Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej

Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej 1

2

Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej 3

Wydane przez World Health Organization w 2003 r. pod tytułem,,basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology, wydanie 2 World Health Organization 2003 Copyright for the Polish edition by Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005 Dyrektor Generalny World Health Organization udzielił praw na wydanie w języku polskim Wydawnictwu Lekarskiemu PZWL, które jest całkowicie odpowiedzialne za polskie wydanie. Wszelkie prawa zastrzeżone. Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości bądź części książki bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione. Redaktor ds. publikacji medycznych mgr Anna Plewa Redaktor mgr Alicja Pałkiewicz Redaktor techniczny Maria Karczewska Korekta Zespół Projekt okładki i stron tytułowych Jolanta Krafft-Przeździecka Dawkowanie leków Autorzy i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby wybór i dawkowanie leków w tym opracowaniu były zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyką kliniczną. Mimo to, ze względu na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowych wyników badań dotyczących podstawowych i niepożądanych działań leków, Czytelnik musi brać pod uwagę informacje zawarte w ulotce dołączonej do każdego opakowania, aby nie przeoczyć ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to także specjalnych ostrzeżeń i środów ostrożności. Należy o tym pamiętać, zwłaszcza w przypadku nowych lub rzadko stosowanych substancji. ISBN 83-200-3133-8 Wydanie I Wydawnictwo Lekarskie PZWL 00-251 Warszawa, ul. Miodowa 10 tel. (0-prefiks-22) 695-40-33 Księgarnia wysyłkowa: tel. (0-prefiks-22) 695-44-80 infolinia: 0 801-142-080 www.pzwl.pl e-mail: promocja 0 pzwl.pl Skład i łamanie: EGRAF, Warszawa Druk i oprawa: Pabianickie Zakłady Graficzne S.A., Pabianice 4

Przedmowa do polskiego wydania Pierwszym, podstawowym celem diagnostyki mikrobiologicznej jest identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia. Wskazanie drobnoustroju odpowiedzialnego za infekcję jest podstawą wyboru sposobu leczenia, postępowania zmierzającego do ograniczenia jego rozprzestrzeniania się, a także oceny rokowania. Rozpoznanie danego mikroorganizmu może być dokonane przez bakterioskopowe badanie próbki od pacjenta, hodowlę i identyfikację. Czynnik etiologiczny zakażenia można też identyfikować na podstawie obecności w próbkach antygenów, które wykrywa się za pomocą serologicznych metod diagnostycznych. Jeszcze inną drogą postępowania jest wykrywanie charakterystycznego dla drobnoustroju kwasu nukleinowego, do czego służą wprowadzone w ostatnich latach techniki molekularne. Pośrednio czynnik etiologiczny zakażenia może być rozpoznany na podstawie swoistych przeciwciał wytworzonych w zakażonym organizmie. Odpowiednio dobrane antygeny i metody pozwalają na oznaczenie zarówno klas, jak i miana przeciwciał. Wybór metody diagnostycznej jest podyktowany wieloma względami, takimi jak: zdolność drobnoustrojów do wzrostu w warunkach in vitro i szybkość jego wzrostu, charakter zakażenia i jego przebieg, wyposażenie laboratorium, wykształcenie personelu, wreszcie możliwości finansowe. Prawidłowe wykonanie badania mikrobiologicznego, niezależnie od zastosowanej metody, wymaga postępowania według określonych szczegółowo procedur, które obejmują: pobranie i transport próbek, metodę przeprowadzenia badania w pracowni mikrobiologicznej, sposób opracowania, wydania i interpretacji wyniku. Wydane pod patronatem WHO,,Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej (Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology) to publikacja podsumowująca aktualne wytyczne w zakresie doboru materiału w określonych zakażeniach i pobierania próbek, identyfikacji drobnoustrojów oraz oznaczania lekooporności. Informacje w niej zawarte mają na celu ujednolicenie techniki badań mikrobiologicznych i podniesienie jakości usług laboratoryjnych w krajach rozwijających się i tych, w których diagnostyka mikrobiologiczna nie jest dobrze zorganizowana lub doceniana, na co wskazuje wysokie zużycie antybiotyków i szybko wzrastająca liczba szczepów wieloopornych. Publikacji, którą mają Państwo przed sobą, nie można traktować jako zbioru obowiązujących procedur, może ona jednak pomóc w tworzeniu własnych procedur w laboratorium mikrobiologicznym, być cennym źródłem nauki metod diagnostycznych, szczególnie prostych i tanich, szczegółowo w podręczniku opisanych. Niektóre metody diagnostyczne dotyczą chorób w Polsce nie spotykanych, np. cholera, wrzód miękki, mycetoma, jednak szybkie i częste przemieszczanie się ludzi ustawicznie grozi przemieszczaniem się drobnoustrojów, a łatwy dostęp do mało popularnych w Polsce procedur diagnostycznych może pomóc w rozpoznaniu, a więc w zapobieganiu i rozpowszechnieniu się niekonwencjonalnego zakażenia. Niniejsza publikacja będzie z pewnością cennym podręcznikiem, szczególnie dla studentów analityki medycznej, wydziału lekarskiego i stomatologii, na rynku brak bowiem opracowania z zakresu diagnostyki mikrobiologicznej, której studenci uczą się na ćwiczeniach. Opisane w publikacji procedury nie uwzględniają komercyjnych metod badawczych opartych na aparatach i podłożach do monitorowanego posiewu krwi i płynów ustrojowych, do przyspieszonej diagnostyki gruźlicy oraz gotowych 5

podłożach do przesiewowych półilościowych badań moczu.,,podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej zawierają opis metod identyfikacji i oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów opierających się na podłożach różnicujących i prostych testach wskaźnikowych, bez uwzględnienia metod półautomatycznych lub automatycznych. Metody oznaczania lekowrażliwości i identyfikacja nowych mechanizmów oporności, ze względu na zmieniającą się sytuację epidemiologiczną, wymagają ciągłej modyfikacji i aktualizacji, stąd procedury opisane w podręczniku należy traktować jako ogólne, w praktyce opierając się przede wszystkim na rekomendacjach Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów. Podręcznik nie uwzględnia metod molekularnych i immunochemicznych w diagnozowaniu zakażeń. Zgodnie z tytułem przedstawione są rzeczywiście podstawowe procedury laboratoryjne i warto podkreślić,że korzyści dla mikrobiologa z takiego podejścia do diagnostyki są naprawdę duże. Szczególnie cenne jest przypomnienie, jak ważny jest i ile informacji może dostarczyć preparat bezpośredni: można nauczyć się oszczędności, liczyć czas badania. Cenną częścią podręcznika jest podkreślanie w każdym z rozdziałów konieczności kontroli wewnątrz- i zewnątrzlaboratoryjnych procedur oraz kontroli sprzętu i testów. Podsumowując, przedstawiona publikacja może być pomocna w opracowaniu i wdrożeniu tańszych, a jednocześnie rzetelnych metod diagnostyki mikrobiologicznej. Prof. dr hab. med. Anna Przondo-Mordarska 6

Spis treści Wstęp... 10 Wprowadzenie... 11 Zapewnienie jakości badań bakteriologicznych... 12 Wprowadzenie......................................... 12 Definicje............................................. 12 Wewnętrzna kontrola jakości... 16 Zewnętrzna kontrola jakości... 27 CZE ŚĆ I. BADANIA BAKTERIOLOGICZNE... 29 Krew... 30 Wprowadzenie......................................... 30 Kiedy i u kogo może wysta pić bakteriemia..................... 30 Pobieranie próbek krwi................................... 31 Podłoża do posiewu krwi................................. 32 Prowadzenie hodowli z krwi............................... 33 Płyn mózgowo-rdzeniowy... 36 Wprowadzenie......................................... 36 Pobieranie i transport próbek... 36 Ocena makroskopowa................................... 37 Badanie mikroskopowe................................... 37 Wstępna identyfikacja.................................... 39 Oznaczanie lekowrażliwości... 40 Mocz... 41 Wprowadzenie......................................... 41 Pobieranie materiału do badania............................ 41 Hodowla i interpretacja................................... 43 Interpretacja wyników posiewu ilościowego moczu............... 46 Identyfikacja.......................................... 47 Oznaczanie lekowrażliwości... 47 Kał... 48 Wprowadzenie......................................... 48 Czynniki etiologiczne i objawy kliniczne....................... 48 Właściwe ukierunkowanie diagnostyki laboratoryjnej.............. 50 Pobieranie i przesyłanie próbek kału......................... 51 Badanie wizualne próbek kału.............................. 52 Podłoża transportowo-wzbogacaja ce i posiew próbek kału......... 53 Podłoża do hodowli patogenów jelitowych..................... 53 Wstępna izolacja....................................... 54 Wstępna identyfikacja izolowanych szczepów... 56 Końcowa identyfikacja mikrobiologiczna....................... 62 Identyfikacja serologiczna................................. 67 7

SPIS TREŚCI Zakażenia górnych dróg oddechowych... 73 Wprowadzenie......................................... 73 Flora fizjologiczna gardła... 73 Bakteryjne czynniki zapalenia gardła... 74 Pobieranie i przesyłanie próbek... 75 Mikroskopia bezpośrednia................................ 76 Hodowla i identyfikacja................................... 76 Badanie lekowrażliwości... 78 Zakażenia dolnych dróg oddechowych... 79 Wprowadzenie......................................... 79 Najczęstsze postacie kliniczne zakażeń... 79 Pobieranie próbek plwociny............................... 81 Opracowanie plwociny w laboratorium (w zakażeniach niegruźliczych)........................... 81 Hodowla Mycobacterium tuberculosis... 85 Interpretacja hodowli M. tuberculosis... 88 Podstawowe zasady bezpieczeństwa........................ 88 Choroby przenoszone droga kontaktów seksualnych... 89 Wprowadzenie......................................... 89 Zapalenie cewki moczowej u mężczyzn....................... 90 Próbki z żeńskich narza dów płciowych....................... 93 Próbki z owrzodzeń narza dów płciowych...................... 96 Ropne wydzieliny, rany i ropnie... 100 Wprowadzenie......................................... 100 Postacie kliniczne i najczęstsze czynniki etiologiczne............. 100 Pobieranie i transport próbek... 103 Ocena makroskopowa................................... 104 Badanie mikroskopowe................................... 105 Hodowla............................................. 107 Identyfikacja.......................................... 108 Badanie lekowrażliwości... 112 Zakażenia bakteriami beztlenowymi... 113 Wprowadzenie......................................... 113 Podział bakterii ze względu na wymagania tlenowe.............. 113 Diagnostyka zakażeń bakteriami beztlenowymi.................. 114 Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki... 119 Wprowadzenie......................................... 119 Podstawowe zasady oznaczania lekowrażliwości... 119 Kliniczna definicja terminów,,oporny i,,wrażliwy... 120 Wskazania do rutynowego oznaczania lekowrażliwości... 122 Wybór leków do oznaczania lekowrażliwości w laboratoriach klinicznych.............................. 123 Zmodyfikowana metoda Kirby-Bauera........................ 125 Bezpośrednie a pośrednie oznaczanie lekowrażliwości... 133 Czynniki techniczne wpływaja ce na wielkość strefy zahamowania w metodzie dyfuzyjno-kra żkowej........... 134 Kontrola jakości... 136 8

SPIS TREŚCI Badania serologiczne... 138 Wprowadzenie......................................... 138 Metody kontroli jakości... 138 Reakcje serologiczne.................................... 141 Odczyny serologiczne w diagnostyce kiły... 142 Wykrywanie aglutynin w gora czce........................... 150 Odczyn ASO.......................................... 152 Wykrywanie antygenów bakteryjnych......................... 155 CZE ŚĆ II. NAJWAŻNIEJSZE PODŁOŻA I ODCZYNNIKI... 157 Wprowadzenie... 158 Patogeny, podłoża i odczynniki diagnostyczne... 159 Krew................................................ 160 Płyn mózgowo-rdzeniowy................................. 161 Mocz................................................ 161 Kał... 162 Górne drogi oddechowe.................................. 164 Dolne drogi oddechowe.................................. 165 Próbki z układu moczowo-płciowego do diagnostyki chorób przenoszonych droga kontaktów seksualnych................. 165 Ropa i wysięki... 166 Lista rekomendowanych podłoży i odczynników diagnostycznych dla laboratoriów mikrobiologicznych o średnim poziomie referencyjności 167 Wybrana literatura uzupełniaja ca... 171 Skorowidz... 172 9

Wstęp Choroby zakaźne są najczęstszą przyczyną zgonów w krajach rozwijających się, ich diagnozowanie i leczenie stanowi ważne wyzwanie dla służby zdrowia. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO, World Health Organization) od wielu lat wspiera rozwój i wprowadzanie standardowych technik w diagnostyce laboratoryjnej. Pierwszy program pod patronatem WHO z 1960 roku dotyczył standaryzacji oznaczania lekowrażliwość patogenów bakteryjnych. W 1976 roku 1 WHO Expert Committee on Biological Standardization wskazał na konieczność stosowania metody dyfuzyjno-krążkowej w oznaczaniu wrażliwości na antybiotyki 2. Równocześnie podjęto działania w celu wprowadzenia kontroli jakości badań laboratoryjnych. W 1981 roku WHO ustanowiła Międzynarodowy Program Kontroli Jakości Badań Mikrobiologicznych. Laboratoria, które uczestniczą w programie, mogą pełnić przewodnią rolę we wprowadzaniu kontroli jakości badań w skali kraju na wszystkich poziomach systemu usług medycznych. Publikacja, którą mają Państwo przed sobą, jest podsumowaniem aktualnych wytycznych WHO, dotyczących pobierania próbek do badań laboratoryjnych, identyfikacji drobnoustrojów oraz oznaczania lekooporności. Wprowadzenie do praktyki laboratoryjnej informacji zawartych w podręczniku ma na celu ujednolicenie techniki badań mikrobiologicznych i oceny lekowrażliwości oraz podniesienie jakości usług laboratoryjnych, zarówno na poziomie centralnym, jak iśrednim. Podręcznik koncentruje się raczej na procedurach niż na podstawowych technikach mikroskopowania i barwienia, które zostały opisane szczegółowo w innych publikacjach WHO 3. 1 The public health aspects of antibiotics in feedstuffs. Report on a Working Group, Bremen, 1 5 October 1973. Copenhagen, WHO Regional Office for Europe, 1973 (document no. EURO 3604 (2)). 2 WHO Expert Committee on Biological Standardization. Twenty-eight report. Geneva, World Health Organization, 1977 (WHO Technical Report Series, No. 610). 3 Manual of basic techniques for a health laboratory, 2 nd ed. Geneva, World Health Organization, 2003. 10

Wprowadzenie Koszty związane z chorobami zakaźnymi wciąż stanowią nieproporcjonalnie duże obciążenie dla budżetu zdrowia w krajach rozwijających się. Według Światowego Raportu Zdrowia (The world health report) 1 ostra biegunka jest przyczyną 2,2 milionów zgonów rocznie. Ostre infekcje układu oddechowego (głównie zapalenie płuc) są kolejną ważną przyczyną śmiertelności, odpowiedzialną za około 4 miliony zgonów rocznie. Analiza dostępnych danych wskazuje, że w krajach rozwijających się patogenami wywołującymi zapalenie płuc w dzieciństwie są częściej niż wirusy, takie bakterie, jak Haemophilus influenzae i Streptococcus pneumoniae. Wróżnych regionach świata pojawiły się szczepy H. influenzae wytwarzające β-laktamazy i S. pneumoniae o zmniejszonej wrażliwości na benzylopenicylinę, sprawiając, że nadzór nad tymi patogenami jest coraz bardziej istotny. Choroby przenoszone drogą kontaktów seksualnych są coraz częstsze. W konsekwencji niewystarczającego nadzoru epidemiologicznego i niedostatecznych działań profilaktycznych aktualne są wciąż zagrożenia epidemią lub pandemią, wywołaną czynnikami bakteryjnymi lub wirusowymi. Dla skutecznej kontroli i profilaktyki chorób zakaźnych konieczny jest rozwój prostych narzędzi nadzoru epidemiologicznego i monitorowania choroby oraz prostych i czułych metod diagnostycznych. Aby sprostać wyzwaniom w wyżej opisanej sytuacji, system usług laboratoryjnych musi być oparty na współpracy sieci laboratoriów wykonujących diagnostykę mikrobiologiczną dla centrów medycznych, lekarzy klinicystów i epidemiologów. Złożoność zadań powinna wzrastać proporcjonalnie: od podstawowych, poprzez średnie, do centralnych laboratoriów (zależnie od poziomu referencyjności laboratorium przyp. tłum.). Tylko w ten sposób możliwe będzie dostatecznie szybkie zebranie istotnych informacji, które usprawnią nadzór, umożliwią wczesną diagnostykę epidemii lub nietypowych zakażeń oraz rozwój, zastosowanie i ocenę określonych środków interwencji. 1 The world health report 2000, Geneva, World Health Organization, 2000. 11

Zapewnienie jakości badań bakteriologicznych Wprowadzenie Programy zapewniania jakości są skutecznym sposobem zagwarantowania standardówusług diagnostyki laboratoryjnej i podnoszenia tych standardów, jeśli zachodzi potrzeba. W mikrobiologii pojęcie jakości wykracza poza zagadnienia techniczne, dotycząc szybkości, kosztów oraz przydatności klinicznej testu. Testy laboratoryjne są stosunkowo drogie i wraz z postępem medycyny proporcjonalnie zwiększają obciążenie budżetu służby zdrowia. Definicje Cechą testu dobrej jakości jest jego wartość kliniczna, np.: w profilaktyce i leczeniu choroby. Inne cechy jakości testu, to: Niezawodność: Czy wynik jest wiarygodny? Powtarzalność: Czy otrzymamy taki sam wynik w powtórnym badaniu? Szybkość: Czy test jest wystarczająco szybki, aby był użyteczny dla lekarza zalecającego leczenie? Współczynnik koszt korzyść: Czy koszt badania jest proporcjonalny do korzyści dla pacjenta i społeczeństwa? Czynniki wpływaja ce na wiarygodność i powtarzalność wyników laboratoryjnych Przyczyny błędów: Personel. Wyniki pracy personelu laboratorium pozostają w ścisłym związku ze stopniem edukacji i dokształcaniem, doświadczeniem oraz warunkami zatrudnienia. Czynniki środowiskowe. Na wyniki mogą wpływać: warunki przestrzenne, oświetlenie, wentylacja, temperatura, nadmierny poziom hałasu, niebezpieczne warunki pracy. Materiał do badań. Sposób i czas pobrania materiału do badań oraz pochodzenie próbki, często pozostające poza kontrolą laboratorium, mają bezpośredni związek z możliwością uzyskania wiarygodnych wyników. Czynnikami, wpływającymi na jakość wyników, które pozostają pod kontrolą laboratorium, są: transport, przechowywanie, przygotowanie próbek do badania oraz identyfikacja. Laboratorium pełni funkcję edukacyjną wobec osób odpowiedzialnych za pobieranie i transport próbek. Pisemne instrukcje powinny być przygotowane w przystępny sposób i regularnie omawiane z klinicystami i pielęgniarkami. Materiały laboratoryjne. Jakość odczynników, chemikaliów, szklanych naczyń, barwników, podłoży do hodowli oraz zwierząt laboratoryjnych wpływa na wiarygodność wyników badań. Metody badań. Niektóre metody są bardziej wiarygodne niż inne. Sprzęt. Brak sprzętu, niewystarczające lub niezgodne ze standardem wyposażenie są przyczyną uzyskiwania niewiarygodnych wyników. 12

PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ Badanie i odczyt. Pospieszne odczytywanie wyników lub brak badania wystarczającej liczby pól mikroskopowych mogą być powodem błędów. Sprawozdanie. Błędy w przepisywaniu lub niekompletne opisy wyników. Jakość interpretacji wyników badań W mikrobiologii szczególnie ważna jest interpretacja wyników. Na każdym etapie badania próbki rezultaty powinny być interpretowane w celu wyboru, do kolejnego etapu badania, testu optymalnego pod względem szybkości i wiarygodności. Zapewnienie jakości w laboratorium mikrobiologicznym Zapewnienie jakości jest sumą działań, w które zaangażowane jest laboratorium, aby zapewnić dobrą jakość wyników. Działania te muszą być: kompletne: aby zapewnić kontrolę na każdym etapie procesu od pobrania próbki do przedstawienia końcowego wyniku lekarzowi (ryc. 1); racjonalne: aby skoncentrować się na najbardziej krytycznych etapach procesu; regularne: aby zapewnić stałą kontrolę procedur; częste: aby szybko wykryć i skorygować błędy. DOBRA JAKOŚĆ BADAŃ LABORATORYJNYCH TO DOBRA JAKOŚĆ MEDYCYNY Zapewnienie jakości pozwala na możliwie oszczędne stosowanie drogich testów; określa także zasadność i wartościowość nowych testów, podnosi jakość usług szpitalnych i pozaszpitalnych laboratoriów oraz zapewnia porównywalność otrzymanych wyników niezależnie od miejsca ich wykonania. Rodzaje gwarancji jakości Istnieją dwa rodzaje gwarancji jakości: wewnętrzna i zewnętrzna. Wewnętrzna. Tak zwana KONTROLA JAKOŚCI. Każde laboratorium ma system sprawdzania jakości wykonywanych przez siebie testów. Na wewnętrzną kontrolę jakości składają się: cia gły monitoring jakości testów; pełne sprawdzanie wszystkich etapów diagnostyki: od pobrania próbki do badania (jeśli jest to możliwe) do odesłania końcowego wyniku. Laboratoria mają etyczną odpowiedzialność wobec pacjenta za przedstawienie dokładnych i przydatnych wyników. WEWNE TRZNA KONTROLA JAKOŚCI JEST NIEZBE DNA DLA PRAWIDŁOWEGO FUNKCJONOWANIA PROCEDURY 13

ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ BAKTERIOLOGICZNYCH PACJENT Z INFEKCJA Przechowywanie Pobieranie materiału 10 Próbka, dane kliniczne Transport, oznaczanie Ocena makroskopowa, zapach Mikroskopia, interpretacja WYNIK WSTE PNY przekazany lekarzowi Hodowla: wybór podłoża, temperatury, atmosfery Izolacja czystych kolonii, antybiogram Identyfikacja, interpretacja (zanieczyszczenie, komensal lub patogen) Ryc. 1. Etapy diagnostyki mikrobiologicznej zakażenia u pacjenta. WYNIK KOŃCOWY przekazany lekarzowi Zewnętrzna. Tak zwana OCENA JAKOŚCI. Wyniki działalności laboratorium kontrolowane są przez zewnętrzną instytucję. W niektórych krajach podleganie zewnętrznej ocenie jakości jest obowiązkowe (regulacje rządowe) i wymagane do uzyskania licencji. Na zewnętrzną ocenę jakości składają się: okresowy monitoring jakości testów; wybiórcza kontrola procesu identyfikacji i niekiedy technik izolacji. WHO 90960 Kryteria jakości w mikrobiologii Przydatność kliniczna Ważnym kryterium jakości badania mikrobiologicznego jest jego przydatność w zapobieganiu i leczeniu chorób zakaźnych; jest to tak zwana przydatność kliniczna. Warunkiem koniecznym do uzyskania pożądanego efektu klinicznego jest współpraca między lekarzem i laboratorium. Poniższe przykłady obrazują przydatność kliniczną: 1. Izolacja kilku kolonii Gram-ujemnych pałeczek z plwociny lub z wymazu z gardła hospitalizowanego pacjenta oraz identyfikacja drobnoustrojów z antybiogramem nie mają żadnego znaczenia klinicznego, ponieważ żadna z tych procedur nie wpłynie na podjęte leczenie. 2. W przypadku izolacji Streptococcus pyogenes wykonanie pełnego antybiogramu nie ma znaczenia klinicznego, ponieważ benzylopenicylina jest lekiem z wyboru, zawsze aktywnym in vitro. 3. W przypadku izolacji Escherichia coli u pacjenta z biegunką bez domieszki krwi, identyfikacja serotypu nie jest klinicznie przydatna, jeśli nie można wykazać związku między serotypem a chorobotwórczością. 4. Rutynowa identyfikacja mieszanej flory beztlenowej widocznej w preparacie barwionym metodą Grama nie ma znaczenia klinicznego. Jest czasochłonna, droga i nie wpłynie na leczenie pacjenta. 5. Jeśli z próbek pobranych z dróg oddechowych zostaną wyizolowane grzyby, celowe jest wykonanie testu identyfikującego Cryptococcus. Dalsza iden- 14

PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ tyfikacja nie ma znaczenia klinicznego, ponieważ nie wpłynie na sposób leczenia pacjenta. Podsumowując, badanie dobrej jakości to takie, które jest dokładne i dostarcza informacji użytecznych w zapobieganiu i leczeniu chorób zakaźnych. Izolacja i identyfikacja wszystkich mikroorganizmów w próbce nie jest konieczna. Wiarygodność Dla badań ilościowych wiarygodność badania jest mierzona przez porównanie otrzymanych wyników z rzeczywistą wartością. Poniżej przedstawiono przykłady badań tego typu: określanie stężenia antybiotyków w surowicy; pomiar wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) antybiotyków in vitro; określanie miana przeciwciał w surowicy. Dla badań jakościowych wiarygodność badania określana jest przez ocenę zgodności wyniku ze stanem rzeczywistym. Poniżej przedstawiono przykłady opisanych badań: identyfikacja patogenów; oznaczanie wrażliwości izolatów na antybiotyki metodą dyfuzji krążkowej. Konieczne jest stosowanie standardowej terminologii. Zawsze należy używać międzynarodowych nazw drobnoustrojów, np.: Staphylococcus aureus, NIE,,patogenne gronkowce ; Streptococcus pyogenes, NIE:,,paciorkowce hemolizujące. Niezbędne jest stosowanie jednolitych, uznanych metod diagnostycznych. Oznaczanie lekowrażliwości metodą dyfuzji krążkowej powinno być wykonywane zgodnie z przyjętymi, międzynarodowymi standardami, na przykład zmodyfikowaną metodą Kirby-Bauera (str. 125). Powtarzalność Powtarzalność i precyzja wykonywanych badań ograniczone są przez dwa czynniki: 1. Brak jednorodności. Pojedyncza próbka pochodząca od pacjenta może zawierać więcej niż jeden drobnoustrój. Powtarzanie hodowli może więc prowadzić do izolacji różnych mikroorganizmów. 2. Brak stabilności. Wraz z upływem czasu mikroorganizmy w próbce w różnym stopniu namnażają się lub giną. Powtarzanie hodowli może prowadzić do izolacji różnych drobnoustrojów. W związku z powyższym, w celu uzyskania większej dokładności, badania powinny być przeprowadzane jak najszybciej po pobraniu próbek. Skuteczność Skuteczność badań mikrobiologicznych jest to możliwość uzyskania właściwej diagnozy dotyczącej patogenu lub stanu patologicznego. Powyższa wartość oceniana jest według dwóch kategorii: 15

ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ BAKTERIOLOGICZNYCH 1. Czułość diagnostyczna. Czułość = ogólna liczba dodatnich wyników ogólna liczba zakażonych pacjentów Im większa czułość testu, tym mniejsza liczba fałszywie ujemnych wyników. Na przykład czułość agaru MacConkeya jest zbyt niska w odniesieniu do izolacji Salmonella typhi z kału. Ten ważny patogen jelitowy może zostać przeoczony z powodu nadmiernego wzrostu niepatogennych bakterii jelitowych. 2. Swoistość diagnostyczna Swoistość = ogólna liczba ujemnych wyników ogólna liczba niezakażonych pacjentów Im większa swoistość testu, tym mniejsza liczba fałszywie dodatnich wyników. Przykłady: Barwienie preparatów z plwociny metodą Ziehl-Neelsena jest wysoce swoiste w diagnostyce gruźlicy, ponieważ daje nieliczne fałszywie dodatnie wyniki. Barwienie preparatów moczu metodą Ziehl-Neelsena jest dużo mniej swoiste, ponieważ daje wiele fałszywie dodatnich wyników (z powodu obecności atypowych prątków). Test Widala ma bardzo niską swoistość w diagnostyce duru brzusznego, ponieważ krzyżowo reagujące przeciwciała, powstałe w przebiegu infekcji wywołanych pokrewnymi serotypami Salmonella, dają fałszywie dodatnie wyniki. Czułość i swoistość testu są ze sobą związane. Czułość testu może być wyższa kosztem zmniejszenia jego swoistości i vice versa. Obydwie wartości pozostają także w związku z częstością występowania danej choroby w badanej populacji. Wewnętrzna kontrola jakości Wymagania Program wewnętrznej kontroli jakości powinien być praktyczny, realny i ekonomiczny. Program wewnętrznej kontroli jakości nie powinien oceniać każdej procedury, odczynnika czy podłoża do hodowli każdego dnia pracy. Powinien oceniać procedurę, odczynniki czy podłoże do hodowli zgodnie z praktycznym schematem, uwzględniającym wpływ każdego elementu na jakość badania. Procedury Wewnętrzna kontrola jakości rozpoczyna się od właściwych działań laboratorium. 16

PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ Spis działań laboratoryjnych Każde laboratorium powinno mieć wykaz działań, który obejmuje: sprzątanie miejsca pracy, zasady higieny osobistej, zasady bezpieczeństwa, wyznaczone poza obszarem laboratorium strefy socjalne i dla palących, postępowanie ze skażonym materiałem i jego usuwanie, odpowiednie szczepienia personelu, np. przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, dbałość o sprzęt, pobieranie próbek na badania, rejestrację próbek, eliminację nieodpowiednich próbek, postępowanie z próbką, zapis wyników, wydawanie wyników. Zawarte w spisie działania powinny być dokładnie realizowane, regularnie oceniane i aktualizowane. Dbałość o sprzęt Istotne znaczenie ma dbałość o wyposażenie laboratorium. Badania wysokiej jakości nie mogą być wykonywane sprzętem niskiej jakości lub niewłaściwie utrzymanym. W tabeli 1 przedstawiono wykaz rutynowych działań, mających zapewnić właściwą dbałość o sprzęt. Zakres temperatur działającego urządzenia może być rejestrowany w formie przedstawionej na ryc. 2. Podłoża do hodowli Podłoża do hodowli mogą być przygotowywane ze składników podstawowych, z komercyjnie dostępnych podłoży sypkich lub zakupione w formie gotowej do użycia. Ze względów ekonomicznych, z uwagi na łatwość transportu i przechowywania oraz wyższą jakość w porównaniu z podłożami przygotowanymi w laboratorium, rekomendowane są komercyjnie dostępne podłoża sypkie. Dla uzyskania najlepszych wyników konieczne jest uwzględnienie uwag ujętych w poniższych punktach. Wybór podłoża Sprawnie działające laboratorium zaopatrzone jest w najmniejszy możliwy asortyment podłoży zgodnych z profilem wykonywanych badań. Dobrym przykładem jest podłoże agarowe, które może być użyte jako baza do przygotowania agaru z krwią, agaru czekoladowego oraz kilku innych selektywnych podłoży. Do izolacji patogennych Enterobacteriaceae z kału niezbędne jest jedno wysoce selektywne podłoże (agar Salmonella-Shigella lub agar z cytry- 17

ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ BAKTERIOLOGICZNYCH nianem deoksycholanu) oraz jedno mniej selektywne podłoże (agar MacConkeya). W celu identyfikacji Campylobacter spp. należy zastosować specjalne podłoże. Zamawianie i przechowywanie suchych podłoży 1. Należy zamawiać ilość, która zostanie zużyta w ciągu 6 miesięcy lub maksymalnie w ciągu roku. 2. Całość należy podzielić i umieścić w pojemnikach, których zawartość powinna zostać zużyta w ciągu 1 2 miesięcy. 3. Szczelnie domknąć pokrywki pojemników. Suche podłoża absorbują wilgoć z otoczenia. W wilgotnym klimacie należy uszczelnić zamknięcie pojemnika, używając parafiny woskowej (wypełnić przestrzeń między pokrywką i pojemnikiem roztopionym woskiem i poczekać do zastygnięcia). 4. Zapisać datę zamknięcia na każdym pojemniku. 5. Przechowywać w ciemnym, chłodnym, przewiewnym miejscu. 6. Odwracać pojemnik tak, aby najpierw został zużyty starszy materiał. Tabela 1. Kontrola jakości sprzętu Anaerostat Sprzęt Podstawowe czynności Monitorowanie Cotygodniowe czyszczenie wnętrza pojemników. Reaktywacja katalizatora po każdym cyklu (160 C, 2 h). Wymiana katalizatora co 3 miesia ce Użycie paska wskaźnikowego z błękitem metylenowym w każdym cyklu. Odnotowanie czasu odbarwienia wskaźnika co tydzień Autoklaw Co miesia c czyszczenie i wymiana wody Sprawdzenie poziomu i uzupełnienie wody przed każdym cyklem. Zapis czasu i temperatury lub ciśnienia każdego cyklu. Cotygodniowy zapis wyniku testu z użyciem przetrwalników (przyp. tłum.: testy biologiczne) Wirówka Sterylizator szkła na suche, gora ce powietrze Przemywanie ścian wewnętrznych środkiem dezynfekcyjnym co tydzień oraz po uszkodzeniu probówki lub rozlaniu zawartości Czyszczenie urza dzenia wewna trz co miesia c Cieplarka Czyszczenie ścianek wewnętrznych i półek co miesia c Mikroskop Chłodziarka Łaźnia wodna Przecieranie soczewek szmatka lub bibuła do soczewek po każdym dniu pracy Czyszczenie i smarowanie mechanizmu stolika co tydzień Przykrycie pokrowcem nie używanego urza dzenia Czyszczenie i rozmrażanie co 2 miesia ce i po każdym przerwaniu zasilania pra dem Przecieranie ścian wewnętrznych i wymiana wody co miesia c Zapis czasu i temperatury każdego cyklu Zapis temperatury na pocza tku każdego dnia pracy (zakres temp. 35 ± 1 C) Sprawdzenie ustawienia kondensatora co miesia c Umieszczenie w pokrowcu z mikroskopem naczynia z błękitem krzemionkowym, w celu zapobiegania wzrostowi grzybów w wilgotnym środowisku Zapis temperatury każdego dnia rano (zakres temp.: 2 8 C) Codzienne sprawdzanie poziomu wody Zapis temperatury pierwszego dnia każdego tygodnia (zakres temp.: 55 57 C) Przegla d techniczny i konserwacja Cotygodniowa kontrola uszczelek i szczelności zamknięcia Co 6 miesięcy Wymiana szczotek co rok Co 6 miesięcy Co 6 miesięcy Co rok Co 6 miesięcy Co 6 miesięcy 18

PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ Temperatura Urza dzenie Pokój Odczytywać codziennie. Sprawdzić, czy odczytana wartość temperatury jest dopuszczalna. W przypadku nieprawidłowości zapisać temperaturę w rubryce. Data I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII Data 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 19 19 20 20 21 21 22 22 23 23 24 24 25 25 26 26 27 27 28 28 29 29 30 30 31 31 Ryc. 2. Zapisy temperatury działaja cych urza dzeń. 19

ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ BAKTERIOLOGICZNYCH 7. Jeśli pojemnik został otwarty, zapisać datę jego otwarcia. 8. Wyrzucić wszystkie suche podłoża, które ściemniały lub w których powstały zlepione grudki. 9. Prowadzić rejestr przechowywanych podłoży. Przygotowanie podłoża 1. Należy ściśle przestrzegać zaleceń producenta. 2. Przygotować ilość, która zostanie zużyta przed upływem terminu przydatności (patrz poniżej). Tabela 2. Zestaw szczepów zalecanych w kontroli jakości a Gram-dodatnie ziarenkowce Enterococcus faecalis (ATCC 29212 lub 33186) Staphylococcus aureus (ATCC 25923) Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus mitis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Gram-ujemne kwasooporne bakterie Moraxella catarrhalis Haemophilus influenzae typ b β-laktamazoujemne β-laktamazododatnie Haemophilus parainfluenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Bakterie beztlenowe Bacteroides fragilis Clostridium perfringens Enterobacteriaceae Citrobacter freundii Enterobacter cloacae Escherichia coli (ATCC 25922) Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Salmonella typhimurium Serratia marcescens Shigella flexneri Yersinia enterocolitica Inne Gram-ujemne pałeczki Acinetobacter lwoffi Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Vibrio cholerae (nie-01) Grzyby Candida albicans a Powinny zostać wybrane szczepy najbardziej odpowiadaja ce wymaganiom laboratorium. Przechowywanie gotowych podłoży 1. Ochrona przed światłem. 2. Ochrona przed ciepłem. Podłoża zawierające krew, inne składniki organiczne lub antybiotyki powinny być przechowywane w chłodziarce. 3. Termin przydatności gotowego podłoża, które jest przechowywane w niskiej temperaturze, w ciemnym miejscu, zależy od jego składu. Przeciętne terminy użyteczności: probówki z bawełnianym korkiem 3 tygodnie; probówki z nieszczelną nakładką 2 tygodnie; pojemniki z zakrętką 3 miesiące; płytki Petriego szczelnie zamknięte w plastikowych woreczkach 4 tygodnie. Kontrola jakości przygotowanych podłoży 1. Oznaczenie ph. Wartość ph prawidłowo przygotowywanych sypkich podłoży nie musi być rutynowo sprawdzana. Podłoża przygotowywane ze składników 20

PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ Tabela 3. Testy kontrolne dla powszechnie stosowanych podłoży Podłoże Inkubacja Organizm wskaźnikowy Oczekiwany wynik Agar z żółcia i eskulina 24 h Enterococcus faecalis Wzrost i zaczernienie Streptococcus α-hemolizuja cy Brak wzrostu Agar z krwia 24 h, CO 2 Streptococcus pyogenes Wzrost i β-hemoliza S. pneumoniae Wzrost i α-hemoliza Agar czekoladowy 24 h, CO 2 Haemophilus influenzae Wzrost Dekarboksylaza (pokryta sterylnym olejem) lizyny 48 h Shigella typhimurium Dodatni Shigella flexneri Ujemny ornityny 48 h S. typhimurium Dodatni Klebsiella pneumoniae Ujemny Dihydrolaza argininy 48 h S. typhimurium Dodatni Proteus mirabilis Ujemny Żelatynaza (szybki test) 24 h Escherichia coli Ujemny Serratia marcescens Dodatni Agar Kliglera (patrz Trójcukrowy agar żelazowy) Agar MacConkeya z fioletem krystalicznym 24 h E. coli Czerwone kolonie P. mirabilis Bezbarwne kolonie (brak wzrostu mgławicowego) E. faecalis Brak wzrostu Bulion malonianowy 24 h E. coli Ujemny (kolor zielony) K. pneumoniae Dodatni (kolor niebieski) Agar z mannitolem 24 h Staphylococcus aureus Żółte kolonie Staphylococcus epidermidis Różowe kolonie E. coli Brak wzrostu Czerwień metylowa/voges-proskauer 48 h E. coli Dodatni/ujemny K. pneumoniae Ujemny/dodatni Agar Mueller-Hintona 24 h E. coli ATCC 25922 S. aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Bulion azotanowy 24 h E. coli Dodatni Acinetobacter lwofii Ujemny Utlenianie/fermentacja dekstrozy (bez oleju) Akceptowane rozmiary strefy zahamowania (tab. 24, str. 126) 24 h P. aeruginosa Utlenianie na powierzchni A. lwofii Brak reakcji Woda peptonowa (indol) 24 h E. coli Dodatni K. pneumoniae Ujemny Deaminaza fenyloalaniny/chlorek żelaza Salmonella-Shigella agar lub agar z cytrynianem deoksycholanu 24 h E. coli Ujemny P. mirabilis Dodatni 24 h E. coli Bez wzrostu S. typhimurium Bezbarwne kolonie Yersinia enterocolitica Bezbarwne kolonie S. flexneri Bezbarwne kolonie Bulion seleninowy 24 h S. typhimurium Wzrost po przesianiu E. coli Brak wzrostu po przesianiu Agar cytrynianowy Simmonsa (inkubacja z luźna zakrętka ) Agar z solami żółci i cytrynianem tiosiarczanowym 48 h E. coli Brak wzrostu K. pneumoniae Wzrost, kolor niebieski 24 h Vibrio spp. (nieaglutynuja ce) Żółte kolonie Agar Thayer-Martina 24 h, CO 2 Neisseria meningitidis Wzrost Neisseria gonorrhoeae Wzrost Staphylococcus spp. Brak wzrostu E. coli Brak wzrostu C. albicans Brak wzrostu Bulion tioglikolanowy 24 h Bacteroides fragilis Wzrost 21

ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ BAKTERIOLOGICZNYCH Tabela 3 cd. a Podłoże Inkubacja Organizm wskaźnikowy Oczekiwany wynik Trójcukrowy agar żelazowy (głębokość co najmniej 2,5 cm; inkubacja z luźna zakrętka ) 24 h Citrobacter freundii A/A gaz a +H 2 S S. typhimurium K/A gaz a +H 2 S S. flexneri K/A gaz a A. lwofii Brak reakcji Podłoże z mocznikiem 24 h E. coli Ujemny P. mirabilis Dodatni (różowy) Voges-Proskauer (patrz Czerwień metylowa/voges-proskauer) A/A: punkt kwaśny; K/A: punkt zasadowy. podstawowych należy wcześniej schłodzić. W przypadku stałych podłoży do oznaczenia ph należy użyć powierzchniowej elektrody lub rozmiękczyć podłoże w wodzie destylowanej. Jeśli ph różni się od zalecanego więcej niż o 0,2 jednostki, należy je skorygować kwasem lub zasadą, lub przygotować nową partię. 2. Kontrola sterylności. Testy sterylności powinny być przeprowadzane rutynowo dla podłoży, do których po sterylizacji w autoklawie dodano krew lub inne składniki. 3 5% próbek należy poddać inkubacji w temperaturze 35 C przez 2 dni. Pozostałe schłodzić. Jeśli na płytce pojawią się więcej niż dwie kolonie, należy odrzucić całą badaną partię. 3. Kontrola jakości. Laboratorium powinno mieć zapas zestawów szczepów wzorcowych do monitorowania jakości podłoży. Lista zalecanych szczepów wzorcowych została przedstawiona w tabeli 2. Szczepy te mogą być uzyskane w trakcie rutynowej pracy lub pochodzić z komercyjnych czy też oficjalnych źródeł. Rekomendacje dotyczące utrzymania i wykorzystania szczepów wzorcowych opisane zostały na str. 24. Lista testów przeprowadzanych dla powszechnie używanych podłoży przedstawiona została w tabeli 3. Procedury postępowania przy ocenie jakości nowych partii podłoża: 1. Przygotować lekko mętną zawiesinę szczepów kontrolnych, porównującjąze wzorcem standardowego roztworu siarczanu baru używanego w zmodyfikowanej metodzie Kirby-Bauera (McFarland 0,5) (patrz str. 125) i użyć jedno oczko ezy jako inoculum. 2. Inkubować przez rutynowo stosowany okres i odczytać zgodnie z przyjętymi zasadami. 3. Właściwie zapisać wyniki. Barwniki i odczynniki Zalecenia dotyczące testowania niektórych odczynników przedstawiono w tabeli 4. Testy powinny być przeprowadzane: za każdym razem przy przygotowywaniu nowej partii roztworu roboczego; co tydzień (niezbędne w przypadku zimnego barwnika Ziehl-Neelsena: klasyczny ma kilkumiesięczny termin przydatności). Odczynniki i barwniki powinny być dyskwalifikowane, jeśli: termin ważności określony przez producenta jest przekroczony; widoczne są oznaki psucia (zmętnienie, osad, zmiana barwy). 22

PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ Antygeny i surowice odpornościowe do diagnostyki W celu otrzymania możliwie najlepszych wyników badań z użyciem antygenów i surowic odpornościowych należy: Zawsze przestrzegać instrukcji producenta. Przechowywać w zalecanej temperaturze. Niektóre odczynniki serologiczne nie tolerują zamrażania. Tabela 4. Testy jakości powszechnie stosowanych odczynników Odczynnik lub barwnik Gatunek użyty do testowania Wzrost Brak wzrostu Podłoże Kra żek z bacytracyna S. pyogenes (strefa zahamowania) E. faecalis Agar z krwia Katalaza S. aureus E. faecalis Agar tryptozowo-sojowy Osocze do koagulazy S. aureus S. epidermidis Agar tryptozowo-sojowy β-glukuronidaza (PGUA) a E. coli K. pneumoniae Agar tryptozowo-sojowy Barwienie metoda Grama Staphylococcus spp. E. coli Preparaty z mieszanki szczepów ONPG b E. coli S. typhimurium Trójcukrowy agar żelazowy lub agar Kliglera Kra żek z optochina S. pneumoniae (strefa zahamowania) Streptococcus mitis Agar z krwia Oksydaza Pseudomonas aeruginosa E. coli Agar tryptozowo-sojowy Kra żek z tellurydem E. faecalis (brak strefy zahamowania) Streptococcus agalactiae (strefa zahamowania) Agar z krwia Czynnik V (kra żek lub pasek) Haemophilus parainfluenzae Haemophilus influenzae Agar tryptozowo-sojowy Czynnik XV (kra żek lub pasek) H. influenzae Agar tryptozowo-sojowy Barwienie metoda Ziehl-Neelsena Mycobacterium tuberculosis Mieszana, niekwasooporna flora Preparat z rozmazem z plwociny c a Kwas 4-nitrofenylo-β-D-glukopiranozydouronowy (PGUA). b o-nitrofenylo-β-d-galaktopiranozyd. c Przygotować wymazy od pacjentów zdrowych i chorych. Utrwalić w cieple, owina ć każdy papierem i przechowywać wchłodziarce. Unikać powtarzanych zamrożeń i rozmrożeń. Przed zamrożeniem podzielić surowicę na odpowiednie porcje, wystarczające do wykonania kilku testów. Wyrzucić, jeśli upłynął termin ważności podany przez producenta. Do testu aglutynacji z surowicami odpornościowymi należy używać zawsze świeżych, czystych, zidentyfikowanych hodowli. Zawsze, w każdej serii badań, wykonać test z surowicą kontrolną o znanej reaktywności. Surowica może pochodzić od pacjenta lub z komercyjnego źródła. Jeśli to możliwe, aktywność surowicy powinna być wyrażana w jednostkach międzynarodowych (International Units, IU) na mililitr. Pary surowic, pobranych od jednego pacjenta w ostrej fazie choroby i w fazie zdrowienia, powinny być badane z użyciem odczynników z tej samej partii. Diagnostykę serologiczną kiły prowadzić zgodnie z przyjętymi krajowymi i międzynarodowymi procedurami. Każda partia testów serologicznych powinna zawierać: surowicę ujemną (kontrola swoistości); 23

ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ BAKTERIOLOGICZNYCH surowicę słabo dodatnią (kontrola czułości); surowicę silnie dodatnią (kontrola miareczkowania), która powinna być przygotowana w rozcieńczeniu odpowiadającym jej mianu uzyskanemu w ostatnio wykonywanym teście. Zawsze zapisywać wszystkie miana surowic kontrolnych. Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki Zalecane jest rutynowe stosowanie zmodyfikowanej metody Kirby-Bauera (str. 125). W celu uniknięcia błędów, należy przestrzegać poniższych zasad: Krążki powinny mieć właściwą średnicę (6,35 mm). Krążki powinny zawierać właściwe stężenie antybiotyku (tabela 24, str. 126). Zapas krążków powinien być przechowywany w zamrażarce ( 20 C). Zestaw podręczny powinien być przechowywany nie dłużej niż 1 miesiąc w chłodziarce (2 8 C). Do przeprowadzania badania jakości należy używać tylko agaru Mueller- -Hintona. Właściwe ph (7,2 7,4) gotowego podłoża jest bardzo istotne w przypadku niektórych antybiotyków. Gęstość inoculum powinna być standaryzowana, określona na podstawie wzorca zmętnienia (str. 127). Pomiar wielkości strefy powinien być dokładny. Uzyskana średnica strefy zahamowania wzrostu powinna być interpretowana według wartości granicznych podanych w tabeli. Średnica strefy dla szczepów kontrolnych powinna zgadzać się z zakresami podanymi w tabeli 24 (str. 126). Trzy standardowe szczepy kontrolne, to 1 : Staphylococcus aureus (ATCC 25923; NCTC 6571); Escherichia coli (ATCC 25922; NCTC 10418); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853; NCTC 10622). Badania kontrolne z wykorzystaniem wymienionych szczepów powinny być przeprowadzane: dla każdej nowej partii krążków; dla każdej nowej partii podłoży; raz w tygodniu, równolegle do antybiogramów wykonywanych rutynowo. W celu zapisu i interpretacji wyników kontroli jakości, zalecane jest stosowanie wykresu przedstawionego na ryc. 16 (str. 137). Pozyskiwanie i przechowywanie szczepów kontrolnych Wybór szczepów i źródło ich pochodzenia Należy wybrać szczepy, których maksymalna liczba morfologicznych, metabolicznych i serologicznych cech może być identyfikowana możliwie najmniejszą liczbą testów; zalecane szczepy kontrolne zebrano w tabeli 2. 1 Wymienione szczepy mogą być uzyskane z: American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, USA; lub National Collection of Type Cultures (NCTC), PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, England. 24

PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ Szczepy te można uzyskać z następujących źródeł: prawidłowo zidentyfikowane izolaty z próbek klinicznych; oficjalne kolekcje szczepów; komercyjni producenci; referencyjne laboratoria; inne źródła z zewnętrzną kontrolą jakości. Przechowywanie szczepów Długoterminowe przechowywanie szczepów Metody długoterminowego przechowywania szczepów pozwalają na kilkumiesięczne lub nawet kilkuletnie przerwy między przesiewami. Najlepszymi metodami są: liofilizacja (suchy lód), przechowywanie w zamrażarce lub w ciekłym azocie, w temperaturze 70 C lub niższej. Metody alternatywne opisano poniżej. Glicerol w temperaturze 20 C 1. Wzrost czystych hodowli na odpowiednim stałym podłożu. 2. Wyrosłe kolonie zebrać ezą. 3. Zawiesić niewielką ilość materiału w sterylnym neutralnym glicerolu. 4. Umieścić 1 2 ml porcje w zakręcanych pojemnikach lub w fiolkach. 5. Przechowywać w temperaturze 20 C. Unikać powtarzania zamrożeń i rozmrożeń. Przesiewać co 12 18 miesięcy. Olej mineralny w temperaturze pokojowej 1 1. Przygotować probówki ze skosem agarowym zawierającym wyciąg z serca. Dla wymagających mikroorganizmów dodać świeżą lub ogrzaną krew. 2. Wysterylizować olej mineralny (liquid petrolatum) w suchym gorącym powietrzu (170 C przez godzinę). 3. Posiać szczep na skosy agarowe. 4. Jeśli widoczny jest wzrost hodowli, dodać sterylny olej mineralny na wysokość około 1 cm ponad poziom agaru. 5. Konieczne przesiewy uzyskuje się przez zebranie hodowli spod warstwy oleju. 6. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przesiewać co 6 12 miesięcy. Przechowywanie hodowli w temperaturze pokojowej (stosowane tylko dla niewymagających bakterii, takich jak gronkowce i Enterobacteriaceae) 1. Przygotować probówki z wysokim słupkiem agaru, bez węglowodanu. Zalecany jest agar tryptozowo-sojowy (trawiony kazeiną agar sojowy). 2. Posiać szczepy wkłuwając je w agar. 3. Inkubować przez noc w temperaturze 35 C. 4. Zamknąć probówkę zakrętką lub korkiem. W celu uszczelnienia zanurzyć zakrętkę lub korek w płynnej parafinie. 5. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przesiewać raz w roku. 1 Morton H.E., Pulaski E.J.: The preservation of bacterial cultures. Journal of Bacteriology, 1938, 38: 163 183. 25

ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ BAKTERIOLOGICZNYCH Przechowywanie szczepów na agarze cysteinowo-tryptozowym (CTA) (dla Neisseria i paciorkowców) 1. Przygotować probówki zawierające podstawowe podłoże CTA. 2. Posiać wkłuwając bakterie w podłoże. 3. Inkubować przez noc w temperaturze 35 C. 4. Zamknąć probówkę zakrętką lub korkiem. W celu uszczelnienia zanurzyć zakrętkę lub korek w płynnej parafinie. 5. W przypadku Neisseria, przechowywać w temperaturze 35 C i przesiewać co 2 tygodnie. W przypadku paciorkowców, przechowywać w temperaturze pokojowej i przesiewać co miesiąc. Podłoża z wyciągiem mięsnym dla bakterii beztlenowych 1. Posiać szczepy. 2. Inkubować przez noc w temperaturze 35 C. 3. Zamknąć probówkę zakrętką lub korkiem. 4. Przechowywać w temperaturze pokojowej i przesiewać co 2 miesiące. Krótkoterminowe przechowywanie szczepów Hodowle szczepów kontrolnych, aktualnie wykorzystywane do badań rutynowych, mogą być przygotowywane w poniższy sposób. Szybko rosnące mikroorganizmy 1. Posiać na skos agarowy tryptozowo-sojowy w zakręcanych probówkach. 2. Inkubować przez noc w temperaturze 35 C. 3. Przechowywać w chłodziarce. Przesiewać co 2 tygodnie. Paciorkowce 1. Posiać na skos agarowy z krwią w zakręcanych probówkach. 2. Inkubować przez noc w temperaturze 35 C. 3. Przechowywać w chłodziarce. Przesiewać co 2 tygodnie. Meningokoki i Haemophilus 1. Posiać na skos lub płytkę z agarem czekoladowym. 2. Inkubować przez noc w temperaturze 35 C. 3. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przesiewać 2 razy w tygodniu. Gonokoki 1. Posiać na agar czekoladowy. 2. Inkubować przez noc w temperaturze 35 C. Przesiewać co 2 dni. 3. Zastępować szczepy kontrolne nowymi klinicznymi izolatami. 26

PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ Rola referencyjnych laboratoriów Poniższe rodzaje materiałów do badań powinny być przesyłane do regionalnych lub centralnych laboratoriów referencyjnych: materiały badane w kierunku rzadko izolowanych drobnoustrojów lub wymagające zastosowania wysoko specjalistycznych testów (np.: wirusologia, diagnostyka serologiczna chorób pasożytniczych); pojedyncze duplikaty materiałów do badań, w celu kontroli wydawanych przez laboratorium wyników; materiały wymagające w przyszłości badań potwierdzających, różnicujących, oznaczania grup bądź typów patogenów o dużym znaczeniu dla zdrowia publicznego (np.: Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Brucella, meningokoki i pneumokoki). Referencyjne laboratoria powinny dostarczać zestawy szczepów kontrolnych oraz, na potrzeby szkoleń, standardowe surowice i odczynniki używane w laboratorium referencyjnym. Jeśli laboratorium nie jest objęte programem zewnętrznej kontroli jakości, referencyjne laboratorium jest zobowiązane do przygotowywania ślepych, kodowanych próbek i hodowli, które służą do kontroli jakości pracy laboratorium w zakresie izolacji i hodowli. Zewnętrzna kontrola jakości W części tej omówiono elementy podlegające ocenie w programie zewnętrznej kontroli jakości (określanym jako,,program testowania biegłości ). Cele Celem programu kontroli jakości jest: zagwarantowanie lekarzom i społeczeństwu dobrej jakości diagnostyki laboratoryjnej; ocena i porównanie wiarygodności wyników laboratoryjnych w skali kraju; identyfikacja powszechnie popełnianych błędów; motywacja do przestrzegania ujednoliconych procedur; motywacja do używania standardowych odczynników; podjęcie czynności administracyjnych (łącznie z cofnięciem licencji) wobec laboratoriów nie spełniających standardów; motywacja do wprowadzenia wewnętrznych programów jakości. Zasady kontroli Zewnętrzna kontrola jakości polega na wysyłaniu kodowanych próbek do uczestniczących w niej laboratoriów. Powyższe próbki powinny być włączone do badań rutynowych, traktowane i badane dokładnie w ten sam sposób, jak próbki kliniczne. Kontrolę należy prowadzić zgodnie z poniższymi zaleceniami: powinna być przeprowadzana co najmniej 4 razy w roku; powinna obejmować co najmniej 3 próbki; czas na przygotowanie sprawozdania powinien być krótki, np. 2 tygodnie od otrzymania materiału do badań; 27