Brud i Konopacka 1994).
Analiza porównawcza wpływu naturalnych olejków eterycznych... 353 Celem badań było określenie wpływu i przebiegu zmienności działania wybranych środków pochodzenia naturalnego, tj. olejków manuka i paczulowego oraz fungicydu Sporgon 50 WP na wzrost liniowy grzyba T. harzianum występującego w uprawie pieczarki dwuzarodnikowej (A. bisporus). II. MATERIAŁ I METODY Badania nad wpływem olejków manuka (0,1%) i paczulowego (0,1%) na wzrost liniowy kolonii grzyba T. harzianum przeprowadzono w latach 2008 i 2009. Wymienione olejki zostały wyprodukowane przez firmę Pollena-Aroma Sp. z o.o. z Warszawy. Testowane środki dodawano do pożywki PDA (agar ziemniaczano-glukozowy), którą następnie inokulowano izolatem grzyba T. harzianum, wyizolowanym w dniu 12.05.2005 roku z podłoża na bazie słomy i kurzaka, w uprawie pieczarki dwuzarodnikowej w Mikulicach koło Turku. Kontrolę zerową stanowiły płytki z pożywką PDA bez dodatku środków grzybobójczych. W celach porównawczych jako wzorzec zastosowano fungicyd Sporgon 50 WP (0,3%). Doświadczenia założono w 6 powtórzeniach. Inkubację izolatu T. harzianum prowadzono w temperaturze pokojowej (23 C), przy ograniczonym dostępie światła. Do oceny wzrostu kolonii badanego patogena, w celach porównawczych zastosowano metodę tradycyjną i komputerową metodę analizy obrazu. Mierzono w każdym powtórzeniu średnice kolonii grzyba w dwóch prostopadłych do siebie kierunkach. Na podstawie tych pomiarów oszacowano pole powierzchni grzyba ze wzoru na pole elipsy. Przy stosowaniu metody analizy obrazu wykorzystano autorski programu FotoDetekt. W kombinacjach z zastosowaniem olejków eterycznych oraz fungicydu Sporgon 50 WP pomiary wykonywano codziennie przez 34 dni od daty inokulacji pożywki. W kontroli obserwacje prowadzono do momentu osiągnięcia przez kolonię grzyba powierzchni szalki Petriego, co nastąpiło w 5 dniu obserwacji. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej. Zastosowano analizę wariancji i procedurę Fishera przy poziomie istotności α = 0,05. Wyznaczono wartości współczynnika zmienności. Przeprowadzono analizę porównawczą przebiegu zmienności procesu hamowania wzrostu kolonii T. harzianum. III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Zastosowane w badaniach środki pochodzenia naturalnego: olejki manuka (0,1%) i paczulowy (0,1%) oraz fungicyd Sporgon 50 WP (0,3%) w znacznym stopniu ograniczały wzrost grzyba T. harzianum. Zahamowanie wzrostu grzybni patogena w stosunku do kontroli wynosiło w pierwszym dniu po inokulacji około 50%. Już w drugim dniu procent zahamowania przekroczył wartość 90. W trzecim dniu wynosił: dla preparatu Sporgon 50 WP 99,4%, dla olejku manuka 98,1% i dla olejku paczulowego 96,6%. Czwartego dnia stwierdzono istotne różnice pomiędzy powierzchnią kolonii grzyba uzyskaną na pożywce PDA z dodatkiem olejku paczulowego a kombinacją z zastosowaniem preparatu Sporgon 50 WP (tab. 1). Wzrost powierzchni kolonii grzyba na pożywce PDA zakończył się osiągając powierzchnię szalki Petriego (5 674,5 mm 2 ) po upływie 5 dni od daty inokulacji pożywki.
354 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 50 (1) 2010 Tabela 1. Pole powierzchni kolonii grzyba T. harzianum [mm 2 ] i procent zahamowania jego wzrostu na pożywce PDA z dodatkiem badanych środków oraz wyniki procedury Fishera przy α = 0,05 Table 1. Surface of T. harzianum colony [mm 2 ] and inhibition percentage of its growth on PDA medium with addition of some agents and results of Fisher LSD procedure at α = 0.05 Środki i ich stężenie w pożywce Agents and their concentration in medium Liczba dni od inokulacji pożywki No. of days from the date of medium inoculation 1 2 3 4 Sporgon 50 WP 0,3% 16,1 b 53,5 16,8 b 96,9 19,2 b 99,4 23,6 c 99,6 Olejek manuka 0,1% Manuka oil Olejek paczulowy 0,1% Patchouli oil 17,8 b 48,5 39,6 b 92,7 64,9 b 98,1 95,3 bc 98,3 17,4 b 49,7 39,5 b 92,8 113,4 b 96,6 186,7 b 96,7 Kontrola Control 34,5 a 545,3 a 3 379,4 a 5 596,3 a Wartość p p value 2,4 10-14 1,3 10-5 2,2 10-7 9,4 10-29 a, b, c wartości w kolumnie opisane przez choć jedną taką samą literę nie różnią się istotnie a, b, c values within each column, followed by the same letter are not significantly different Rys. 1. Średni wzrost pola powierzchni kolonii grzyba T. harzianum [mm 2 ] z 34-dniowych cykli obserwacji Fig. 1. Mean growth of of T. harzianum colony [mm 2 ] within 34-day cycles of observation
Analiza porównawcza wpływu naturalnych olejków eterycznych... 355 Rys. 2. Zmienność wzrostu T. harzianum w kolejnych dniach obserwacji określona przez współczynnik zmienności V Fig. 2. Variability of growth of T. harzianum colony in following days of observations presented by variability coefficient V W kolejnych dniach porównywano efekt i zmienność działania olejków eterycznych ze środkiem Sporgon 50 WP. Stwierdzono wysoce istotne zróżnicowanie przebiegu badanego procesu przy zastosowaniu wybranych olejków eterycznych i preparatu Sporgon 50 WP (rys. 1). Po pierwszej fazie wzrostu T. harzianum (5 dni), wzrost kolonii tego grzyba przebiegał stabilnie (współczynnik zmienności V < 10%) na pożywce PDA z dodatkiem fungicydu Sporgon 50 WP, w całym okresie było V < 16%. Z kolei na pożywce PDA z dodatkiem olejków zmienność procesu hamowania wzrostu grzyba była znacznie wyższa, dla olejku manuka V < 26%, a dla paczulowego V < 30%. Zatem skuteczność działania olejków była podobna, jednak różniły się one pod względem zmienności przebiegu obserwowanego procesu hamowania wzrostu T. harzianum (rys. 2). Po 26 dniach obserwacji powierzchnia grzyba na pożywce PDA z dodatkiem olejku manuka osiągnęła 99,7% powierzchni szalki Petriego, a z dodatkiem olejku paczulowego 94,4%, podczas gdy z dodatkiem preparatu Sporgon 50 WP zaledwie 8,6% (po 34 dniach wynosiła 15,2%). IV. WNIOSKI 1. Olejki eteryczne manuka i paczulowy oraz fungicyd Sporgon 50 WP mogą być przydatne w zwalczaniu grzyba T. harzianum w uprawie pieczarki dwuzarodnikowej (A. bisporus). Stwierdzono silne działanie inhibujące wyżej wymienionych preparatów. 2. Zaobserwowano że procent zahamowania wzrostu kolonii grzyba T. harzianum przy zastosowaniu badanych środków już w drugim dniu przekroczył 90% w stosunku do kontroli. 3. Wykazano zmienność działania inhibującego olejku manuka w granicach do 26%, olejku paczulowego do 30%, a fungicydu Sporgon 50 WP do 16%. 4. Ze względu na ogromną szkodliwość grzyba T. harzianum w uprawie pieczarki wskazane jest prowadzenie dalszych badań, mających na celu określenie zmienności wpływu innych inhibitorów na wzrost patogena.
356 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 50 (1) 2010 V. LITERATURA Benhamou N., Chet I. 1993. Hyphal interaction between Trichoderma harzianum and Rizoctonia solani: ultrastructure and gold cytochemistry of the mycoparasitic process. Phytopathology 83: 1062 1071. Brud S., Konopacka I. 1994. Pachnąca Apteka. Tajemnice Aromaterapii. Agencja Wyd. Comes, Warszawa, 152 ss. Górski R., Frużyńska-Jóźwiak D., Andrzejak R. 2008a. Wpływ naturalnych olejków eterycznych na rozwój in vitro grzyba Trichoderma harzianum występującego w uprawie pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus). Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 529: 19 26. Górski R., Frużyńska-Jóźwiak D., Andrzejak R. 2008b. The effect of selected preparations on in vitro development of fungus Trichoderma harzianum found in button mushroom (Agaricus bisporus) crop. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 529: 27 33. Hermosa M.R., Grondona I., Iturriaga E.A., Diaz-Minguez J.M., Castro C., Monte E., Garcia- Acha I. 2000. Molecular characterization and identification of biocontrol isolates of Trichoderma. Appl. Environ. Microbiol. 66: 1890 1898. Samuels G.J., Dodd S.L., Gams W., Castlebury L.A., Petrini O. 2002. Trichoderma species associated with the green mold epidemic of commercially grown Agaricus bisporus. Mycologia 94: 146 179. Szczech M. 2005. Identyfikacja grzybów wywołujących zieloną pleśń w pieczarkarniach. Biuletyn Producenta Pieczarek. Pieczarki 1: 26 31. Ziombra M. 2001. Grzyby pleśniowe w uprawie boczniaka. Biuletyn Producenta Pieczarek. Pieczarki 1: 45 46 ROMUALD GÓRSKI, MARIA KOZŁOWSKA, KATARZYNA GÓRA, RADOSŁAW J. KOZŁOWSKI COMPARATIVE ANALYSIS OF THE EFFECT OF NATURAL ESSENTIAL OILS GROWTH REDUCTION OF THE FUNGUS TRICHODERMA HARZIANUM FOUND IN BUTTON MUSHROOM (AGARICUS BISPORUS) CROP SUMMARY Studies on the effect of manuka oil (0.1%) and patchouli oil (0.1%) on growth of fungal colonies of Trichoderma harzianum were carried out in 34-day cycles. The preparation Sporgon 50 WP (0.3%) was used as a reference. Observations were conducted using the traditional method and by computer image analysis. A comparative analysis was performed on the course of variation in the inhibition of T. harzianum colony growth. A highly significant variation was found in the course of the investigated process when using selected essential oils and the preparation Sporgon 50 WP. The efficacy of oils was similar; however, they differed in terms of the course of variation in their effect on T. harzianum growth. Key words: button mushroom, Trichoderma harzianum, in vitro growth, inhibition, essential oils, image analysis, variability coefficient