Anna Belcarz. Załącznik 2. Autoreferat. Katedra i Zakład Biochemii i Biotechnologii

Anna Belcarz Załącznik 2 Autoreferat Katedra i Zakład Biochemii i Biotechnologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej Uniwersytet Medyczny w Lublinie LUBLIN 2015 1

INFORMACJE O EDUKACJI, POSIADANE DYPLOMY I STOPNIE NAUKOWE Edukacja: 1978-1986 - Szkoła Podstawowa im. ks. Jana Twardowskiego nr 7 w Lublinie. 1986-1990 - II Liceum Ogólnokształcące im. Hetmana Jana Zamoyskiego w Lublinie, klasa o profilu biologiczno-chemicznym. 1990-1995 Studia magisterskie na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi UMCS w Lublinie, kierunek Biotechnologia (wynik studiów - bardzo dobry; dyplom uznania za bardzo dobre wyniki w nauce). 2009-2010 - Studia podyplomowe: Public Relations w badaniach naukowych, Wyższa Szkoła Ekonomii i Innowacji w Lublinie. 2010-2011 - Studia podyplomowe: Kształcenie kadry akademickiej do roli wykładowców przedmiotu Ochrona Własności Intelektualnej, Wydział Biologii i Biotechnologii UMCS, Lublin. Znajomość języków: Angielski zaawansowany (Dyplom First Certificate in English, Cambridge University, England, 1994, nr ref.: 946PL0100089) Francuski średnio zaawansowany; płynny w mowie Rosyjski średnio zaawansowany Kursy i szkolenia: 02-06.04.2001 Kurs Obsługa autoklawów laboratoryjnych, Ośrodek Doskonalenia Kadr Mechanika, Lublin. 2.07.2001-21.07.2001 Kurs Challenges of Sustainable Development, poświęcony współczesnej problematyce ochrony środowiska, organizowany przez Sendzimir Foundation, Uniwersytet Florydzki i Polską Fundację Partnerstwa Środowiskowego. 6-8.09.2006 Kurs Podstawy hodowli komórek ludzkich i zwierzęcych, Centrum Biotechnologii UMCS w Lublinie. 10-11.06.2010 Seminarium Nowoczesne techniki obrazowania ramanowskiego i w podczerwieni, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie. 2

2010 Bądź przedsiębiorcą cykl szkoleń dla pracowników akademickich, absolwentów i studentów, Europejskie Centrum Integracji i Współpracy Samorządowej Dom Europy. 29.09.2011 Szkolenie z zakresu obsługi Aparatu do badania uwalniania substancji czynnej metodą USP 4 CE1 z wyposażeniem firmy SOTAX zgodnie w wymogami GLP i ISO 9001. 25-27.05.2012 Szkolenie z zakresu nowoczesnych metod diagnozowania i procedur terapeutycznych narządu żucia z wykorzystaniem najnowszej aparatury diagnostycznej (Konferencja Naukowa Inżynieria Biomedyczna w Stomatologii. 29-30.01.2013 Kurs: Zastosowanie statystyki w medycynie z użyciem oprogramowania STATISTICA. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe: 21.04.1995 tytuł magistra biotechnologii na podstawie pracy magisterskiej pt. Subkomórkowa lokalizacja kinazy białkowej S-60 w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae wykonanej pod kierunkiem prof. dr hab. Nikodema Grankowskiego (ocena - bardzo dobra), w Zakładzie Biologii Molekularnej, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie. 15.01.2003 stopień doktora nauk biologicznych na podstawie rozprawy pt. Wykrycie, izolacja i określenie właściwości 2 form zewnątrzkomórkowej inwertazy z Candida utilis ukończonej pod kierunkiem prof. dr hab. Jerzego Łobarzewskiego, w Zakładzie Biochemii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie. INFORMACJE O ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH 01.09.1995-30.04.2003 asystent w Zakładzie Biochemii UMCS w Lublinie (zespół prof. dr hab. Jerzego Łobarzewskiego). 01.11.1998-31.09.2000 dwuletni staż naukowy i dydaktyczny na stanowisku asystentdoktorant na Wydziale Fizjologii Roślin, Uniwersytet Genewski w Szwajcarii (opiekun naukowy: prof. Hubert Greppin). 01.05.2003-31.08.2005 adiunkt w Zakładzie Biochemii UMCS w Lublinie (zespół dr hab. Grażyny Ginalskiej). 01.09.2005 do chwili obecnej adiunkt w Katedrze i Zakładzie Biochemii i Biotechnologii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie (zespół prof. dr hab. Grażyny Ginalskiej). 3

OSIĄGNIĘCIE NAUKOWE ZGŁOSZONE DO POSTĘPOWANIA HABILITACYJNEGO Osiągnięcie naukowe zgłoszone do postępowania habilitacyjnego stanowi cykl 7 publikacji z lat 2005-2015 o sumarycznym IF wynoszącym 12,708 (pkt. MNiSW = 161) oraz 2 patenty (1 polski i 1 międzynarodowy). Temat zgłoszonego osiągnięcia to: Modyfikacja ceramiki wapniowo-fosforanowej i jej zastosowanie w otrzymywaniu kompozytowych biomateriałów kościozastępczych nowej generacji. PUBLIKACJE 1. BELCARZ ANNA, ZALEWSKA JUSTYNA, GINALSKA GRAŻYNA, ŚLÓSARCZYK ANNA: Immobilizacja gentamycyny na nośnikach hydroksyapatytowych w celu nadania im własności antybakteryjnych./gentamicin immobilization on hydroxyapatite carriers for increasing their antibacterial properties. Inż. Biomater./Engineering of Biomater. 47-53 (2005) 34-36. (autor korespondencyjny) IF = 0,0 punkty KBN/MNiSW = 6 Mój wkład w tej pracy polegał na wyznaczeniu koncepcji doświadczeń, immobilizacji białka i gentamycyny na nośnikach wraz z ich ilościowym oznaczeniem oraz oceną sposobu wiązania leku z matrycą, określeniu stabilności leku w trakcie przechowywania oraz oznaczaniu aktywności mikrobiologicznej nośników. Opracowałam wyniki badań, przygotowałam tekst manuskryptu w języku polskim i angielskim oraz brałam udział w korektach wydawniczych jako autor korespondencyjny. Mój udział procentowy w całej pracy określam na 70%. 2. BELCARZ ANNA, GINALSKA GRAŻYNA, ZALEWSKA JUSTYNA, RZESKI WOJCIECH, ŚLÓSARCZYK ANNA, KOWALCZUK DOROTA, GODLEWSKI PIOTR, NIEDŹWIADEK JUSTYNA: Covalent coating of hydroxyapatite by keratin stabilizes gentamicin release. J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 89B (2009) 102-113. (autor korespondencyjny) IF = 2,185 punkty KBN/MNiSW = 20 Mój wkład w tej pracy polegał na wyznaczeniu koncepcji doświadczeń, immobilizacji białka i antubiotyku na nośnikach oraz współuczestnictwie w ocenie uwalniania leku z matrycy oraz w ocenie aktywności mikrobiologicznej nośnika. Współuczestniczyłam w opracowaniu wyników badań, przygotowałam tekst manuskryptu w języku angielskim oraz brałam udział w korektach wydawniczych jako autor korespondencyjny. Mój udział procentowy w całej pracy określam na 55%. 3. BELCARZ ANNA, GINALSKA GRAŻYNA, PYCKA TEODOZJA, ZIMA ANETA, ŚLÓSARCZYK ANNA, POLKOWSKA IZABELLA, PASZKIEWICZ ZOFIA, PIEKARCZYK WOJCIECH: Application of β-1,3-glucan in production of ceramicsbased elastic composite for bone repair. Centr. Eur. J. Biol. 8(6) (2013) 534-548. (autor korespondencyjny) IF = 0,633 punkty KBN/MNiSW = 20 4

Mój wkład w tej pracy polegał na wyznaczeniu koncepcji doświadczeń, opracowaniu formuły kompozytu kościozastępczego, wyznaczeniu współczynników sorpcji wody i zmiany objętości kompozytu oraz doborze i określeniu efektywności sterylizacji. Współuczestniczyłam w opracowaniu wyników badań, przygotowałam tekst manuskryptu w języku angielskim oraz brałam udział w korektach wydawniczych jako autor korespondencyjny. Mój udział procentowy w całej pracy określam na 65%. 4. BELCARZ ANNA, ZIMA ANETA, GINALSKA GRAŻYNA: Biphasic mode of antibacterial action of aminoglycoside antibiotics-loaded elastic hydroxyapatite-glucan composite. Int. J. Pharm. 454 (2013) 285-295. (autor korespondencyjny) IF = 3,785 punkty KBN/MNiSW = 35 Mój wkład w tej pracy polegał na wyznaczeniu koncepcji doświadczeń, opracowaniu formuły kompozytu kościozastępczego zawierającego lek i przygotowaniu próbek, wyznaczeniu i analizie widm FTIR, określeniu uwalniania leku z badanych matryc kompozytowych oraz ich aktywności przeciwbakteryjnej. Opracowałam wyniki badań, przygotowałam tekst manuskryptu w języku angielskim oraz brałam udział w korektach wydawniczych jako autor korespondencyjny. Mój udział procentowy w całej pracy określam na 85%. 5. BELCARZ ANNA, JANCZAREK MONIKA, KOŁACZ KAROLINA, URBANIK- SYPNIEWSKA TERESA, GINALSKA GRAŻYNA: Do Ca 2+ -chelating polysaccharides reduce calcium ion release from gypsum-based biomaterials? Centr. Eur. J. Biol. 8(8) (2013) 735-746. (autor korespondencyjny) IF = 0,633 punkty KBN/MNiSW = 20 Mój wkład w tej pracy polegał na wyznaczeniu koncepcji doświadczeń, opracowaniu formuły próbek kompozytowych zawierających ceramikę wapniowo-fosforanową i polisacharydy oraz ich przygotowaniu, wyznaczeniu stosunku L/P, czasu wiązania gipsu i wpływu czynników modyfikujących gips na ograniczenie nadmiernego uwalniania jonów wapnia. Opracowałam wyniki badań, przygotowałam tekst manuskryptu w języku angielskim oraz brałam udział w korektach wydawniczych jako autor korespondencyjny. Mój udział procentowy w całej pracy określam na 65%. 6. BELCARZ ANNA, ZALEWSKA JUSTYNA, PAŁKA KRZYSZTOF, HAJNOS MIECZYSŁAW, GINALSKA GRAŻYNA: Do Ca 2+ -adsorbing ceramics reduce the release of calcium ions from gypsum-based biomaterials? Mater. Sci. Engn. C. 47 (2015) 256-265. (autor korespondencyjny) IF = 2,736 punkty KBN/MNiSW = 30 Mój wkład w tej pracy obejmował wyznaczenie koncepcji doświadczeń, opracowanie formuły próbek kompozytowych zawierających ceramikę wapniowo-fosforanową i ich przygotowanie, wyznaczenie stosunku L/P oraz czasu wiązania cementów kompozytowych, wyznaczenie i analizę widm FTIR oraz współudział w określeniu wpływu ceramiki modyfikującej gips na ograniczenie nadmiernego uwalniania jonów wapnia. Opracowałam wyniki badań, przygotowałam tekst manuskryptu w języku angielskim oraz brałam udział w korektach wydawniczych jako autor korespondencyjny. Mój udział procentowy w całej pracy określam na 50%. 5

7. BORKOWSKI LESZEK, PAWŁOWSKA MARTA, RADZKI RADOSŁAW P., BIEŃKO MAREK, POLKOWSKA IZABELA, BELCARZ ANNA, KARPIŃSKI MIROSŁAW, SŁOWIK TYMOTEUSZ, MATUSZEWSKI ŁUKASZ, ŚLÓSARCZYK ANNA, GINALSKA GRAŻYNA: Effect of carbonated HAP/β-glucan composite bone substitute on healing of drilled bone voids in the proximal tibial metaphysic of rabbits. Mater. Sci. Engn.C. (2015) DOI:10.1016/j.msec.2015.04.009. IF = 2,736 punkty KBN/MNiSW = 30 Mój wkład w tej pracy obejmował współudział w wyznaczeniu koncepcji doświadczeń i opracowaniu formuły próbek kompozytowych zawierających węglanową ceramikę wapniowofosforanową. Uczestniczyłam również w przygotowaniu tekstu manuskryptu w języku angielskim oraz brałam udział w korektach wydawniczych. Mój udział procentowy w całej pracy określam na 10%. Podsumowanie: IF = 12,708 punkty KBN/MNiSW = 161 PATENTY 1. BELCARZ ANNA, GRAŻYNA GINALSKA, ŚLÓSARCZYK ANNA, PASZKIEWICZ ZOFIA. Kompozyt bioaktywny oraz sposób wytwarzania kompozytu bioaktywnego. Patent Polski nr 206394, Medical Inventi Spółka z Ograniczoną Odpowiedzialnością (pierwotnie uprawniony do patentu: Uniwersytet Medyczny w Lublinie), Lublin, Polska. Zgłoszono: 2009; udzielono: 2010. Udział własny: 45%. Mój wkład w tej pracy polegał na opracowaniu formuły kompozytu kościozastępczego w oparciu o granularną mikroporowatą ceramikę hydroksyapatytową. Opracowałam wyniki badań, przygotowałam tekst zgłoszenia patentowego wraz zastrzeżeniami w języku polskim. Mój udział procentowy wkładu pracy ustalony został we wniosku patentowym na 45%. 2. BELCARZ ANNA, GRAŻYNA GINALSKA, ŚLÓSARCZYK ANNA, PASZKIEWICZ ZOFIA. Bioactive composite and process for the production of the bioactive composite. International Patent, nr 2421570 B2, Medical Inventi Spółka z Ograniczoną Odpowiedzialnością (pierwotnie uprawniony do patentu: Uniwersytet Medyczny w Lublinie), Lublin, Polska. Zgłoszono: 26.10.2010; udzielono: 25.02.2015 (European Patent Bulletin). Udział własny: 45%. Mój wkład w tej pracy polegał na opracowaniu formuły kompozytu kościozastępczego w oparciu o granularną mikroporowatą ceramikę hydroksyapatytową. Opracowałam wyniki badań, przygotowałam tekst zgłoszenia patentowego wraz zastrzeżeniami w języku angielskim. Mój udział procentowy wkładu pracy ustalony został we wniosku patentowym na 45%. 6

CEL NAUKOWY WYMIENIONYCH PRAC, WYNIKI OSIĄGNIĘTE W TRAKCIE ICH REALIZACJI ORAZ WYKORZYSTANIE PRAKTYCZNE Cel naukowy Celem podjętych badań była modyfikacja ceramiki wapniowo-fosforanowej i jej zastosowanie w otrzymywaniu kompozytowych biomateriałów kościozastępczych nowej generacji. Poprzez zaproponowane rozwiązania możliwe było osiągnięcie trzech celów: 1. uzyskanie zwiększonej ochrony przeciwbakteryjnej ceramiki wapniowo-fosforanowej, zmniejszającej prawdopodobieństwo pooperacyjnego wytworzenia na jej powierzchni biofilmu bakteryjnego, wysoce opornego na standardową systemową terapię antybiotykową; 2. zwiększenie poręczności chirurgicznej materiałów implantacyjnych opartych na ceramice wapniowo-fosforanowej występującej w formie wysokoporowatego granulatu (pory w skali mikro) i uzyskanie nowatorskiego elastycznego kompozytu kościozastępczego o właściwościach korzystnych dla medycyny regeneracyjnej; 3. ograniczenie nadmiernego i cytotoksycznego wydzielania jonów wapniowych po implantacji materiałów bazujących na łatwo rozpuszczalnym dwuwodnym siarczanie wapnia. Wprowadzenie w zagadnienie charakterystyki biomateriałów kościozastępczych i problemów związanych z wszczepianiem komercyjnie dostępnych materiałów implantacyjnych. Społeczeństwa krajów rozwiniętych XXI wieku to społeczeństwa starzejące się i w coraz gorszej kondycji fizycznej. Na pogarszanie się tej kondycji wpływa w znacznym stopniu styl życia między innymi permanentny brak ruchu, intensywne korzystanie z używek oraz nieodpowiednia dieta. Czynniki te przekładają się na zintensyfikowanie częstotliwości występowania wielu chorób, między innymi dotyczących układu mięśniowoszkieletowego. Choroby tego układu wpływają na stan mięśni, ścięgien, wiązadeł oraz nerwów, wywołując trwałe inwalidztwo u osób dorosłych na całym świecie. W skali krajów rozwiniętych, przypadki degeneracji lub stanów zapalnych kości i stawów stanowią około połowę przypadków chronicznych chorób u ludzi powyżej 50-tego roku życia [Navarro i współ., 2008]. Co gorsza, przewiduje się, że do końca roku 2020 liczba ludzi dotkniętych schorzeniami układu kostnego podwoi się [Bone and Joint Decade s Musculoskeletal Portal, 2007]. Do najczęściej przeprowadzanych obecnie zabiegów chirurgicznych służących poprawie stanu zdrowia pacjentów cierpiących na wyżej opisane dolegliwości należą: artroplastyka kolana (rekonstrukcja lub wymiana kolana), wszczepienie częściowej lub pełnej endoprotezy stawu biodrowego oraz zespolenie kręgosłupa. Do innych przypadków 7

związanych z uszkodzeniami układu mięśniowo-szkieletowego należą zmiażdżenia kości w wyniku wypadków (np. komunikacyjnych) oraz wyłuszczenie nowotworów kości lub torbieli tkanki kostnej powstałej w wyniku wystąpienia stanów zapalnych. Przypadki te występują coraz częściej również w wyniku nasilenia się ogólnej częstotliwości występowania nowotworów, coraz intensywniejszego ruchu komunikacyjnego oraz popularyzacji sportów ekstremalnych. Czynniki te sprawiają, że ilość zabiegów chirurgicznych mających na celu leczenie i rekonstrukcję układu kostnego będzie, według istniejących prognoz, intensywnie rosła w przeciągu najbliższych dekad. Zabiegi chirurgiczne uzupełniające ubytki i regenerujące tkankę kostną wymagają użycia urządzeń lub materiałów implantacyjnych wytworzonych z metali, ceramiki lub polimerów, ogólnie określanych mianem biomateriałów. Zostały one zaproponowane jako alternatywa dla autograftów, allograftów i ksenograftów, których pozyskiwanie jest ograniczone między innymi niedoborem miejsc, z których można pobierać tkankę, ryzykiem transferu chorób, odrzutu wszczepu, kosztami pozyskiwania oraz śmiertelnością pooperacyjną [Goulet i współ., 1997]. Stanowią one zbiór produktów o ogromnej różnorodności, pod względem cech reologicznych, kształtu, cech fizykochemicznych i biologicznych, zastosowań czy lokalizacji implantacyjnych. Można je zaliczyć do materiałów trzech generacji: materiały bioinertne (I generacja), materiały bioaktywne i biodegradowalne (II generacja) oraz materiały zaprojektowane w celu stymulacji specyficznych odpowiedzi komórkowych na poziomie molekularnym (III generacja) [Hench & Polak, 2002]. Podział ten jest podyktowany nie tyle chronologią wytwarzania, ile dopasowaniem do ewolucji wymagań stawianych materiałom implantacyjnym. Pierwsza generacja obejmuje materiały, które mają jedynie odpowiadać swoimi właściwościami fizycznymi właściwościom uzupełnianej tkanki i jednocześnie wywoływać minimalną odpowiedź toksyczną gospodarza, czyli generować minimalną odpowiedź immunologiczną wobec wprowadzonego ciała obcego [Hench, 1980]. Materiały ceramiczne tej generacji miały zatem za zadanie zapewniać wrastanie tkanki kostnej do struktury porowatego implantu oraz indukować stabilizację protezy. Jednak ze względu na słabe parametry mechaniczne takiej porowatej ceramiki, jej zastosowanie musiało się ograniczać do uzupełniania tkanki kostnej w miejscach, gdzie nie było wymagane znoszenie wysokich obciążeń mechanicznych [Navarro i współ., 2008]. Do drugiej generacji biomateriałów zalicza się te, które zdolne są do wzmocnionej interakcji ze środowiskiem biologicznym i indukowania wiązania z tkanką. Do grupy tej zaliczono również materiały bioabsorbowalne, zdolne do podlegania stopniowej degradacji powiązanej w czasie z regeneracją i gojeniem się tkanki. Mineralizacja i wiązanie na poziomie tkanka kostnaimplant jest obecnie procesem najszerzej uznawanym jako wyznacznik bioaktywności materiału implantacyjnego. Z tego względu do bioaktywnej ceramiki zaliczono między innymi hydroksyapatyt (HAp), fosforan trójwapniowy (Ca 3 (PO 4 ) 2 ), ich pochodne i kombinacje [Navarro i współ., 2008]. Należy zaznaczyć, że hydroksyapatyt, ze względu na swą wysoką stabilność chemiczną i powiązaną z nią słabą rozpuszczalność, w dużym stopniu pozostaje po implantacji w zregenerowanej tkance kostnej, podczas gdy fosforany trójwapniowe ulegają z czasem całkowitej resorpcji [Takahashi i współ., 2005; Ginebra i współ., 2006]. Materiałami drugiej generacji są również dwufazowe kompozyty określane 8

jako analogi kostne, w których polimer pełni rolę matrycy, zaś hydroksyapatyt zapewnia bioaktywność [Bonfield, 1988]. Materiałom trzeciej generacji stawia się najwyższe wymagania. Warto jednak wspomnieć, że implanty dostępne na rynku zaliczają się właściwie do pierwszej i drugiej generacji materiałów, co w niczym nie umniejsza ich roli w medycynie regeneracyjnej. Materiały implantacyjne dopasowuje się bowiem do wymaganej aplikacji, co sprawia, że materiały pierwszej generacji są w ciągłym użyciu z wysokim współczynnikiem sukcesu. Natomiast materiały trzeciej generacji projektowane są tak, aby rozwiązywać bardziej zaawansowane problemy: być jednocześnie bioaktywne i biodegradowalne, stymulować specyficzną aktywność i zachowanie komórek (migrację, przyleganie i proliferację), stanowić systemy nośników leków i substancji wzrostowych [Temenoff i Mikos, 2000; Agraval i Ray, 2001]. Zaplanowano dla nich możliwość wykorzystywania naturalnych szlaków sygnałowych, komórek macierzystych, czynników wzrostu i sekwencji peptydowych w celu regeneracji organów i tkanek, podkreślając jednocześnie znaczenie procesu angiogenezy oraz dostarczania składników odżywczych [Navarro i współ., 2008]. Określono też, że idealne rusztowania dla regeneracji tkankowej, w rozumieniu trójwymiarowych struktur o optymalnej porowatości, powinny być biokompatybilne i biodegradowalne, nie powinny dostarczać toksycznych produktów rozpadu i resorbować się z tempie tożsamym z tempem regeneracji tkanki. Korzystne jest też, gdy stanowią ściśle powiązaną porowatą strukturę (zarówno mikrojak i makroporowatą) zapewniającą dostarczanie substancji odżywczych poprzez cyrkulację płynów tkankowych oraz neowaskularyzację, odpowiadają wymaganiom obciążeniowym implantowanego fragmentu tkanki oraz zachowują integralność w trakcie pierwszego etapu poimplantacyjnego [Spaans i współ., 2000; Boccaccini i współ., 2002]. Pomimo znacznego zaawansowania w technologii syntezy biomateriałów kościozastępczych, nie udało się dotychczas uzyskać idealnego, a jednocześnie relatywnie taniego rusztowania dla regeneracji tkanki kostnej. Jednym z istotnych problemów dotyczących materiałów implantacyjnych jest ryzyko zakażenia bakteryjnego wszczepów. W przypadku ceramiki wapniowo-fosforanowej wiąże się ono między innymi z właściwościami samej ceramiki, która ze względu na swoją budowę chemiczną stanowi możliwy cel dla adhezji komórek bakteryjnych lub grzybowych [Aronov i współ., 2007; Clark i współ., 1985], stanowiąc centrum infekcji i zwiększając prawdopodobieństwo wytworzenia antybiotykoopornego biofilmu bakteryjnego. Źródłem zakażenia w przypadkach implantacji biomateriałów mogą być nawet te organizmy, które w warunkach naturalnych bytują na ludzkiej skórze, takie jak Staphylococcus epidermidis. Paciorkowiec ten w momencie zasiedlenia na powierzchni implantowanego ciała obcego może nabrać cech czynnika zakaźnego [Hicks i Greenhalgh, 1997]. W istocie, do szczepów bakteryjnych najpowszechniej kolonizujących implanty ortopedyczne należą Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis (organizmy Gram-dodatnie) oraz Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa (organizmy Gram-ujemne) [Sanderson, 1991; Goel, 2006]. Dzięki zaawansowanym technikom okołooperacyjnej prewencji przeciwbakteryjnej, szpitalne zakażenia implantów zdarzają się z niską częstotliwością: w około 2,2 % przypadków artroplastyki stawu biodrowego i 3-4% przypadków całkowitej wymiany stawów [Pedersen i współ., 2010; 9

Pichavant i współ., 2012; Goel, 2006]. Częstotliwość ta nie jest wysoka, jednak wiąże się ze znaczną śmiertelnością w tej grupie przypadków, ze względu na kolonizację materiału i wykształcanie się na jego powierzchni biofilmu bakteryjnego. Podstawową bronią stosowaną dziś przeciw tej strategii bakteryjnej jest okołooperacyjna systemowa profilaktyka antybiotykowa, trwająca zwykle co najmniej 6 tygodni [Darouiche, 2004]. Mimo to nie należy zapominać, że tkanka kostna jest słabo ukrwiona. Z tego powodu, aby zabezpieczyć ją w pełni przed zakażeniem bakteryjnym, należy stosować wysokie systemowe stężenia antybiotyków, co z kolei może generować efekt toksyczności (znany np. dla antybiotyków aminoglikozydowych). Logicznym rozwiązaniem tego problemu wydaje się zatem strategia lokalnego dostarczania czynnika bakteriobójczego bezpośrednio w implantowanym materiale. Może ona zminimalizować ryzyko wykształcenia się biofilmu bakteryjnego i wystąpienia cytotoksyczności polekowej. Przykłady zastosowania tej właśnie strategii, gdzie hydroksyapatyt posłużył jako nośnik leku przeciwbakteryjnego, opisano dość szeroko w literaturze fachowej [Krisanapiboon i Buranapanitkit, 2006; Ginebra i współ., 2006; Chai i współ., 2007; Laurent i współ., 2008]. Mimo jednak wielu publikacji związanych z tą tematyką, panuje zgodność opinii, że problem opanowania zakażeń implantów nie został w pełni rozwiązany. Zagrożenie wykształcenia się biofilmu bakteryjnego na powierzchni implantu istnieje bowiem nie tylko w ciągu pierwszych kilku tygodni od operacji (infekcja typu I), ale też w okresie kilku miesięcy, a nawet lat od zabiegu (infekcje typu II i III). Zjawisko to związane jest z faktem, iż obecność ciała obcego (implantu) w organizmie gospodarza osłabia jego system odpornościowy [Goel, 2006]. Powagi sytuacji w przypadku zapobiegania zakażeń implantów kościozastępczych dopełnia fakt, że długotrwała obecność antybiotyku w organizmie indukuje zjawisko oporności bakterii przeciw tej substancji. Zatem idealny, hipotetyczny system uwalniania leku w postaci implantu będącego jego nośnikiem powinien wydzielać terapeutyczne dawki medykamentu dość szybko i na wysokim poziomie, ale nie na tyle, aby osiągnąć stężenie toksyczne dla ludzkich komórek kostnych. Nie powinien on również uwalniać leku w stężeniach wywołujących antybiotykooporność bakterii. Wytworzenie takiego idealnego systemu miejscowego dostarczania leków pozostaje wciąż w centrum zainteresowania wielu jednostek badawczych i w razie sukcesu może zdobyć uznanie zarówno w świecie badaczy, jak i u producentów implantów kościozastępczych. Kolejnym problemem związanym z implantacjami materiałów kościozastępczych jest niedostateczna poręczność chirurgiczna, dotycząca w szczególności ceramiki wapniowofosforanowej ze względu na jej kruchość oraz wysokie wartości modułu Younga i wytrzymałości na ściskanie. Świadczą o tym dane literaturowe: wartości modułu Younga i wytrzymałości na ściskanie dla ceramiki HAp zawierają się odpowiednio w zakresach 35-120 GPa i 120-900 MPa [Ślósarczyk A., 2003]. Tymczasem wartości tych samych parametrów dla kości zbitej wynoszą odpowiednio 17-19 GPa i 170-193 MPa [Suchanek i Yoshimura, 1998], zaś dla kości gąbczastej 0,18-0,33 GPa i 1,9-7 MPa [Aoki, 1994]. Tak znaczące obniżenie wartości obu wspomnianych parametrów tkanka kostna zbita i gąbczasta uzyskuje dzięki zawartości włókien kolagenowych, które stanowią rusztowanie dla odkładającej się macierzy mineralnej oraz zapewniają zwiększoną elastyczność w stosunku do czystej ceramiki wapniowo-fosforanowej. Ceramika HAp dostępna dla zastosowań medycznych jest scharakteryzowana jako nietoksyczna, bioaktywna, osteokonduktywna oraz nie wywołująca 10

reakcji alergicznych [Jarcho i współ., 1977; Kokubo i współ., 2003; Sopyan i współ., 2007]. Komercyjnie jest ona dostępna w postaci proszków, granul i kształtek, często o wygenerowanej porowatości mającej imitować porowatość naturalnej tkanki kostnej. Proszki i granule, jako struktury niespoiste, są jednak niewygodne w użyciu dla chirurgów implantujących je w ubytki kostne. Ponadto, oprócz tego czysto praktycznego aspektu, wszczepione granule mogą się przemieszczać w obrębie obszaru implantacji pod wpływem nacisku otaczających tkanek. Zjawisko to może doprowadzać do mechanicznego zniszczenia nowo tworzących się naczyń krwionośnych i spowalniać proces regeneracji tkanki kostnej. Natomiast kształtki ceramiczne, jako struktury sztywne i kruche, są kłopotliwe podczas zabiegu, gdyż trudno jest je dopasować do rozmiarów ubytku. Z tych względów prowadzone są badania mające na celu wytworzenie materiałów, które łączyłyby pozytywne cechy ceramiki wapniowo-fosforanowej, a jednocześnie niwelowałyby lub zmniejszały problem niedostatecznej elastyczności i nieporęczności chirurgicznej popularnych proszków i granul. Przykładami prób rozwiązania tego problemu jest zastosowanie polimerów zwiększających elastyczność, takich jak już wspomniany nie biodegradowalny dwufazowy analog kostny z polimerem HEPEX pełniącym rolę lepiszcza dla cząsteczek hydroksyapatytu [Bonfield, 1988] czy podlegający bioabsorpcji kompozyt hydroksyapatytowo-polilaktydowy (PLLA) [Todo i współ., 2006]. Jako polimery naturalne, w roli lepiszcza dla ceramiki wapniowo-fosforanowej mogą występować: chitosan [Kong i współ, 2006], zwierzęcy kolagen [Lawson & Czernuszka, 1998] lub żel fibrynowy [Le Nihouannen i współ., 2006]. Należy jednak wspomnieć, że użycie polimerów pochodzenia odzwierzęcego, mimo niewątpliwych zalet, niesie ze sobą ryzyko przenoszenia chorób lub wywołania odpowiedzi immunologicznej. Stąd też konieczność uzyskania wysokiego stopnia oczyszczenia tych substratów, co generuje wysoki koszt produktu finalnego. Kilka kompozytowych materiałów kościozastępczych, które łączą korzystne cechy HAp i uelastyczniającą plastyczność polimerów, pojawiło się już w sprzedaży. Należą do nich: EasyGraft TM produkowany przez Degradable Solutions SA (Szwajcaria), Plexur M i P wytworzone w laboratoriach firmy Osteotech (USA) i Cerapatite- Collagen stworzony przez francuską firmę Ceraver Osteal. Jednakże wciąż prowadzone są intensywne badania w dziedzinie syntezy kompozytowych, poręcznych chirurgicznie materiałów kościozastępczych, mające na celu poprawę ich jakości i być może również obniżenie ceny. Jeszcze innym kłopotliwym efektem ubocznym związanym z implantacją materiałów kościozastępczych jest ich oddziaływanie na środowisko implantacyjne, mianowicie na tkankę kostną gospodarza. Oddziaływanie to może przebiegać rozmaicie od generowania wysokich temperatur w przypadku polimeryzacji niektórych polimerów, poprzez zjawisko korozji implantów metalicznych w płynach biologicznych, aż do wydzielania szkodliwych jonów, jak to zaobserwowano np. dla stopów niklowo-tytanowych. To ostatnie zjawisko występuje również w przypadku gipsu szeroko znanego materiału implantacyjnego opartego na półwodnym siarczanie wapnia (CSH), który po uwodnieniu zamienia się z dwuwodny siarczan wapnia (CSD), tężejący w cementopodobną masę. Jest on materiałem uznanym za bezpieczny i bioaktywny, sprzedawanym jako preparaty kościozastępcze takie jak Stimulan (Biocomposites LTD, Wielka Brytania) lub Osteoset TM (Wright Medical Technology, Inc., USA), Jednakże wykazuje też kilka wad, do których należy dość szybkie tempo resorpcji in 11

vivo. W niektórych przypadkach wytwarzanie nowej tkanki kostnej zostaje zaburzone wskutek zbyt szybkiego rozpuszczania się gipsu. Konsekwencją zbyt szybkiego tempa resorpcji gipsu jest też lokalne uwalnianie jonów wapniowych na bardzo wysokim poziomie, co może działać toksycznie na komórki gospodarza. Stwierdzono w badaniach in vitro, że osteoblasty ludzkie wykazują osłabioną zdolność do proliferacji w środowisku o niefizjologicznie wysokim poziomie jonów wapnia [Rauschmann i współ., 2005; Przekora i współ., 2014], również w przypadku podłoża hodowlanego inkubowanego z preparatem handlowym Osteoset TM [Winn i Hollinger, 2000]. Badania te potwierdzają doniesienia o występowaniu stanów zapalnych związanych z implantacją gipsu [Coetzee, 1980; Robinson i współ., 1999; Lee i współ., 2002]. Jedno z nich podaje, że ciężki stan zapalny pojawiał się aż w 20% przypadków wszczepienia preparatu Osteoset TM, co tłumaczono akumulacją jonów wapniowych w okolicy implantu [Robinson i współ., 1999]. Odpowiedź zapalna wywołana obecnością wszczepionego gipsu może trwać aż do 2 miesięcy od zabiegu implantacji [Coetzee, 1980; Robinson i współ., 1999; Robinson i współ., 1999; Lee i współ., 2002]. Ciekawe jest, że wydzielanie jonów wapnia wskutek resorpcji gipsu może być tak intensywne, że powoduje podwyższenie poziomu tych jonów w surowicy krwi (co zaobserwowano u psów w modelu in vivo) [Peltier i współ., 1957]. Mimo tych wyraźnych sugestii, że implantacja gipsu może wywołać niekorzystny przejściowy stan zapalny w okolicach uzupełnianego ubytku kostnego, inne cechy gipsu są niezwykle korzystne dla implantologii. Z tego powodu materiały oparte na CSH są ogólnie dostępne w chirurgii ortopedycznej i urazowej, a niekorzystny efekt uboczny w postaci nadmiernego uwalniania jonów wapnia jest zwykle pomijany w literaturze. Z całą jednak pewnością udoskonalenie materiałów bazujących na CSH w taki sposób, aby zmniejszyć tempo poimplantacyjnego uwalniania jonów Ca 2+ mogłoby wpłynąć na minimalizację szkodliwych efektów ubocznych związanych z tym zjawiskiem. W obecnej chwili strategie prowadzące do ulepszenia CSH jako materiału implantacyjnego bazują raczej na działaniach ograniczających zbyt szybkie tempo jego resorpcji jedynie po to, by dopasować je do wolnego tempa formowania się zastępującej gips tkanki kostnej (na przykład przez wprowadzenie wolno resorbowalnej ceramiki wapniowo-fosforanowej) [Hu i współ., 2010; Greish, 2011]. Natomiast strategie dążące do zmniejszenia cytotoksyczności gipsu wywołanej intensywnym uwalnianiem jonów wapniowych nie są notowane w literaturze. Działania zmierzające do zniwelowania wyżej wymienionych efektów ubocznych obserwowanych w przypadku stosowanych obecnie kościozastępczych materiałów implantacyjnych mogłyby doprowadzić do ich udoskonalenia, z korzyścią dla lekarzy, systemu opieki zdrowotnej, a przede wszystkim dla pacjentów. 12

Wyniki badań związanych z osiągnięciem w postępowaniu habilitacyjnym: 1. rozwiązywanie problemów związanych z zakażeniami materiałów implantacyjnych Moje zainteresowanie tematyką zabezpieczania materiałów wszczepiennych przed zakażeniem bakteryjnym wynikało z kilku czynników. Pierwszym z nich było zdobycie istotnego doświadczenia w dziedzinie modyfikacji chemicznej matryc stałych w celu wykorzystania unieruchamianych enzymów w procesach biotechnologicznych (techniki immobilizacyjne stanowiły podstawę moich badań przed uzyskaniem stopnia doktora). Drugim czynnikiem było nawiązanie w 2004 roku współpracy z Katedrą Ceramiki i Materiałów Ogniotrwałych Akademii Górniczo-Hutniczej w Krakowie, która specjalizuje się w syntezie materiałów ceramicznych dla zastosowań biomedycznych. Trzecim czynnikiem były badania nad modyfikacją protez naczyniowych za pomocą antybiotyków, którymi kierowała prof. dr hab. Grażyna Ginalska, pracująca wtedy w Zakładzie Biochemii Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie. Badania te, w części których brałam udział, wprowadziły mnie w teorię zagadnienia zakażeń biomateriałów wszczepiennych. Czwarty czynnik natomiast to zmiana miejsca pracy. W wyniku przeniesienia się na Uniwersytet Medyczny w Lublinie i objęcia etatu adiunkta w Katedrze Biochemii i Biotechnologii mogłam pracować w dalszym ciągu w zespole prof. dr hab. Grażyny Ginalskiej, co było dla mnie bodźcem do skupienia się nad zagadnieniami możliwymi do zastosowania w praktyce medycznej. Aplikacyjność testowanych przeze mnie rozwiązań zaczęła bowiem być czynnikiem decydującym o kierunku moich badań. Pierwsza próba przeciwbakteryjnego zmodyfikowania porowatej granularnej ceramiki hydroksyapatytowej zsyntetyzowanej na AGH dotyczyła immobilizacji gentamycyny antybiotyku aminoglikozydowego o szerokim spektrum działania. Przed immobilizacją antybiotyku, granule zostały zaktywowane γ-aminopropyltrietoksysilanem (APTES) i aldehydem glutarowym, a w niektórych wariantach również keratyną izolowaną z włosów ludzkich. Ponieważ białko to należy do trudno degradowalnych, należało się zatem spodziewać, że nie będzie ono ulegało szybkiej hydrolizie w warunkach ludzkiego organizmu i zapewni długotrwałą immobilizację antybiotyku. Pierwsze uzyskane wyniki pozwoliły stwierdzić, że ilość immobilizowanej keratyny (co potwierdziło obrazowanie techniką SEM) w wysokim stopniu zależy od temperatury wypalania i porowatości granul: im wyższa była temperatura wypalania ceramiki, tym niższa była jej porowatość oraz ilość wiązanej keratyny. Zarówno silanizacja granul, jak i pokrywanie keratyną zwiększała też ilość immobilizowanego antybiotyku w stosunku do kontrolnych granul (nasączanych antybiotykiem bez wcześniejszej modyfikacji). Zauważyłam, że w przypadku wiązania antybiotyku, porowatość matrycy również ma decydujące znaczenie (im wyższa, tym więcej leku ulega przyłączeniu). Ustaliłam, że w immobilizacji leku brały udział wiązania fizyczne (absorpcyjne) oraz kowalencyjne (ponad 50% całej puli związanego antybiotyku). W przypadku nośnika keratynowanego odnotowałam również znaczący udział połączeń typu jonowego, praktycznie nieobserwowanych w przypadku 13

granul poddanych wyłącznie silanizacji. Aktywność przeciwbakteryjna badanych nośników leków dla granul silanizowanych oraz keratynowanych była wyższa niż dla granul kontrolnych (niemodyfikowanych) i również zależała w sposób odwrotnie proporcjonalny od temperatury ich wypalania. Z praktycznego punktu widzenia istotne jest, że badane modyfikowane nośniki utrzymywały swoją wysoką aktywność przeciwbakteryjną przez okres minimum 4 miesięcy przechowywania w temperaturze pokojowej. Uzyskane wyniki są istotne z punktu widzenia moich późniejszych badań, gdyż pozwoliły mi zwrócić uwagę na wysokoporowatą ceramikę wapniowo-fosforanową o dużej zawartości mikroporów. Ten typ ceramiki nie cieszy się szczególnym uznaniem jako handlowy materiał implantacyjny ze względu na znaczną ścieralność powierzchniową (co jest konsekwencją wysokiej mikroporowatości) i związaną z tym niską wytrzymałością mechaniczną. Jednakże, mimo tej niewątpliwej wady, stanowi ona znacznie bardziej obiecujący materiał wyjściowy dla modyfikacji chemicznej niż ceramika nieporowata, dostępna komercyjnie (np. preparat HA Biocer, Chema- Elektromet, Rzeszów). Ponadto, problem jej niskiej wytrzymałości mechanicznej mógłby być rozwiązany po inkorporacji do fazy łącznikowej typu cement lub polimer. Uzyskane wyniki badań zostały opublikowane w formie 1 pracy oryginalnej jako artykuł w czasopiśmie: Belcarz Anna, Zalewska Justyna, Ginalska Grażyna, Ślósarczyk Anna: Immobilizacja gentamycyny na nośnikach hydroksyapatytowych w celu nadania im własności antybakteryjnych/gentamicin immobilization on hydroxyapatite carriers for increasing their antibacterial properties. Inż. Biomater./Engineering of Biomater. 47-53 (2005) 34-36. Przeprowadzone badania, związane z optymalizacją warunków modyfikacji ceramiki hydroksyapatytowej za pomocą białek, postanowiłam rozszerzyć i uzupełnić o testy przeprowadzone na najbardziej obiecujących materiałach. W tym celu wybrałam wysokoporowate granule HAp wypalane w 800 o C (67% porowatości otwartej) o porach w skali mikro, które wiązały najwięcej antybiotyku spośród wszystkich badanych typów ceramiki i przeprowadziłam dla nich immobilizację białka keratyny i żelatyny, a w drugim etapie gentamycyny. Uzyskane wyniki dotyczące ilości unieruchomionego antybiotyku i wydajności immobilizacji były bardzo podobne do wcześniej uzyskiwanych rezultatów, świadcząc o wysokiej powtarzalności zastosowanej metody. Stwierdziłam, że znacząca część antybiotyku jest połączona z matrycą za pomocą wiązań kowalencyjnych oraz niestabilnych oddziaływań adsorpcyjnych. Z kolei wiązania jonowe były odpowiedzialne za pojawianie się połączeń pomiędzy antybiotykiem a matrycą białkowaną lub niemodyfikowaną na poziomie 5-10% całej puli leku, dzięki interakcjom ujemnie naładowanych grup hydroksylowych HAp (granule niemodyfikowane) lub ujemnie naładowanych reszt w łańcuchach bocznych aminokwasów (granule modyfikowane białkami) a dodatnio naładowanymi grupami aminowymi antybiotyku. Z kalkulacji wynikało też, że 34% puli leku przyłączonego do granul niemodyfikowanych musiało wniknąć głęboko w mikropory ceramiki, gdyż dla tego typu nośnika niemożliwe było 14

pojawienie się wiązań kowalencyjnych. Następnie przeprowadziłam badanie uwalniania leku ze wszystkich typów granul w dwóch modelach imitujących powolną cyrkulację płynów tkankowych w tkance kostnej (obszary lepiej i gorzej ukrwione). Stwierdziłam, że niezależnie od wybranego modelu wymiany płynów, w początkowym okresie największa ilość leku uwalnia się z matrycy niemodyfikowanej około dwukrotnie więcej niż z matryc modyfikowanych. Natomiast w końcowym okresie testu, ilość leku uwalnianego z matrycy kontrolnej obniżała się do zera, podczas gdy nośniki białkowane wciąż uwalniały antybiotyk na poziomie wystarczającym do powstrzymania wzrostu szczepów wrażliwych na gentamycynę (Staphylococcus aureus MR3; MIC 1,22 µg/ml). Mikrobiologiczna ocena aktywności przeciwbakteryjnej zdezintegrowanych niemodyfikowanych granul po uwolnieniu leku potwierdziła obecność pewnej puli leku uwięzionej głęboko w mikroporach. Badanie aktywności przeciwbakteryjnej testowanych granul w obu modelach wymiany płynów wykazało, że modyfikacja keratyną znacząco przedłuża okres ochrony przeciwbakteryjnej w porównaniu z innymi badanymi granulami, prawdopodobnie wskutek słabej biodegradowalności keratyny, przez co tworzy ona bardziej stabilny łącznik między granulami a cząsteczkami antybiotyku. Co interesujące, keratynowane granule zapewniły ochronę antybakteryjną podłożu hodowlanemu (co prawda jedynie przez 2-3 dni) przed wysoce opornym na gentamycynę szczepem S. epidermidis (MIC 2500 µg/ml). Badania podsumowały testy toksyczności modyfikowanych granul wobec linii ludzkich osteoblastów hfob (w celu oceny wpływu wysokich dawek immobilizowanego antybiotyku lub też możliwych śladowych pozostałości aldehydu glutarowego). Test na aktywność dehydrogenazy mleczanowej (detekcja poziomu destrukcji komórkowej), wykonany w momencie uwalniania leku na najwyższym poziomie wykazał, że granule z immobilizowaną gentamycyną przejawiają jedynie niewielką, kilkuprocentową cytotoksyczność w porównaniu z granulami bez leku. Stwierdziłam również, że w trakcie 17-dniowego eksperymentu komórki osteoblastów ulegały proliferacji na badanych granulach w sposób ciągły, chociaż w odniesieniu do granul modyfikowanych keratyną tempo ich namnażania było nieznacznie niższe niż w przypadku pozostałych rodzajów ceramiki. Wyniki omówionych badań zostały opublikowane w formie 1 pracy oryginalnej jako artykuł w czasopiśmie: Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Zalewska Justyna, Rzeski Wojciech, Ślósarczyk Ąnna, Kowalczuk Dorota, Godlewski Piotr, Niedźwiadek Justyna: Covalent coating of hydroxyapatite by keratin stabilizes gentamicin release. J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 89B (2009) 102-113. Podsumowując powyższe badania należy stwierdzić, że zastosowany przeze mnie sposób modyfikacji mikroporowatej ceramiki hydroksyapatytowej przy pomocy białek (keratyny i żelatyny) pozwolił na immobilizację znacznych ilości antybiotyków aminoglikozydowych poprzez wiązania o różnej sile, co zapewnia przedłużenie uwalniania leku i ochrony przeciwbakteryjnej w stosunku do ceramiki niemodyfikowanej. Zaproponowana modyfikacja nie wpływa negatywnie na metabolizm i proliferację osteoblastów ludzkich (z wyjątkiem modyfikacji z użyciem keratyny nieznaczne 15

spowolnienie tempa proliferacji). Można zatem stwierdzić, że opisany sposób modyfikacji granul HAp jest efektywnym i obiecującym sposobem na zabezpieczenie implantacyjnej ceramiki kościozastępczej przed zakażeniem organizmami patogennymi. Wyniki wykazują również zdecydowaną przewagę ceramiki wysokoporowatej nad nieporowatą w tym aspekcie aplikacyjnym. Ostatnie osiągnięcie w omawianej grupie problemowej dotyczy zastosowania, jako nośnika leku antybakteryjnego, elastycznego kompozytu kościozastępczego złożonego z wysokoporowatej ceramiki wapniowo-fosforanowej (o porach w skali mikro) oraz polimeru glukanowego. Kompozyt ten stanowi wynik badań prowadzonych przeze mnie w celu rozwiązania problemów związanych z niedostateczną poręcznością chirurgiczną materiałów implantacyjnych. Ze względu na powiązanie tematyczne i chronologiczne, wyniki badań związanych z opracowaniem wyżej wymienionego kompozytu jako nośnika leków przeciwbakteryjnych zostaną omówione w kolejnym punkcie tej części Autoreferatu. 2. rozwiązywanie problemów związanych z niedostateczną poręcznością chirurgiczną materiałów implantacyjnych Potrzeba ulepszenia nieporęcznych chirurgicznie ceramicznych materiałów implantacyjnych pojawiała się w trakcie moich badań stopniowo, podczas prowadzenia eksperymentów związanych z zabezpieczaniem ceramiki przed zakażeniami bakteryjnymi i wykształceniem się na ich powierzchni opornego na antybiotykoterapię biofilmu bakteryjnego. Zwróciłam wówczas uwagę na niewygodę w posługiwaniu się tym sypkim materiałem. Ponadto zauważyłam, że wysokoporowate (pory w skali mikro) granule, które okazały się najkorzystniejsze jako obiekt modyfikacji przeciwbakteryjnej, są stosunkowo podatne na ścieranie powierzchniowe w trakcie obróbki. Dr n. med. Piotr Godlewski (Klinika Ortopedii i Traumatologii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie), który był w moich badaniach konsultantem i zwracał uwagę na problemy związane z materiałami wszczepiennym z punktu widzenia chirurga ortopedy, potwierdził te spostrzeżenia. Z tego też powodu zaczęłam, wraz z innymi członkami zespołu, poszukiwać rozwiązania, które umożliwiłoby pokonanie problemów związanych ze ścieralnością wysokoporowatych granul ceramicznych i jednocześnie sprawiło, aby materiał ten był wygodny dla chirurgów, łatwiej poddawał się obróbce śródoperacyjnej i dopasowywał się do kształtu i rozmiarów ubytków kostnych. W wyniku konsultacji z lubelskimi ortopedami uznaliśmy, że najbardziej obiecującą strategią wytworzenia takiego materiału jest koncepcja dwufazowego analogu kostnego: ceramiczno-polimerowego. Chciałam jednak uniknąć zastosowania polimerów pochodzenia odzwierzęcego, które są już stosowane w implantacji, ale wymagają kosztownych procedur oczyszczania w celu minimalizacji ryzyka transferu chorób wirusowych i bakteryjnych. Wśród możliwych materiałów polimerowych pochodzenia innego niż zwierzęce, najkorzystniejsze parametry okazał się wykazywać β-1,3-glukan (kurdlan), nietoksyczny polisacharyd produkowany przez bakterie Alcaligenes faecalis, 16

stosowany dość szeroko jako suplement diety. Znalazłam ponadto doniesienia, że kompozyty kurdlanowo-chitozanowe wykazują aktywność przeciwbakteryjną [Sun i współ., 2011], zaś kurdlanowo-kolagenowe zostały z pozytywnymi rezultatami przetestowane w leczeniu oparzeń skórnych u dzieci [Delatte i współ., 2001]. W wyniku licznych eksperymentów ustaliliśmy, że kurdlan może być łączony z wysokoporowatym (pory w skali mikro) granulatem ceramicznym w dość szeroko zróżnicowanych proporcjach, które dla maksymalnej wartości upakowania fazą ceramiczną wynoszą: 9,1-56,7% kurdlanu i 90,9-43,3% granulatu w suchej masie składników kompozytu. Minimalna wartość upakowania ceramiki w kompozycie jest uzależniona od osiągnięcia równomiernego rozłożenia granul w końcowym produkcie i wynosi około 2%. Możliwość wyprodukowania kompozytu w wielu kombinacjach, zawierających większą lub mniejszą ilość kurdlanu oraz fazy ceramicznej pozwala na uzyskanie szerokiej gamy produktów, o cechach dopasowanych do konkretnych wymagań. Granule mogą mieć różną średnicę, od 0,1 mm do 1 mm; dobre parametry osiąga się też stosując mieszankę granul o różnej średnicy, z uzyskaniem wysokiej jednorodności rozłożenia granul w kompozycie (jak wykazano techniką mikrotomografii komputerowej). Jedną z najkorzystniejszych i najbardziej nowatorskich cech kompozytu jest jego elastyczność w stanie mokrym (po nasączeniu wodą, roztworem soli fizjologicznej, symulowanym płynem tkankowym, roztworem leku lub krwią). Pozwala ona na dopasowanie kompozytu do rozmiarów i kształtu wypełnianego ubytku kostnego poprzez ściskanie, zginanie lub przycinanie, co jest wielkim udogodnieniem dla chirurgów. Badanie kompozytu techniką SEM-EDS wykazało, że granule są ściśle spojone z powierzchnią warstwy polimerowej, a po rozdzieleniu tych dwóch warstw na granicy fazy polimerowej wykryto pierwiastki wapń i fosfor. Świadczy to o tak silnym spojeniu obu faz, że po ich rozdzieleniu część fazy ceramicznej odrywa się od granul i przyłącza do warstwy polimeru. Używając techniki spektroskopii FTIR stwierdziłam, że w łączeniu się składników kompozytu decydującą rolę odgrywa proces okluzji granul przez polimeryzujący kurdlan. Badanie to nie wykazało bowiem żadnych pasm odpowiadających pojawianiu się nowych wiązań i potwierdziło rozważania hipotetyczne dotyczące sposobu wiązania tych dwóch faz, gdyż zarówno w ceramice, jak i w kurdlanie brak aktywnych grup mogących uczestniczyć w tworzeniu wiązań kowalencyjnych. Istotną cechą kompozytów jest zdolność pochłaniania wody i związana z tym zmiana parametrów objętościowych. Zdolność ta jest cenną zaletą biomateriałów, gdyż wysoki stopień uwodnienia zezwala na szybkie tempo wymiany tlenu i składników odżywczych z tkanką otaczającą wszczep i jest niezbędny do szybkiej regeneracji ubytków tkanki chrzęstnej i kostno-chrzęstnej. Zwiększenie objętości kompozytu HAp-kurdlan po nasączeniu wodą zostało udokumentowane, między innymi, na poziomie strukturalnym techniką mikroskopii w kontraście Nomarskiego (DIC). Stwierdziłam też, że zdolność do chłonięcia wody i zwiększania objętości kompozytu zależy w dużym stopniu od zawartości glukanu: im mniej jest polimeru w składzie kompozytu, tym mniej wody on absorbuje i w tym mniejszym stopniu zwiększa swoją objętość. Jednakże wymieniona zależność występuje pod warunkiem maksymalnego upakowania kompozytu granulatem frakcji ceramicznej (jak podano w procedurze patentowej; Patent 206394). 17

Badanie parametrów mechanicznych kompozytów (w stanie suchym i nasączonym) dostarczyło interesujących informacji. Okazało się, że wartości wytrzymałości na ściskanie i modułu Younga odpowiadają wartościom wykazywanym przez tkankę kostną gąbczastą (zwłaszcza dla kompozytów w stanie suchym). Wartości tych dwóch parametrów różniły się między sobą dla próbek kompozytu o różnej zawartości kurdlanu. Wynosiły one odpowiednio: 3,27-5,92 MPa oraz 0,417-0,777 GPa dla próbek suchych oraz 0,18-0,26 MPa oraz 0,18-0,271 GPa dla próbek nasączonych. Obniżenie wartości badanych parametrów po nasączeniu materiału płynami nie było niespodzianką, gdyż właśnie dzięki temu kompozyt stawał się elastyczny i poręczny chirurgicznie. Nie zauważono znaczącego wpływu procentowego udziału poszczególnych składników kompozytu na jego parametry mechaniczne w badanym przedziale ich stosunków ilościowych (9,1-16,7% kurdlanu i 90,9-83,3% ceramiki). Ze względu na przydatność aplikacyjną kompozytu jako potencjalnego materiału implantacyjnego, określiłam wpływ sposobu sterylizacji na zachowanie jałowości oraz wartości parametrów mechanicznych w trakcie przechowywania próbek. W tym celu wyselekcjonowałam dwa sposoby sterylizacji zasadne w przypadku dwufazowego kompozytu ceramiczno-polimerowego: autoklawowanie oraz jałowienie tlenkiem etylenu. Stwierdziłam, że próbki sterylizowane obiema zastosowanymi metodami po 1 roku przechowywania zachowały pełną jałowość oraz wyjściowe wartości parametrów mechanicznych, co czyni badany kompozyt dobrym kandydatem do pełnienia funkcji biomateriału implantacyjnego. Należy wspomnieć, że do chwili obecnej zbadałam kompozyty po 5 latach od przeprowadzenia procesu sterylizacji: również i te próbki zachowały pełną jałowość, jednakże dane te nie zostały opublikowane. Kompozyt wykazał bioaktywność (zdolność do stymulacji odkładania się biologicznego apatytu na powierzchni materiału inkubowanego w symulowanym płynie tkankowym SBF). Po 1 miesiącu inkubacji w SBF masa próbki zwiększyła się o około 2,5 %, a technika SEM- EDS wykazała obecność odkładających się fosforanów wapnia na dużym obszarze powierzchni fazy polimerowej. Wysoka mikroporowatość granul HAp użytych do produkcji kompozytu, dzięki dużej powierzchni właściwej, działa prawdopodobnie stymulująco na ten proces. Uzyskane pozytywne rezultaty dotyczące wytworzenia nowego materiału kompozytowego o właściwościach zbliżonych do kości ludzkiej zdecydowały o czynnościach związanych z ochroną patentową wynalazku, w pierwszej kolejności w Urzędzie Patentowym Rzeczpospolitej Polskiej, a następnie w Europejskim Urzędzie Patentowym. Obie procedury zostały zakończone pozytywnie, co w przypadku EPO należy uznać za sukces, gdyż polskie wynalazki bardzo trudno opatentować za granicą. Jednocześnie warto podkreślić, że w ramach interdyscyplinarnego zespołu wynalazczego (UM w Lublinie, AGH w Krakowie) udało nam się doskonale ze sobą współpracować i osiągnąć założony cel. Wyniki omówionych badań zostały opublikowane w formie 1 pracy oryginalnej jako artykuł w czasopiśmie oraz 2 patentów (jeden polski i jeden międzynarodowy): 18