WSPÓŁCZESNE PROBLEMY CHEMII ANALITYCZNEJ I NIEORGANICZNEJ

WSPÓŁCZESNE PROBLEMY CHEMII ANALITYCZNEJ I NIEORGANICZNEJ OPTYMALIZACJA WARUNKÓW ZATĘŻANIA LOTNYCH ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH Z ZASTOSOWANIEM MIKROEKSTRAKCJI DO FAZY STACJONARNEJ Wprowadzenie Celem niniejszego ćwiczenia jest zapoznanie się z techniką mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (SPME) z fazy nadpowierzchniowej oraz zbadanie wpływu wybranych czynników na wydajność wydzielania substancji lotnych (BTEX benzen, toluen, etylobenzen, ksyleny) z wody techniką SPME. Metody wydzielania substancji lotnych z próbek wodnych dzielimy na: statyczne (polegające na analizie warstwy nadpowierzchniowej ustala się stan równowagi między fazą nadpowierzchniową i wodną w określonych warunkach), dynamiczne (wykorzystuje się przepływ gazu do całkowitego wyczerpania zawartości substancji oznaczanej w fazie ciekłej, a nie do stanu równowagi), SPME (mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej). Technika mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (SPME Solid Phase Microextraction) opracowana została przez Pawliszyna i jego współpracowników w 1987 roku, natomiast sprzęt do SPME został wprowadzony na rynek przez firmę Supelco w 1992 roku. Urządzenie do SPME jest rodzajem zmodyfikowanej mikrostrzykawki. Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej może być zastosowana zarówno do próbek ciekłych, jak i gazowych. W obu przypadkach zachodzi podział analitów między matryce próbki a fazę stacjonarną. Głównym elementem urządzenia do SPME jest włókno z naniesioną na nie fazą stacjonarną. Fazę stacjonarną o grubości od 7 m do 100 m stanowią najczęściej: ciekłe polimery, np. polidimetylosiloksan (PDMS) lub inne, stosowane w kolumnach kapilarnych, polimery stałe, np. poliakrylan (PA), kopolimery, np. styrenu z diwinylobenzenem (DVB), (w postaci mikrogranulek umieszczone w fazie stacjonarnej). Proces wydzielania analitów metodą mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej składa się z dwóch zasadniczych etapów: izolacji i wzbogacenia z próbki wodnej lub fazy gazowej do fazy stacjonarnej naniesionej na włókno,

uwolnieniu analitów poprzez desorpcję bezpośrednio do analizatora, którym najczęściej jest chromatograf gazowy (GC). Urządzenie do SPME przedstawiono schematycznie na rys.1. Głównym elementem przyrządu do SPME jest włókno kwarcowe pokryte fazą stacjonarną na długości 10 mm, a w przypadku włókien typu StableFlex na długości 20 mm. Włókno kwarcowe jest osadzone w rurce ze stali nierdzewnej. Rurka ta umieszczona jest w specjalnym uchwycie, który przypomina strzykawkę. Naciśnięcie tłoka powoduje wysunięcie włókna z igły. W obudowie uchwytu znajduje się wycięcie pozwalające na zablokowanie tłoka w pozycji wysuniętej. Po odblokowaniu tłoka powraca do położenie wyjściowego, dzięki czemu włókno chowa się ponownie w igle. W zależności od rodzaju włókna końcówka mocująca rurkę stalową ma różny kolor, który można łatwo sprawdzić przez otwór znajdujący się w obudowie przyrządu. W celu wykonania analizy za pomocą SPME igłą, w której schowane jest włókno, przebija się membranę zamykającą pojemnik z próbką. Następnie, przez naciśnięcie tłoka, włókno wysuwa się z igły i następnie jego kontakt z próbką ciekłą lub fazą gazową znajdującą się nad próbką. Organiczne anality sorbują się w fazie stacjonarnej znajdującej się na włóknie kwarcowym. Po określonym czasie, zależnym od rodzaju analitów, włókno ponownie chowa się w igle i cały przyrząd przenoszony jest do chromatografu gazowego. Jeśli wymagane jest przeniesienie strzykawki do innego laboratorium, to otwór w igle należy zamknąć (np. za pomocą fragmentu membrany chromatograficznej). Następnym etapem analizy jest termodesorpcja analitów z włókna. Odbywa się ona w następujący sposób: igła przyrządu wprowadzana jest przez membranę chromatograficzną do gorącego dozownika, następnie włókno jest z niej wysuwane i poddawane działaniu wysokiej temperatury. Powoduje to uwolnienie analitów zatrzymanych na fazie stacjonarnej i przeniesienie ich za pomocą gazu nośnego na kolumnę chromatograficzną, gdzie następuje ich rozdzielenie, a następnie oznaczenie ilościowe w detektorze. Na rys. 2 przedstawiono etapy desorpcji analitów w dozowniku chromatograficznym. Czas termodesorpcji uzależniony jest od rodzaju analitów, a temperatura termodesorpcji zależy od rodzaju pokrycia włókna. Po zakończeniu termodesorpcji i po schowaniu włókna do igły urządzenie zostaje wyciągnięte z dozownika i ponownie wykorzystane w procesie ekstrakcji. 2

Rys. 1. Schemat urządzenia do mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (1 - tłok, 2 obudowa, 3 śruba prowadząca, 4 wycięcie w obudowie, 6 prowadnica igły, ogranicznik głębokości, 7 sprężyna, 8 uszczelka, 9 igła, 10 rurka stalowa, 11 włókno kwarcowe pokryte fazą stacjonarną) Rys. 2. Etapy desorpcji analitów z włókna SPME w dozowniku chromatograficznym: a) przebicie igłą membrany dozownika, b) desorpcja termiczna analitów, c) ogniskowanie analitów na wlocie do kolumny chromatograficznej 3

Ekstrakcję analitów metodą SPME można prowadzić na dwa sposoby: DI (Direct Immersion) - SPME - umieszczenie włókna bezpośrednio z próbce gazowej lub względnie czystej próbce ciekłej. Takiego toku postępowania nie można stosować w odniesieniu do próbek stałych lub silnie zanieczyszczonych próbek ciekłych, HS (Headspace) - SPME - umieszczenie włókna w fazie nadpowierzchniowej. Lotne związki zazwyczaj z łatwością przechodzą do fazy nadpowierzchniowej, chyba że są silnie związane z martycą, jak np. niektóre próbki stałe. Związki o mniejszej lotności również przechodzą do fazy nadpowierzchniowej, ale proces ten może być długotrwały, co powoduje wydłużenie czasu osiągnięcia stanu równowagi. Oba te problemy można złagodzić przez podgrzewanie próbki. Wyższa temperatura ułatwia desorpcję analitów związanych z matrycą i przyspiesza transport analitów o małej lotności. Dodatkowo rośnie też stężenie analitów w fazie nadpowierzchniowej. Jednak ze wzrostem temperatury maleje wartość współczynnika podziału między fazę stacjonarną włókna a fazę nadpowierzchniową. Trzeba więc ustalić temperaturę optymalną, w której ilość wyekstrahowanego analitu jest największa. Parametry wpływające na wydzielanie w SPME: pokrycie włókna włókno w celu osiągnięcia dobrej selektywności i wydajności ekstrakcji analitów powinno charakteryzować się odpowiednimi właściwościami chemicznymi i fizycznymi. W pierwszym etapie wybór fazy stacjonarnej korzysta z zasady podobne rozpuszcza się w podobnym, czyli niepolarne anality są skuteczniej ekstrahowane do niepolarnego pokrycia włókna (PA), a polarne anality są ekstrahowane do polarnego pokrycia włókna (PDMS). Mieszane fazy są stosowane głównie do ekstrakcji bardzo lotnych związków. Wydajność ekstrakcji do takich włókien jest większa w porównaniu z PDMS, ale czas użytkowania generalnie krótszy. W tabeli 1 przedstawiono włókna dostępne w sprzedaży, ich własności i zastosowanie. 4

Tabela 1. Handlowo dostępne pokrycia włókien SPME: własności i zastosowania Pokrycie włókna Kolor włókna Grubość filmu [m] Polidimetylosiloksan (PDMS) Poliakrylan (PA) Polidimetylosiloksan- Diwinylobenzen (PDMS-DVB) Carboxen TM - Polidimetylosiloksan (CAR-PDMS) Carbowax @ - Diwinylobenzen (CW-DVB) Carbowax-Templated Resin (CW-TR) StableFlex TM Polidimetylosiloksan- Diwinylobenzen (PDMS-DVB) StableFlex TM Diwinylobenzen- Carboxen- Polidimetylosiloksan (DVB-CAR-PDMS) czerwone żółte zielone Zalecane użycie WŁÓKNA NIEPOLARNE 100 30 7 GC, HPLC GC, HPLC GC, HPLC Zastosowanie Niepolarne związki organiczne: lotne związki organiczne (ang. VOCs), wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (ang. PAHs; pl. WWA), benzen / toluen / etylobenzen / ksylen (BTEX), chloroorganiczne pestycydy WŁÓKNA POLARNE białe 85 GC, HPLC Polarne związki organiczne: tiazyny, fosfoorganiczne pestycydy, fenole WŁÓKNA MIESZANE niebieskie brązowe 65 60 GC HPLC Węglowodory aromatyczne, aromatyczne aminy, VOCs czarne 75 GC VOCs, węglowodory pomarańczowe 65 GC Polarne związki organiczne: alkohole, ketony, nitroaromatyczne związki purpurowe 50 HPLC Anionowe surfaktanty, aromatyczne aminy niebieskie 65 GC Węglowodory aromatyczne, aromatyczne aminy, VOCs szare 50/30 GC Szeroki zakres polarnych analitów Grubość warstwy fazy stacjonarnej jest niezmiernie ważna. Zastosowanie grubej warstwy fazy stacjonarnej powoduje, że układ znacznie dłużej osiąga stan równowagi. Należy wybrać włókno z najmniejszą grubością fazy stacjonarnej, która już zapewnia wymaganą czułość. W tabeli 2 przedstawiono właściwości i zakres zastosowania włókien o różnej grubości warstwy fazy stacjonarnej. 5

Tabela 2. Właściwości i zakres zastosowania włókien z grubym i cienkim filmem fazy stacjonarnej Gruby film Cienki film Ilość sorbowanego analitu większa mniejsza Właściwości skuteczna ekstrakcja związków o wysokiej temperaturze wrzenia z matrycy próbki. Zastosowanie szybkość desorpcji jest wówczas przedłużona i może być niecałkowita. w szczególności do lotnych związków, gdyż zapewniają przeniesienie ich do GC bez znacznych strat zapewniona szybka dyfuzja i łatwe uwalnianie związków o wyższej temperaturze wrzenia podczas desorpcji termicznej do izolacji i wzbogacania substancji o wysokiej temperaturze wrzenia W tabeli 3 umieszczone są, zalecane przez producenta, warunki kondycjonowania poszczególnych włókien w przypadku analizy metodą kapilarnej chromatografii gazowej. Tabela 3. Temperatura i warunki kondycjonowania włókien do SPME przy użyciu GC Faza stacjonarna Grubość filmu [m] PDMS 100 30 7 Maksymalna temperatura [ o C] 280 280 340 Zalecany zakres temperatur [ o C] 200-270 200-270 Temperatura kondycjonowania [ o C] 250 250 320 Czas kondycjonowania [h] 220-320 PDMS-DVB 65 270 200-270 260 0,5 PA 85 320 220-310 300 2 CAR-PDMS 75 320 240-300 280 1-2 CW-DVB 65 265 200-260 250 0,5 DVB-CAR-PDMS 50/30 270 230-270 270 1 0,5 0,5 1 mieszanie: najlepsze rezultaty daje mieszanie ultradźwiękowe, przy zastosowaniu mieszadła magnetycznego czas osiągnięcia stanu równowagi jest znacznie dłuższy, ułatwia dyfuzję składników z fazy ciekłej do fazy nadpowierzchniowej, polepsza dyfuzję przez powstającą wokół włókna cienką i nieruchomą warstewkę wody, stanowiącą barierę dyfuzyjną dla analitów i powodującą wydłużenie czasy osiągnięcia stanu równowagi, czas ekstrakcji najlepiej jeśli ekstrakcję prowadzi się do momentu osiągnięcia stanu równowagi pomiędzy próbką a fazą stacjonarną włókna, 6

temperatura może w dwojaki sposób wpływać na proces ekstrakcji (tabela 4): Tabela 4. Korzystne i negatywne aspekty podwyższonej temperatury ekstrakcji Korzystne o powoduje wzrost szybkości ekstrakcji przez wzmożoną dyfuzję analitów w kierunku włókna o pomaga przenieść anality do fazy nadpowierzchniowej (HS-SPME) o współczynnik dyfuzji w wodzie jest większy i czas ekstrakcji krótszy, ale współczynnik podziału włókno/próbka jest wówczas mniejszy o przyspiesza transport analitów o małej lotności Negatywne o zmniejsza wartość współczynnika podziału analitów (K fs ), ponieważ etap absorpcji jest procesem silnie egzotermicznym o dla termicznie niestabilnych związków tj. np. HMX podwyższona temperatura nie jest zalecana o zmniejsza wartość współczynnika podziału między fazą stacjonarną a fazą nadpowierzchniową wysalanie: przez dodanie soli wzrasta siła jonowa roztworu, co powoduje spadek rozpuszczalności wielu związków (przede wszystkim polarnych), a tym samym przesunięcie równowagi w kierunku fazy stacjonarnej, w przypadku związków niepolarnych wysalanie ma mały wpływ na wartość współczynnika podziału, efekt wysolenia zależy od rodzaju zastosowanej soli, wadą wysalania jest możliwość wprowadzania do badanej próbki dodatkowych zanieczyszczeń, jak również stopniowa degradacja fazy stacjonarnej osadzanej na włóknie mikropęknięcia powstające pod wpływem soli, gdy włókno zanurzone jest w badanym roztworze, zmiana ph w wyniku doboru odpowiedniego ph można cofnąć dysocjację wielu związków polarnych (np. fenoli), co powoduje, że stają się one mniej polarne i bardziej podatne na ekstrakcję przy użyciu słabo polarnej fazy stacjonarnej, objętość próbki Zakres materiału naukowego 1. Zasada mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (SPME). Budowa urządzenia do SPME. Etapy procedury SPME. Parametry wpływające na efektywność wydzielania związków w SPME. Rodzaje faz stacjonarnych stosowanych w analizie związków organicznych. 7

2. Połączenie SPME z technikami rozdzielczymi. 3. Schemat i zasada działania chromatografu gazowego. Obowiązująca literatura 1. Z. Witkiewicz, J. Kałużna-Czaplińska, Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych, WNT, Warszawa 2012. 2. J. Namieśnik, J. Jamrógiewicz, M. Pilarczyk, L. Torres, Przygotowanie próbek środowiskowych do analizy, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 2000. 3. J. Namieśnik, Z. Jamrógiewicz (red.), Fizykochemiczne metody kontroli zanieczyszczeń środowiska, WNT, Warszawa 1998. Aparatura i odczynniki 1. Chromatograf gazowy Agilent Technologies z detektorem MS i kolumną kapilarną typu HP-5MS (95% metylosilikon z 5% grup fenylowych) 30m x 0,25 mm, 25 m film fazy stacjonarnej, 2. Sprężone gazy: hel i powietrze, 3. Urządzenie do SPME i włókno do SPME z 100 m warstwą polidimetylosiloksanu (PDMS), 4. Mikrostrzykawka o poj. 10 μl, 5. Fiolki chromatograficzne o poj. 15 ml, kolby miarowe o poj. 250 ml, 6. Mieszanina wzorcowa BTEX (mieszanina benzenu, toluenu, etylobenzenu i p-ksylenu o stosunku objętościowym odpowiednio 7 : 3 : 2 : 2), 7. NaCl, KCl, KBr kwalifikacji cz.d.a., 8. Woda dejonizowana. Sposób wykonania Do 250 ml wody wodociągowej dodać 10 μl mieszanki BTEX. Z tak przygotowanego roztworu pobiera się objętość 8 ml i umieszcza się ją wraz z mieszadełkiem magnetycznym w naczyniu o pojemności 15 ml zawierającym NaCl. Wydzielanie substancji należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej w czasie 4 minut. Po zakończeniu każdego procesu mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej przeprowadza się analizę chromatograficzną przy użyciu aparatu HP 4890D z detektorem MS firmy Agilent Technologies w następujących warunkach: kolumna HP-5 (metylofenylosilikonowa): 30 m x 0,25 mm x 25 μm, analiza izotermiczna przy temperaturze kolumny 50 ºC, temperatura dozownika: 200ºC, 8

temperatura detektora: 250ºC, przepływ gazu nośnego 1mL/min, podział strumienia gazu nośnego 1:20, czas termodesorpcji równy czasowi analizy chromatograficznej: 10 min. Przeprowadzić następujące etapy optymalizacji warunków oznaczenia: A Wydzielanie substancji z roztworu badanego dla różnych warunków mieszania (bez mieszania oraz 500, 100 obr./min), przy niezmienionych pozostałych warunkach. B Dla wybranej intensywności mieszania przeprowadzić ekstrakcję, zmieniając jako parametr czas kontaktu włókna z fazą nadpowierzchniową (1 min, 4 min, 10 min). C Przeprowadzić wysalanie badanego roztworu poprzez dodatek NaCl, KCl, KBr w ilości 36 g na 100 ml roztworu badanego (każdą z soli należy dodawać pojedynczo do nowej porcji roztworu roboczego). D Ekstrahować substancje przy zmienionej objętości roztworu badanego (1, 5, 8 ml), zachowując pozostałe warunki. Opracowanie wyników Dla każdej z przeprowadzonych ekstrakcji podać warunki (czas pobierania próbki, intensywność mieszania, objętość próbki, dodatek soli) oraz otrzymane dla tych warunków czasy retencji t R i pola powierzchni pików analizowanych substancji. Określić wpływ intensywności mieszania, czasu pobierania próbki, dodatku soli, objętości fazy ciekłej na efektywność ekstrakcji. Przedstawić wykresy przedstawiające zależność pól powierzchni oznaczanych związków od poszczególnych wartości optymalizowanych parametrów. Przeprowadzić dyskusję otrzymanych wyników. 9

WSPÓŁCZESNE PROBLEMY CHEMII ANALITYCZNEJ I NIEORGANICZNEJ CHROMATOGRAFIA GAZOWA WPŁYW WARUNKÓW ANALIZY NA JAKOŚĆ ROZDZIELANIA ZWIĄZKÓW O RÓŻNEJ TEMPERATURZE WRZENIA Wprowadzenie Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z podstawowymi wielkościami charakteryzującymi analizę metodą chromatografii gazowej oraz poznanie wpływu warunków analizy na jakość rozdzielania analizowanych związków. Termin "chromatografia" opisuje wszystkie te metody rozdzielania mieszanin związków, w których poszczególne składniki mieszaniny ulegają podziałowi między dwie fazy stacjonarną i ruchomą, ze względu na różnice we właściwościach fizykochemicznych. Jeżeli mamy do czynienia z układem, w którym fazą ruchomą (mobilną) jest gaz, to mówimy o chromatografii gazowej (gas chromatography, GC). Możliwa jest chromatografia w układzie gaz ciało stałe (adsorpcyjna chromatografia gazowa, GSC) lub częściej stosowana chromatografia w układzie gaz ciecz (podziałowa chromatografia gazowa, GLC). W drugim przypadku rozdzielanie mieszanin na składniki jest uwarunkowane różnicami w powinowactwie poszczególnych związków do fazy stacjonarnej, co wyraża się różnicami w wartościach współczynnika podziału Kc. Chromatografia gazowa służy nie tylko do rozdzielania mieszanin, ale także do analizy ilościowej i w mniejszym stopniu, analizy jakościowej szerokiej gamy związków chemicznych. Każda analiza metodą chromatografii gazowej polega na selektywnym wymywaniu (elucji) związków z próbki wprowadzonej na kolumnę chromatograficzną za pomocą gazu nośnego. Poszczególne składniki są wykrywane przez detektor, którego sygnał jest rejestrowany za pomocą komputera, integratora bądź rejestratora. Uzyskany wykres zależności wskazań detektora od czasu nazywany jest chromatogramem. Parametry opisujące jakość rozdziału i sprawność kolumny Miarą skuteczności rozdzielenia składników mieszaniny jest: współczynnik selektywności α (retencja względna; zdolność fazy stacjonarnej do rozdzielenia dwóch składników) dla sygnałów związków A i B jest wyrażany wzorem: 10

zdolność rozdzielcza kolumny R S: gdzie: w A i w B oznaczają szerokości pików substancji A i B mierzone przy podstawie. Rozdzielczość zależy od wielu czynników aparaturowych. Znaczący wpływ ma temperatura analizy, co zostanie bliżej omówione w dalszej części instrukcji. Sprawność kolumny decyduje o tym, jaka będzie jakość uzyskanego chromatogramu. Wysoka sprawność objawia się ostrymi, wąskimi pikami substancji chromatografowanych i dobrym rozdzieleniem mieszaniny. Miarą sprawności kolumny chromatograficznej jest wysokość równoważna półce teoretycznej (WRPT). Półka teoretyczna objętość kolumny, w której osiągany jest stan równowagi między stężeniamisubstancji chromatografowanej w fazie ruchomej i stacjonarnej. Im więcej półek teoretycznych (mniejsza wartość WRPT) ma kolumna, tym większa jest jej sprawność. Każda kolumna składa się z N hipotetycznych półek teoretycznych, czyli: oraz: gdzie: L długość kolumny, H wysokość równoważna półce teoretycznej (WRPT). Liczbę półek teoretycznych można obliczyć, wykorzystując w tym celu substancję testową o współczynniku retencji k w zakresie 5-10, pod warunkiem, Ŝe pik tej substancji ma kształt krzywej Gaussa. Wtedy: lub: gdzie: t R czas retencji (wygodnie jest zastąpić go odległością retencji na wydruku chromatogramu), w 1/2 szerokość piku w połowie jego wysokości, w B szerokość piku przy podstawie. Analogicznie obliczamy efektywną liczbę półek teoretycznych, ale zamiast całkowitych czasów retencji używamy w tym celu czasów zredukowanych. Kolumny kapilarne osiągają wartości 4000-5000 półek teoretycznych na metr, co czyni je kilkukrotnie 11

bardziej sprawnymi od kolumn pakunkowych i wielokrotnie od kolumn do niskociśnieniowej chromatografii cieczowej. Czynniki wpływające na przebieg i jakość rozdziału Wysoka sprawność kolumny, objawiająca się małymi wartościami WRPT, decyduje w głównej mierze o tym, jak wyglądają piki analizowanych substancji. Im wyższa sprawność, tym piki węższe i ostrzejsze. Aby jednak dwie substancje rozdzieliły się w wystarczającym stopniu, wymagana jest również dostateczna selektywność na danej fazie stacjonarnej. Rys. 1 przedstawia chromatogramy uzyskane na kolumnie o tej samej sprawności, ale różnej selektywności fazy stacjonarnej wobec rozdzielanych składników. Rys. 1. Chromatogramy tych samych związków, uzyskane podczas analizy na fazie stacjonarnej o zbyt małej (z lewej) i wystarczającej (z prawej) selektywności [2]. Uzyskane chromatogramy wskazują, że w pierwszym przypadku rozdzielczość była zbyt niska. Przyjmuje się, że składniki są dobrze rozdzielone, gdy rozdzielczość jest nie mniejsza niż 1, natomiast rozdzielenie pików do linii podstawowej uzyskujemy przy R S=1,15. Zakładając żądaną rozdzielczość i uwzględniając parametry rozdzielania, możemy obliczyć ilość półek teoretycznych N (a zatem także długość kolumny), potrzebną do osiągnięcia założonej rozdzielczości: gdzie: zdolność rozdzielcza kolumny R S, α współczynnik selektywności, k współczynnik retencji. Znaczny wpływ na rozdział mieszaniny składników mogą mieć procesy zachodzące na powierzchni wewnętrznych ścianek kolumny, które zostały pozbawione warstwy ciekłej fazy stacjonarnej. Im dłuższy czas używania kolumny i bardziej drastyczne warunki analizy (wysoka temperatura), tym większe fragmenty ścianki kolumny mogą być odsłaniane. 12

Sprawia to, że związki o większej polarności (zawierające grupy hydroksylowe, aminowe czy karboksylowe) są adsorbowane na powierzchni ścianki kolumny. Na jakość rozdziału wpływają także inne czynniki aparaturowe, takie jak różnego rodzaju procesy dyfuzyjne występujące w dozowniku i w połączeniu kolumny z detektorem. Wszelkie przestrzenie, do których gaz nośny ma utrudniony dostęp oraz różnice w średnicach przekroju przewodów zwiększają wpływ tych efektów na jakość rozdziału. Wpływ temperatury na jakość rozdziału Temperatura analizy jest, obok rodzaju kolumny i fazy stacjonarnej, czynnikiem decydującym o jakości uzyskanych wyników. Wybór odpowiedniej temperatury kolumny zależy od temperatury wrzenia analizowanych związków oraz od zastosowanej fazy stacjonarnej. Należy pamiętać, aby sprawdzić limit temperatury dla kolumny, której użycie planujemy. Generalnie stosuje się temperatury nieco niższe niż maksymalne dopuszczalne. Temperatury analizy w chromatografii podziałowej są zwykle nieco niższe od temperatury wrzenia analizowanych substancji. Dobór sposobu analizy zależy w dużym stopniu od spodziewanych różnic w temperaturach wrzenia analizowanych związków. Możliwe są dwie podstawowe metody analizy: analiza w stałej temperaturze (w izotermie) gdy temperatury wrzenia poszczególnych składników nie różnią się o więcej niż kilkadziesiąt stopni Celsjusza, analiza w programowanej temperaturze, polegająca na podwyższaniu temperatury kolumny o stałą wartość, zwykle od 1 do 10 C na minutę; często na początku i końcu takiej analizy stosuje się izotermy (w temperaturze startowej oraz końcowej). W obu przypadkach, znalezienie optymalnych warunków analizy polega na znalezieniu "złotego środka" pomiędzy czasem analizy a jakością uzyskanego chromatogramu. Analiza w izotermie wymaga dobrego dopasowania temperatury procesu, aby zarówno czas analizy, jak i jakość uzyskanych wyników były zadowalające. Należy pamiętać, że wyższa temperatura pozwala skrócić czas analizy, ale pogarsza rozdzielczość. Niska temperatura z kolei pozwala na lepsze rozdzielenie składników mieszaniny, ale wydłuża czas analizy i powoduje poszerzenie i asymetryczność pików. W skrajnych przypadkach zbyt niska temperatura może nie pozwolić na elucję wszystkich składników, natomiast zbyt wysoka uniemożliwić rozdzielenie substancji, które będą eluowały prawie w tym samym czasie. W praktyce, dla mieszanin związków różniących się temperaturą wrzenia o około 100 C i więcej, znalezienie optymalnej temperatury analizy w izotermie często okazuje się niemożliwe. W takim przypadku, należy zastosować analizę w programowanej temperaturze. 13

Liniowy wzrost temperatury podczas analizy przynosi wiele korzyści. Po pierwsze możliwe jest rozpoczęcie chromatografowania od tak niskiej temperatury, że wszystkie związki zatrzymają się na początku kolumny i będą przez nią migrować wraz ze wzrostem temperatury. Dzięki temu unikamy stosowania zbyt wysokiej temperatury początkowej, powodującej słabe rozdzielenie składników mieszaniny o najniższych temperaturach wrzenia. Po drugie możemy tak dobrać szybkość wzrostu temperatury, że wszystkie składniki zostaną rozdzielone w zbliżony sposób i w rozsądnym czasie. Im szybszy wzrost temperatury, tym gorszy efekt rozdzielania i krótszy czas analizy. Do analizy dużej grupy związków o skrajnie różnych temperaturach wrzenia (a taki charakter mają często próbki naturalne), analiza w programowanej temperaturze jest jedynym możliwym wyborem, pozwalającym na zadowalające rozdzielenie wszystkich składników w rozsądnym czasie. Rys. 2. Chromatogramy mieszanin n-alkanów w: możliwie dobrze dobranej izotermie (a), w izotermie w zbyt wysokiej temperaturze (b) oraz w programie temperaturowym (c) [2]. Zakres materiału naukowego Retencja, selektywność, sprawność układu chromatograficznego. Czynniki wpływające na przebieg i jakość rozdzielenia mieszaniny związków. Zasady wyboru układu chromatograficznego i warunków chromatografowania. 14

Obowiązująca literatura 1. Z. Witkiewicz, J. Kałużna-Czaplińska, Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych, WNT, Warszawa 2012. 2. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 2005. Aparatura i odczynniki 1. Chromatograf gazowy Agilent Technologies z detektorem MS i kolumną kapilarną typu HP-5MS (95% metylosilikon z 5% grup fenylowych) 30m x 0,25 mm, 25 m film fazy stacjonarnej, 2. Sprężone gazy: hel i powietrze, 3. Mikrostrzykawka o poj. 10 μl, 4. Fiolki chromatograficzne o poj. 2 ml, 5. Roztwór wzorcowy w toluenie zawierający pięć n-alkanów C 12 C 16 o zbliżonych stężeniach (temperatury wrzenia badanych związków mieszczą się w granicach 215-287 c), 6. Heksan do mycia strzykawki Sposób wykonania Część I Wpływ temperatury na jakość rozdzielania Sprawdzić czy przez kolumnę przepływa gaz nośny, wykonując analizę około 1 L heksanu w izotermie, w 120 o C przez 5 minut. Wykonać analizę próbki badanej (po nie więcej niż 1 L) w izotermach: 100 o C, 120 o C, 140 o C oraz 160 o C. Następnie wykonać analizy próbki w programie temperaturowym 60-160 o C, przy naroście 3 o C/min, 5 o C/min oraz 8 o C/min. Wydrukować raport z analiz obejmujący m.in. takie wielkości jak czasy retencji i powierzchnie pików. Część II Wpływ prędkości przepływu gazu nośnego na sprawność kolumny W wybranych warunkach temperaturowych, ustalonych w I części ćwiczenia, przeprowadzić analizy próbki zmieniając prędkości przepływu gazu nośnego przez kolumnę. Analizy należy wykonać przy czterech prędkościach przepływu gazu nośnego: 0,5; 1; 2 i 3 ml/min nastrzykując 1 L kolumnę. Wydrukować chromatogramy uzyskane podczas analiz oraz raport obejmujący, między innymi takie wielkości jak czasy retencji i powierzchnie pików. 15

Opracowanie wyników 1. Oceń wyniki analiz przeprowadzonych w izotermie. W jakich warunkach analiza jest według Ciebie najlepsza i dlaczego? Weź pod uwagę czas analizy, uzyskany stopień rozdzielenia związków i kształt poszczególnych sygnałów (czy są symetryczne, czy różnią się kształtem i szerokością?). Jak wytłumaczysz poszerzenie sygnałów ostatnich badanych związków przy niższych temperaturach kolumny? Z czego wynikają różnice w wysokościach sygnałów? 2. Dla analiz w izotermie dla różnych temperatur oblicz współczynniki retencji k dla pierwszego i ostatniego z alkanów. Za zerowy czas retencji przyjmij maksimum sygnału rozpuszczalnika. 3. Dla analiz w każdej izotermie oblicz logarytmy zredukowanych czasów retencji alkanów i wykreśl ich zależność od liczby atomów węgla w cząsteczce. Czy przebieg funkcji jest prostoliniowy? Jaki zredukowany czas retencji miałyby w identycznych warunkach n-alkany C 9 i C 16? 4. Oceń wyniki analiz w programach temperaturowych. Czy są lepsze, czy gorsze od tych uzyskanych w izotermach? Czy kształt poszczególnych sygnałów różnią się od siebie? Jakie są czasy analizy? Jaki wpływ ma wielkość narostu na rozdzielenie składników? 5. Oblicz współczynniki retencji k dla pierwszego i ostatniego z alkanów dla wszystkich analiz w programach temperaturowych. 6. Spośród wszystkich wykonanych analiz wybierz jedną, która Twoim zdaniem dała najlepsze rezultaty. Weź pod uwagę czas analizy, kształt sygnałów, stopień rozdzielenia wszystkich związków. 7. Na podstawie analiz wykonanych przy różnych prędkościach przepływu gazu nośnego wykreślić wykres Van Deemtera, czyli wykres zależności wysokości równoważnej półce teoretycznej od prędkości przepływu gazu nośnego (WRPT=f(u)). Wyznaczyć optymalną prędkość przepływu gazu nośnego odpowiadającą minimalnej wartości WRPT. Wyznaczyć wartości stałych równania Van Deemtera. 16

WSPÓŁCZESNE PROBLEMY CHEMII ANALITYCZNEJ I NIEORGANICZNEJ ZASTOSOWANIE MIKROEKSTRAKCJI W UKŁADZIE CIECZ-CIECZ DO OZNACZANIA MIKROZANIECZYSZCZEŃ ORGANICZNYCH W PRÓBKACH ŚRODOWISKOWYCH Wprowadzenie Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z techniką mikroekstrakcji poprzez emulgację wspomaganą ultradźwiękami oraz z problemem oznaczania mikrozanieczyszczeń organicznych w złożonych matrycach jakimi są próbki środowiskowe. Mikroekstrakcja ciecz ciecz (ang. Liquid-Liquid Microextraction, LLME) jest odmianą ekstrakcji ciecz ciecz (ang. Liquid-Liquid Extraction, LLE), będącej jedną z najstarszych i najbardziej popularnych technik wykorzystywanych w przygotowaniu do analizy próbek środowiskowych. Teoretyczne podstawy ekstrakcji ciecz ciecz opisuje prawo podziału: C C 0 aq K c gdzie: K c współczynnik podziału, C 0 stężenie składnika w fazie organicznej, C aq stężenie składnika w fazie wodnej. Technika LLME w odróżnieniu od LLE wykorzystuje niewielkie ilości rozpuszczalników (od kilku do kilkudziesięciu mikrolitrów). Zarówno LLME jak i LLE, opiera się na równowagowym podziale składników między fazę wodną i niemieszającą się z nią fazę organiczną. Warunkiem równowagi dla takiego przypadku jest równość potencjałów chemicznych składnika w obu fazach. Osiągnięcie równowagi pomiędzy fazami może być uzyskane na drodze ręcznego wytrząsania, jak i mechanicznego mieszania. Coraz częściej do izolacji związków organicznych z próbek wodnych stosuje się nową technikę izolacji opracowaną w 2008 r., czyli mikroekstrakcję poprzez emulgację wspomaganą ultradźwiękami (ang. Ultrasound Assisted Emulsification Microextraction, USAEME). W metodzie tej niewielka ilość rozpuszczalnika organicznego wprowadzana jest do próbki wody. Taki układ przez kilka minut poddawany jest działaniu ultradźwięków, na skutek czego rozpuszczalnik organiczny ulega rozproszeniu na małe mikrokropelki i przenika do fazy wodnej. Zastosowanie ultradźwięków ułatwia zjawisko emulgacji i przyspiesza proces transferu związków pomiędzy dwoma niemieszającymi się fazami. To prowadzi do 17

wysokiej wydajności ekstrakcji w jak najkrótszym czasie. Mechanizm emulgowania stosowany w technice USAEME oparty jest na zjawisku kawitacji. Na skutek powstawania intensywnej fali uderzeniowej, ciecz nabiera dużej prędkości i wytwarzane są pęcherzyki. Taki mikrostrumień pęcherzyków może powodować zakłócenie kropli rozpuszczalnika, a tym samym poprawić proces emulgacji poprzez generowanie mniejszych kropelek fazy rozproszonej. W związku z tym powierzchnia kontaktu fazy wodnej i fazy organicznej znacznie wzrasta. Równowaga procesu ustala się już po niewielkim czasie trwania ekstrakcji w stanie emulsji. Kolejny etap procesu USAEME to odwirowanie, który powoduje rozdzielenie faz. Oddzieloną warstwę organiczną zbiera się za pomocą mikrostrzykawki. Stosowanie mikroilości rozpuszczalnika oraz izolacja za pomocą ultradźwięków zapewnia wysoką wydajność zagęszczania. Schemat procesu USAEME przedstawiono na rysunku 1: Rys. 1. Schemat zagęszczania techniką mikroekstrakcji poprzez emulgację wspomaganą ultradźwiękami [1] Modyfikacją zwykłej techniki USAEME jest mikroekstrakcja poprzez emulgację wspomagana ultradźwiękami przeprowadzona w strzykawce (ang. in-syringe USAEME). Schemat procesu USAEME w strzykawce przedstawiono na rysunku 2. W technice tej stosuje się rozpuszczalniki o gęstości mniejszej niż gęstość wody (np. toluen). Jako urządzenie ekstrakcyjne używana jest szklana strzykawka, zaś strzykawka chromatograficzna służy do wstrzykiwania rozpuszczalnika i odzyskiwania ekstrahenta. Na początku analit pobierany jest z naczynia do szklanej strzykawki (rys. 2. A). Dalej następuje usunięcie tłoka, uszczelnienie strzykawki i odwrócenie jej do góry nogami. Do tak przygotowanego naczynia ekstrakcyjnego wprowadzany jest rozpuszczalnik za pomocą strzykawki chromatograficznej (rys. 2. B). Po wstrzyknięciu emulgatora, urządzenie ekstrakcyjne zostaje uszczelnione i umieszczone w łaźni ultradźwiękowej (rys. 2. C). Po zakończeniu procesu emulgacji, próbka zostaje odwirowana w wyniku czego następuje rozdzielenie faz (rys. 2. D). [1] J. Namieśnik, Nowe rozwiązania metodyczne w zakresie przygotowania próbek do analizy chromatograficznej, prezentacja Power Point, Warszawa 2009, www.pg.gda.pl/chem/pl. 18

Urządzenie ekstrakcyjne zostaje przywrócone do pozycji wyjściowej, następuje usunięcie uszczelnienia oraz wstawienie tłoka. Dalej tłok strzykawki przesuwa się do góry, wtłaczając ekstrahent do skalowanej kapilary, gdzie następuje odczytanie jego objętości (rys. 2. E, F, G). Rys. 2. Schemat procesu USAEME w strzykawce [2] Inną modyfikacją techniki USAEME jest mikroekstrakcja rozpuszczalnikiem z kropli do kropli wspomagana ultradźwiękami (ang. Ultrasonic Assisted Drop-to-Drop Solvent Microextraction, USADDSME) (rys. 3). Jako naczynie ekstrakcyjne służy kapilara, w której znajduje się roztwór próbki a rozpuszczalnik wstrzykiwany jest w równych ilościach na różnych wysokościach próbki za pomocą strzykawki. Następnie taki układ poddawany jest działaniu ultradźwięków i odwirowywany. Zebrana faza organiczna poddawana jest analizie. Do przeprowadzenia tego typu ekstrakcji wymagana jest mała ilość próbki (5 L) [3]. Rys. 3. Schemat procedury USADDSME [3] [2] Y-S. Su, J-F. Jen, Determination of organophosphorous pesticides in water using in-syringe altrasound-assisted emulsification and gas chromatography with electron-capture detection, Journal of Chromatography A, 2010, 1217, 5043-5049. [3] M. Zhang, J. Huang, X. Zheng, L. Wu, Ultrasonic-assisted drop-to-drop solvent microextraction in a acapillary tube for analyzing trace benzene, toluene, xylene in one drop of a water sample, Chromatographia, 2010, 72, 1163-1168. 19

Na wydajność ekstrakcji USAEME ma wpływ kilka parametrów: 1. Rodzaj stosowanego rozpuszczalnika ma kluczowe znaczenie dla wydajności procesu ekstrakcji. Przy wyborze rozpuszczalnika bierze się pod uwagę rozpuszczalność w nim analitu oraz łatwość usunięcia go z ekstraktu. W technice USAEME właściwości fizykochemiczne rozpuszczalnika wpływają na zjawisko emulgacji, a w konsekwencji na efektywność ekstrakcji. Stosowany rozpuszczalnik organiczny powinien posiadać zdolność do tworzenia emulsji oraz charakteryzować się niską rozpuszczalnością w wodzie. Do izolacji z użyciem techniki USAEME stosowane były następujące rozpuszczalniki: chloroform (CHCl 3 ), czterochlorek węgla (CCl 4 ), 1,1,1-trichloroetan (C 2 H 3 Cl 3 ) oraz toluen, dekan, izooktan, heptan i 1-oktanol. Właściwości fizykochemiczne stosowanych rozpuszczalników przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1. Właściwości fizykochemiczne wybranych rozpuszczalników stosowanych w technice USAEME Rozpuszczalnik Gęstość w 20 o C Rozpuszczalność w (g/ml) wodzie w 20 o C (g/ml) Chloroform 1,48 0,008 Czterochlorek węgla 1,59 0,0008 1,1,1-Trichloroetan 1,34 0,0005 Toluen 0,87 0,00046 Dekan 0,73 0,00000002 Izooktan 0,69 0,0000014 Heptan 0,68 0,0000027 1-Oktanol 0,83 0,00042 2. Ilość rozpuszczalnika stosowanego do ekstrakcji ma wpływ na zatężanie analitu, im mniejsza objętość fazy organicznej, tym większe zatężenie analitu, co skutkuje obniżeniem granicy oznaczalności. Ponadto stosowanie jak najmniejszych ilości toksycznych rozpuszczalników jest zgodne z zasadami zielonej chemii. 3. Czas ekstrakcji jest to minimalny czas jaki jest potrzebny do równowagowego podziału analitu pomiędzy fazę organiczną a fazę wodną. Czas uzyskania równowagi to czas po którym ilość ekstrahowanych analitów pozostaje stała i równa ilości ekstrahowanej w nieskończenie długim czasie. W USAEME czas ekstrakcji zdefiniowany jest jako czas pomiędzy wstrzyknięciem rozpuszczalnika do próbki a zakończeniem procesu emulgacji. Wirowanie służy do rozbicia emulsji i przyspieszenia procesu rozdziału faz. Czas ekstrakcji podobnie jak czas i prędkość wirowania dobierany jest indywidualnie w 20

zależności od rodzaju oznaczanego analitu, jak i użytego rozpuszczalnika. Zazwyczaj czas ekstrakcji nie przekracza 15 minut a czas wirowania 5 minut przy prędkości 4000 obrotów/minutę. 4. Wartość ph próbki ma wpływ na skuteczność ekstrakcji w technikach takich jak LLE, SPE i SPME. Wynika to z faktu, że w roztworze o odpowiedniej kwasowości, analit występuje w neutralnej (molekularnej) formie, która ma większe powinowactwo do fazy hydrofobowej. 5. Przy wydzielaniu związków organicznych z roztworów wodnych korzystny wpływ ma efekt wysolenia. Rozpuszczalność wielu substancji organicznych w wodzie ulega znacznemu zmniejszeniu w obecności rozpuszczonych soli nieorganicznych. Ponadto dodanie soli do warstwy wodnej powoduje mniejszą rozpuszczalność rozpuszczalników organicznych w fazie wodnej, a tym samym mniejsze są straty fazy organicznej. W technice USAEME efekt wysolenia ma ujemny wpływu na wydajność ekstrakcji. Okazuje się, że średni wzrost siły jonowej, powoduje wzrost lepkości i gęstości roztworu. Tym samym promieniowanie ultradźwiękowe może być absorbowane a proces kawitacji cofnięty, w konsekwencji nie prowadząc do powstawania emulsji. Zakres materiału naukowego 1. Zasada mikroekstrakcji w układzie ciecz-ciecz. Etapy procedury USAEME. Modyfikacje techniki USAEME. Parametry wpływające na efektywność wydzielania związków techniką USAEME. Rodzaje rozpuszczalników stosowanych w technice USAEME. 2. Pojęcie derywatyzacji analitów. W jakim celu stosuje się derywatyzację analitów. Rodzaje derywatyzacji. 3. Związki endokrynnie czynne w środowisku. Obowiązująca literatura 1. J. Namieśnik, W. Chrzanowski, P. Szpinek, Nowe horyzonty i wyzwania w analityce i monitoringu środowiskowym, Wydawnictwo CEFAM, Gdańsk 2003. 2. J. Namieśnik, Z. Jamrógiewicz, M. Pilarczyk, L. Torres, Przygotowanie próbek środowiskowych do analizy, WNT, Warszawa 2000. 3. B. Kudłak, J. Namieśnik, Związki endokrynne w środowisku problemy i wyzwania, Analityka, 2008, 2, 42-46. 21

Aparatura i odczynniki 1. Chromatograf gazowy Agilent Technologies z detektorem MS i kolumną kapilarną typu HP-5MS (95% metylosilikon z 5% grup fenylowych) 30m x 0,25 mm, 25 m film fazy stacjonarnej, 2. Sprężone gazy: hel i powietrze, 3. Łaźnia ultradźwiękowa, 4. Wirówka laboratoryjna, 5. Probówki stożkowe, 6. Mikrostrzykawka o poj. 50, 100 μl, 7. Fiolki chromatograficzne o poj. 2 ml, wkładki chromatograficzne o poj. 150 L, 8. Kolba miarowa o poj. 50 ml, 9. Na 2 HPO 4 cz.d.a., 10. CHCl 3, 11. Bezwodnik octowy, 12. Woda dejonizowana Sposób wykonania Do kolby miarowej o objętości 50 ml wprowadzić 1 g Na 2 HPO 4 i uzupełnić do kreski badaną próbką. Do 3 probówek pobrać po 5 ml badanego roztworu, a następnie za pomocą mikrostrzykawki chromatograficznej dodać 70 L chloroformu oraz 50 L bezwodnika octowego. Tak przygotowany układ poddać działaniu ultradźwięków (moc 230 W, częstotliwość 42 khz) przez 5 minut. Po zakończeniu procesu emulgacji próbkę odwirować z użyciem wirówki laboratoryjnej z prędkością 4000 obrotów/minutę przez 7 minut. Następnie za pomocą strzykawki chromatograficznej o pojemności 50 L zebrać fazę organiczną i przenieść do fiolek chromatograficznych zawierających wkładki o pojemności 150 L. Poddać analizie GC-MS 1L zebranej fazy organicznej. Analizę chromatograficzną prowadzić przy użyciu aparatu GC-MS w następujących warunkach: kolumna HP-5 (metylofenylosilikonowa): 30 m x 0,25 mm x 25 μm, temperatura początkowa pieca 150ºC, narost 5ºC/min do temperatury 185ºC, narost 20ºC/min do temperatury 270ºC, temperatura dozownika: 250ºC, temperatura detektora: 250ºC, praca detektora w trybie SIM, 22

zakres skanowania m/z 40-600, odcinanie rozpuszczalnika: 3 min, przepływ gazu nośnego 1mL/min, bez podziału strumienia (splitless), czas analizy: 17,25 min Opracowanie wyników 1. W oparciu o uzyskane pola powierzchni oznaczanych analitów i krzywej wzorcowej obliczyć stężenia badanych związków. 2. Zamieścić chromatogram oznaczanych związków. 3. Skomentować otrzymane wyniki oraz trudności związane z oznaczaniem mikrozanieczyszczeń organicznych w próbkach środowiskowych. 4. Przedstawić wady i zalety techniki USAEME. 23