Udział beztlenowych Gram-ujemnych bakterii w zakażeniach hospitalizowanych pacjentów

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 235-240 Marta Kierzkowska, Anna Majewska, Joanna Kądzielska, Agnieszka Rozpara, Anna Sawicka-Grzelak, Grażyna Młynarczyk Udział beztlenowych Gram-ujemnych bakterii w zakażeniach hospitalizowanych pacjentów Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Warszawie Kierownik Katedry i Zakładu: prof. dr hab. G. Młynarczyk Gram ujemne bakterie beztlenowe są składnikiem fizjologicznej flory człowieka. W przypadku osłabienia miejscowej lub ogólnej wydolności immunologicznej dochodzi do namnażania się bakterii i infekcji. Zakażenia mogą dotyczyć każdej tkanki i narządu. Leczenie chorób wywołanych bakteriami beztlenowymi z powodu ich naturalnej oporności na wiele leków przeciwbakteryjnych oraz selekcji szczepów opornych jest jednym z aktualnych problemów terapeutycznych. Bezwzględnie beztlenowe Gram ujemne bakterie stanowią około 90% flory jelita grubego. Zasiedlają skórę, błonę śluzową górnych dróg oddechowych i pochwę. Osłabienie miejscowej lub ogólnej wydolności immunologicznej wynikającej z niedotlenienia tkanek, kwasicy czy obniżonego potencjału oksydoredukcyjnego prowadzi do namnażania się bakterii i występowania objawowych infekcji. Zakażenia występują również wskutek translokacji drobnoustrojów z miejsc ich naturalnego bytowania. W ten sposób dochodzi do zakażeń w obrębie narządów jamy brzusznej. Współistniejąc z bakteriami tlenowymi mogą wywoływać zapalenie wyrostka robaczkowego, otrzewnej, trzustki, dwunastnicy. Dotyczy to głównie pałeczek z rodzaju Bacteroides. Beztlenowce są częstym czynnikiem zakażeń pacjentów oddziałów ginekologiczno-położniczych. Obecność bakterii z rodzaju Porphyromonas i Prevotella, a także Bacteroides w pochwie kobiet ciężarnych może wpływać na zahamowanie wewnątrzmacicznego rozwoju płodu. Gatunki z rodzaju Fusobacterium są ważnym etiologicznym czynnikiem zapalenia błon płodowych i wystąpienia przedwczesnego porodu. Prevotella sp., Porphyromonas sp. oraz Fusobacterium sp. najczęściej wykrywane są w materiale pobranym z okolic głowy i szyi. F. necrophorum odpowiada u dzieci i dorosłych za zapalenie migdałków, zatok, ucha środkowego, zakażenia gardła często w koinfekcji z wirusami. F. nucleatum bierze udział w etiologii ropni mózgu, zwłaszcza u osób z problemami stomatologicznymi. Bakterie beztlenowe mogą być czynnikami etiologicznymi sepsy. W spektrum przeciwbakteryjnym Gram-ujemnych beztlenowo rosnących bakterii znajdują się następujące antybiotyki: metronidazol, klindamycyna, antybiotyki beta-laktamowe

236 M. Kierzkowska i inni Nr 3 w połączeniu z inhibitorami beta-laktamaz, karbapenemy, cefamycyny, chloramfenikol. Lekami z wyboru są klindamycyna i metronidazol. Narastająca od wielu lat oporność na klindamycynę może stanowić problemem terapeutyczny. Natomiast oporność na metronidazol, mimo jego stosowania od ponad czterdziestu lat, nie stanowi istotnego problemu medycznego. MATERIAŁ I METODY Badano próbki materiału klinicznego pobranego w latach 2007-2008 od pacjentów hospitalizowanych w Szpitalu Klinicznym Dzieciątka Jezus-Centrum Leczenia Obrażeń w Warszawie. Materiał stanowiły wymazy z ran, kanału szyjki macicy, punktaty z ropni, płyn pobrany z jamy brzusznej, żółć, ejakulat oraz próbki pobrane śródoperacyjnie. Materiał posiewano na podłoża bakteriologiczne Schaedler Agar z 5% krwią baranią (biomerieux S.A., Francja). Inkubowano w temperaturze 37 C w anaerostatach. Okres inkubacji trwał 48h do 7dni. Po makro i mikroskopowej ocenie izolatów dokonano identyfikacji biochemicznej za pomocą zestawu API 20A (biomerieux S.A., Francja). Oceny lekowrażliwości dokonano z wykorzystaniem zestawu antybiotyków w teście ATB ANA (biomerieux S.A., Francja) według zaleceń CASFM i NCCLS. Pasek ATB ANA zawiera następujące antybiotyki w stężeniach (mg/l): penicylina 0,5-2, amoksycylina z kwasem klawulanowym 4/2-8/4, piperacylina 32-64, piperacylina z tazobaktamem 32/4-64/4, tikarcylina z kwasem klawulanowym 32/2-64/2, cefoksytyna 16-32, cefotetan 16-32, imipenem 4-8, klindamycyna 2-4, chloramfenikol 8-16, metronidazol l8-16. Określano wartości MIC przy użyciu gradientowo-dyfuzyjnej metody E-test (AB BIODISK, Szwecja). Zastosowano paski E-test impregnowane gradientem stężeń: klindamycyny (CM 0,016-256 mg/l), metronidazolu (MZ 0,016-256mg/l), imipenemu (IP 0,002-32mg/l), penicyliny G (PG 0,016-256mg/l) oraz amoksycyliny z kwasem klawulanowym (XL 0,016-256mg/l). Używano podłoża Wilkins- -Chalgrena z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (Difco Lab., USA). Technika wykonywania testów i sposób odczytywania wyników były zgodne z zaleceniami producenta. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Bakterie beztlenowo rosnące najczęściej izolowano z materiału pochodzącego od pacjentów z oddziałów chirurgicznych (chirurgia ogólna, chirurgia szczękowo-twarzowa, blok operacyjny), ginekologicznych, ortopedycznych, oddziału dermatologicznego i urologicznego. Spośród 1274 izolatów bakterie Gram-dodatnie stanowiły 73,9%, bakterie Gram-ujemne 26,1%. Liczba izolatów bakterii Gram-ujemnych wynosiła 126 (23,51%) w roku 2007 oraz 207 (28,05%) w roku 2008. Najczęściej oznaczano Bacteroides sp. Prevotella sp. oraz Veillonella sp. (Tabela I). Wśród gatunków z rodzaju Bacteroides sp. dominował B. fragilis. Około 25% izolatów tego rodzaju wykazało oporność na klindamycynę. W prowadzonym badaniu często stwierdzano oporność B. ovatus/thetaiotaomicron na cefoksytynę i cefotetan. Spośród gatunków należących do rodzaju Prevotella zauważono dominację P. intermedia/disiens oraz P. bivia. Najbardziej lekooporna okazała się P. bivia. Zaobserwowano jej obniżoną wrażliwość na klindamycynę, podobnie jak w przypadku gatunków z rodzaju Bacteroides sp. (Tabela II).

Nr 3 Zakażenia szpitalne G-ujemnymi beztlenowcami 237 Tabela I. Gatunki Gram-ujemnych bakterii bezwzględnie beztlenowych wyizolowane z materiału klinicznego w latach 2007 i 2008 Gatunek 2007 2008 Bacteroides fragilis Bacteroides distasonis Bacteroides ovatus/thetaiotaomicron Bacteroides vulgatus Bacteroides caccae Bacteroides ureolyticus Bacteroides uniformis Bacteroides stercoris/eggerthii Prevotella intermedia/disiens Prevotella bivia Prevotella melaninogenica/oralis Prevotella oris/buccae 31 11 6 8 5 2 0 0 6 13 10 3 57 9 10 8 3 3 2 1 20 12 10 5 Razem liczba szczepów % 156 46,9 79 23,7 Veillonella parvula 20 34 54 16,2 Fusobacterium necrophorum/nucleatum 5 11 Fusobacterium varium 2 4 Fusobacterium spp. 1 4 30 9 Fusobacterium mortiferum 1 2 Porphyromonas asaccharolytica 2 12 14 4,2 Ogółem 126 207 333 100 W tabeli III zamieszczono zakresy wartości MIC (najmniejszego stężenia leku hamującego wzrost szczepu) dla pałeczek z rodzaju Bacteroides. W porównaniu z poprzednimi latami zaobserwowano wzrost liczby Gram-ujemnych bezwzględnych beztlenowców izolowanych z próbek materiału klinicznego. Podobnie jak w badaniach prowadzonych w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Lekarskiej w latach wcześniejszych najczęściej izolowano gatunki z rodzaju Bacteroides, Prevotella oraz Veillonella sp. (2, 3). Bakterie należące do gatunków: B. fragilis, B. distasonis, B. ovatus/ thetaiotaomicron, B. vulgatus, wykazują oporność na penicylinę w stężeniu jakie może być osiągalne w organizmie człowieka. Jest to związane z wytwarzaniem bakteryjnej ß-laktamazy. Około 25% izolatów wykazuje oporność na klindamycynę. Należy zauważyć, że jest to 4% wzrost liczby szczepów niewrażliwych na klindamycynę w porównaniu z wynikami badań przeprowadzonych w naszym zakładzie w latach 2005-2006 (2). Natomiast analizując wcześniejsze dane zauważono narastającą częstość izolowania szczepów opornych na ten antybiotyk o blisko 13% w stosunku do roku 2001 (7). Coraz większe znaczenie w leczeniu zakażeń wywołanych przez B. fragilis, w sytuacji narastającej oporności tych szczepów na klindamycynę zyskuje metronidazol (8). Na podstawie danych piśmiennictwa można stwierdzić, że szczepy Bacteroides sp. charakteryzują się zróżnicowaną opornością na antybiotyki w zależności od kraju, w którym przeprowadzono badania. Oporność bakterii na klindamycynę na początku stulecia była najwyższa w Hiszpanii, gdzie liczba opornych izolatów wynosiła 40%. Oporność B. fragilis na klindamycynę dotyczy 15-44% wyizolowanych szczepów, na cefotetan 13-94%, w przypadku cefoksytyny jest to zakres 3,5-41,5% (1, 4, 5, 6, 9).

238 M. Kierzkowska i inni Nr 3 Tabela II. Lekowrażliwość Gram-ujemnych bakterii bezwzględnie beztlenowych wyizolowanych z materiału klinicznego w latach 2007 i 2008. Gatunek Liczba szczepów PEN AMC PIC Liczba szczepów wrażliwych Bacteroides fragilis 88 6 88 77 88 88 86 81 88 68 87 88 Bacteroides distasonis 20 3 20 13 19 19 19 13 20 15 17 20 Bacteroides ovatus / thetaiotaomicron 16 0 16 12 16 16 11 9 16 11 15 16 Bacteroides vulgatus 16 1 16 13 16 16 15 14 16 12 16 16 Bacteroides caccae 8 0 8 8 8 8 4 2 8 5 8 8 Bacteroides ureolyticus 5 0 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Bacteroides uniformis 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Bacteroides stercoris / eggerthii 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Prevotella intermedia / disiens 26 14 26 26 26 26 26 26 26 20 26 26 Prevotella bivia 25 3 25 21 25 25 25 24 25 20 25 25 Prevotella melaninogenica / oralis 20 11 20 19 20 20 20 20 20 14 20 20 Prevotella oris / buccae 8 1 8 6 8 7 6 6 8 2 8 8 Fusobacterium necrophorum / nucleatum 16 13 16 16 16 16 16 16 16 15 16 16 Fusobacterium varium 6 3 6 6 6 6 6 6 6 5 6 6 Fusobacterium sp. 5 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Fusobacterium mortiferum 3 2 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 Porphyromonas asaccharolytica 14 11 14 14 14 13 13 13 14 14 14 14 Veillonella parvula 54 45 54 52 52 54 54 54 54 51 54 54 Ogółem 333 117 333 299 330 330 316 300 333 268 328 333 % 100 35,1 100 89,8 99,1 99,1 94,9 90,1 100 80,5 98,5 100 PEN-penicylina, AMC-amoksycylina z kwasem klawulanowym, PIC-piperacylina, TZP-piperacylina z tazobaktamem, TCC-tikarcylina z kwasem klawulanowym, CXT-cefoksytyna, CTT-cefotetan, IMI-imipenem, CLI-klindamycyna, CMP-chloramfenikol, MTR-metronidazol Naszą uwagę zwróciła często występująca oporność szczepów B. ovatus/thetaiotaomicron na cefoksytynę (30%) i cefotetan (44%). Natomiast zakres MIC dla większości leków wobec bakterii z rodzaju Bacteroides był szeroki, podobnie jak wykazała Rokosz i wsp. (9). W porównaniu z poprzednimi latami obserwujemy większy odsetek izolatów Fusobacterium, a także gatunków z rodzajów Porphyromonas i Veillonella opornych na penicylinę i klindamycynę (2, 7). TZP TCC CXT CTT IMI CLI CMP MTR

Nr 3 Zakażenia szpitalne G-ujemnymi beztlenowcami 239 Tabela III. Zakresy wartości MIC metronidazolu, klindamycyny, amoksycyliny z kwasem klawulanowym, penicyliny, imipenemu Liczba Antybiotyki Gatunek szczepów MZ CM XL PG IP Bacteroides sp. 153 0,023-0,75 <0,016->256 0,016-1,0 0,023->32,0 0,006-0,75 Bacteroides fragilis 88 0,064-0,38 <0,016->256 0,094-1,0 3,0->32,0 0,012-0,064 Bacteroides caccae 8 0,064-0,094 0,032-0,125 0,064-0,19 0,75-16,0 0,016-0,047 Bacteroides distasonis 20 0,023-0,5 0,023->256 0,016-0,38 0,023->32,0 0,023-0,064 Bacteroides ovatus/ thetaiotaomicron 16 0,047-0,064 0,75-16,0 0,125-0,75 8,0->32,0 0,023-0,25 Bacteroides vulgatus 16 0,064-0,094 0,032-0,38 0,19-0,75 6,0-16,0 0,006-0,047 Bacteroides ureolyticus 5 0,064-0,75 0,125-0,25 0,094-0,38 0,32->256 0,023-0,75 MZ-metronidazol, CM-klindamycyna, XL-amoksycylina z kwasem klawulanowym PG-penicylina, IP-imipenem PODSUMOWANIE WYNIKÓW Z materiału klinicznego oprócz bakterii bezwzględnie beztlenowych izolowano również bakterie tlenowo rosnące. Pełnią one istotną rolę w patogenezie zakażeń u pacjentów hospitalizowanych, istnieje konieczność prowadzenie leczenia skojarzonego. W związku z sukcesywnym zwiększaniem się liczby szczepów opornych zasadne jest monitorowanie lekooporności pałeczek Gram-ujemnych beztlenowo rosnących. Diagnostyka zakażeń bakteriami beztlenowymi jest długotrwała, stąd też zasadne jest wprowadzenie terapii empirycznej w oparciu o znany w danym szpitalu czy oddziale profil wrażliwości, która następnie powinna być zastąpiona terapią celowaną na podstawie wyniku antybiobiogramu. M. Kierzkowska, A. Majewska, J. Kądzielska, A. Rozpara, A.Sawicka-Grzelak, G.Młynarczyk Participation of Gram-negative anaerobes in infections in hospitalized patients SUMMARY The aim of the study was to assess the prevalence and antibiotic susceptibility profiles of strictly anaerobic Gram-negative bacteria isolated from clinical samples taken from hospitalized patients from 01.01.2007 to 31.12.2008. The specimens were cultured using media, incubated at 37 C under anaerobic conditions. Biochemical identification and antibiotic susceptibility were done in an automated system ATB Expression (biomerieux S.A, France). For selected strains of Bacteroides sp. sensitivity was determined using E-test (AB BIODISK, Sweden). Overall 1274 strains of obligate anaerobes were isolated. Gram-negative bacteria were cultured in number of 333 strains. Most frequently isolated was Bacteroides sp. (46,9%) and Prevotella sp. (29,7%). Isolated bacteria are still susceptible to imipenem (100%), metronidazole (100%) and beta-lactam antibiotics with beta-lactamase inhibitors: amoxicillin/clavulanate (97,8%) piperacillin/tazobactam (99,1%), ticarcillin/clavulanate (99,1%).

240 M. Kierzkowska i inni Nr 3 PIŚMIENNICTWO 1. Hedberg M, Nord CE. Antimicrobial susceptibility of Bacteroides fragilis Group isolates in Europe. Clin Microbiol Infect 2003; 9: 475-88. 2. Kądzielska J, Kierzkowska M, Sawicka-Grzelak A i inni. Charakterystyka klinicznych szczepów Gram-ujemnych bezwzględnych beztlenowców. Med. Dośw. Mikrobiol 2007; 59: 351-7. 3. Kądzielska J, Rokosz A, Sawicka-Grzelak A i inni. Kliniczne szczepy Gram(-) bezwzględnych beztlenowców wyizolowane w 2004 roku. Zakażenia 2006; 6: 90-2. 4. Löfmark S, Jernberg C, Billsrtom H i inni. Restored fitness leads to long-term persistence of resistant Bacteroides strains in the human intestine. Anaerobe 2008; 14: 157-60. 5. Löfmark S, Jernberg C, JanssonJK i inni. Clindamycin-induced enrichment and long-term persistence of resistant Bacteroides spp. And resistance genes. JAC 2006; 58: 1160-7. 6. Rokosz A, Pawłowska J, Sawicka-Grzelak A i inni. ESBL-dodatnie szczepy z grupy Bacteroides fragilis wyizolowane od pacjentów Wojewódzkiego Szpitala Zespolonego w Płocku. Med. Dośw. Mikrobiol. 2004; 56: 245-53. 7. Rokosz A, Sawicka-Grzelak A, Kot K i inni. Zastosowanie metody etest do oznaczania lekowrażliwości bakterii beztlenowych. Med. Dosw. Mikrobiol. 2001; 53:167-75. 8. Wróblewska M, Rokosz A, Sawicka-Grzelak A i inni. Udział bakterii bezwzględnie beztlenowych w zakażeniach u hospitalizowanych pacjentów i możliwość terapii tych zakażeń. Med. Dośw. Mikrobiol. 2005; 57: 199-208. 9. Waxler H M. Bacterioides: The good, the bad, and the nitty-gritty. Clin. Microbiol. Rev. 2007; 20: 4, 593-621. Otrzymano:19 VIII 2011 r. Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. T.Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM