BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XLI, 2008, 4, str. 1007 1015 Helena Puzanowska-Tarasiewicz, Barbara Starczewska, Ludmiła Kuźmicka REAKTYWNE FORMY TLENU Zakład Chemii Ogólnej i Nieorganicznej Instytutu Chemii Uniwersytetu w Białymstoku Kierownik: prof. dr hab. H. Puzanowska-Tarasiewicz Hasła kluczowe: tlen, reaktywne formy tlenu, antyoksydanty. Key words: oxygen, reactive oxygen species, antioxidants. Tlen jest składnikiem powietrza (20,95% obj.), wody (89% mas.) i litosfery (47,3% mas.). Jako cząsteczka może występować w stanie singletowym i trypletowym. W stanie podstawowym występuje w formie trypletowej, gdyż ma dwa niesparowane elektrony. Wykazuje właściwości paramagnetyczne i zachowuje się jak miniaturowy magnes jest przyciągany przez pole magnetyczne. Tlen singletowy jest bardziej reaktywny od tlenu w stanie trypletowym. W celu wyjaśnienia dlaczego, należy dokonać analizy rozkładu elektronów na orbitalach molekularnych tlenu (ryc. 1). Ryc. 1. Rozkład elektronów na orbitalach molekularnych tlenu oraz w anionorodniku ponadtlenkowym (1). a tlen w stanie podstawowym trypletowy, określany symbolem 3 Σ g O 2 ; b, c dwie formy tlenu singletowego: jedna 1 Δ g O 2 i druga 1 + Σ g O 2 ; d anionorodnik ponadtlenkowy O 2. Strzałki symbolizują elektrony, a ich zwroty spiny elektronów. Fig. 1. Distribution of electrons on the molecular orbitals of oxygen and superoxide anion radical. a base state triplet oxygen 3 Σ g O 2 ; b, c two forms of singlet oxygen, 1 Δ g O 2 and 1 + Σ g O 2 ; d superoxide anion-radical O 2.Arrows represent electrons and arrowheads indicate electron spins.
1008 H. Puzanowska i inni Nr 4 Jak wynika z diagramu, tlen w stanie podstawowym (trypletowy, określany w spektroskopii symbolem 3 Σ g O 2 ) jest birodnikiem, natomiast jedna z form tlenu singletowego 1 g O 2 nie jest wolnym rodnikiem (ma dwa sparowane elektrony na * jednym orbitalu π ), druga zaś forma 1 + Σ g O 2 ma po jednym elektronie na każdym * 2p 2p z orbitali π. Aby cząsteczka tlenu w stanie trypletowym utleniła inną cząsteczkę i uległa dwuelektrodowej redukcji, musiałaby przyjąć od utlenianej cząsteczki dwa elektrony, przy tym oba te elektrony musiałyby mieć równoległe spiny i być skierowane przeciwnie w stosunku do spinów dwóch niesparowanych elektronów na orbitalach * 2p y * 2p z π, π. Wymaga to, aby utleniana cząsteczka była również w stanie trypletowym o co nie łatwo, gdyż stan podstawowy większości cząsteczek organicznych jest stanem singletowym. Tlen trypletowy ma więc trudności ze znalezieniem odpowiednich partnerów do reakcji dwuelektronowej i dlatego reaguje z wieloma związkami jednoelektronowo przyjmując od nich jeden elektron. Produktem tej reakcji jest anionorodnik ponadtlenkowy O 2 cząsteczka, która jest wolnym rodnikiem (posiada jeden niesparowany elektron) i anionem (ładunek ujemny spowodowany jest posiadaniem dodatkowego elektronu). Znacznie bardziej reaktywny jest tlen singletowy 1 O 2 powstający w wyniku wzbudzenia cząsteczek tlenu. Wymaga to dostarczenia energii wystarczającej na takie sparowanie elektronów w cząsteczce tlenu, aby spin wypadkowy cząsteczki wynosił zero (1). Wzbudzenie trypletowej cząsteczki tlenu do stanu singletowego może nastąpić w wyniku zaabsorbowania kwantu promieniowania nadfioletowego lub promieniowania o wyższej energii oraz niektórych reakcji chemicznych. Tlen singletowy oddziałuje z innymi cząsteczkami na dwa sposoby: przekazuje energię wzbudzenia cząsteczkom przechodząc w stan trypletowy, jest to tzw. gaszenie tlenu singletowego; wchodzi w reakcję chemiczną, np. z cholesterolem i tryptofanem. Najbardziej podatnymi na uszkodzenie przez tlen singletowy są reszty aminokwasowe białek histydyny, tryptofanu, metioniny i cysteiny oraz składniki kwasów nukleinowych - reszty purynowe, pirymidynowe i guanina (1). Pomimo, że tlen uszkadza składniki komórek, to bez tlenu nie ma życia. Tlen cząsteczkowy jest utleniaczem. Utlenia związki organiczne pobierając od nich elektrony, a sam ulega redukcji. Całkowita, czteroelektronowa redukcja cząsteczki tlenu (O 2 + 4 H + + 4 e 2 H 2 O) z wytworzeniem wody jest utrudniona. Wiadomo jednak, że większość związków organicznych, z którymi tlen mógłby reagować w komórkach, to związki w stanie singletowym, tzn. że spiny wszystkich elektronów w atomach tworzących cząsteczki uległy sparowaniu i wypadkowy spin każdej cząsteczki tych związków równy jest zeru. Woda, produkt redukcji tlenu, jest również cząsteczką w stanie singletowym. Tlen, nie mogąc znaleźć partnerów do reakcji czteroelektronowej, wstępuje na drogę reakcji jednoelektronowej, tworząc anionorodnik ponadtlenkowy: O 2 + e O 2 Przyłączenie kolejnego elektronu do anionorodnika ponadtlenkowego lub dwóch elektronów do cząsteczki tlenu co jest trudne ale możliwe, powoduje powstanie nadtlenku wodoru: O 2 + 2 H + + e H 2 O 2 O 2 + 2 H + + 2 e. Nadtlenek wodoru jest mniej reaktywny niż większość wolnych rodników, tj. atomów lub cząsteczek zdol-
Nr 4 Reaktywne formy tlenu 1009 nych do samodzielnego istnienia, mających jeden lub więcej niesparowanych elektronów. Jest on jednak bardziej reaktywny od tlenu cząsteczkowego O 2. Anionorodnik ponadtlenkowy, O 2, może w roztworze wodnym przyłączyć proton i utworzyć rodnik wodoronadtlenkowy: O 2 + H + HO 2 Produktem przyłączenia trzech elektronów do cząsteczki tlenu (co zachodzi na szczęście niezbyt łatwo) jest rodnik hydroksylowy OH jeden z najbardziej reaktywnych utleniaczy w układach biologicznych. Do zajścia reakcji anionorodnika ponadtlenkowego, nadtlenku wodoru i rodnika hydroksylowego nie jest istotne, aby partner był w stanie trypletowym. Wszystkie wymienione produkty redukcji i wzbudzenia tlenu są bardziej reaktywne niż cząsteczka tlenu w podstawowym stanie trypletowym. Z tego powodu określane są one różnie jako aktywne formy tlenu, reaktywne formy tlenu, czy reaktywne metabolity tlenu. Niektórzy autorzy proponują używanie zwrotu wolne rodniki tlenowe. Zwrot ten uwzględnia jedynie O 2 i OH, podczas gdy aktywnymi formami są H 2 O 2 (który nie jest rodnikiem) i tlen singletowy (1). Obok wymienionych powyżej reaktywnych form tlenu (RFT), będących główną przyczyną toksyczności tlenu, organizmy żywe mogą zetknąć się z pokrewnymi formami tlenu, np. alotropową odmianą tlenu ozonem O 3, czy związkami tworzącymi się w reakcjach metabolicznych: NO, NO 2, HONO 2, HOCl, HOBr, HOBr (2). Reakcje RFT z cząsteczkami organicznymi prowadzą do powstania wolnych rodników substancji organicznych: RO, ArO, ROO. Mogą to być rodniki, w których niesparowany elektron znajduje się na atomie węgla lub innego pierwiastka, np. azotu. Powstawanie reaktywnych form tlenu Reaktywne formy tlenu znajdują się w wodzie, powietrzu oraz mogą powstawać w organizmach żywych wskutek działania zewnętrznych czynników fizycznych, np. promieniowania jonizującego i nadfioletowego, ultradźwięków. Promieniowanie jonizujące powoduje jonizację oraz wzbudzenie cząsteczek wody (radiolizę) z wytworzeniem rodników hydroksylowych: H 2 O H 2 O + + e; H 2 O H 2 O * (wzbudzona cząsteczka); H 2 O * H + OH; H 2 O + + H 2 O H 3 O + + OH. W wyniku oddziaływania pomiędzy produktami radiolizy wody H i OH powstają m.in. cząsteczki wodoru H 2 i nadtlenku wodoru. Odpowiednio dobierając warunki napromieniowania, można stworzyć sytuacje, w których dominować będzie jeden typ RFT (1). Absorpcja promieniowania nadfioletowego przez cząsteczki prowadzi do wzbudzenia, jonizacji lub rozpadu cząsteczek. Podobnie wysoka temperatura i wyładowania atmosferyczne powodują rozpad cząsteczek tlenu na atomy, które reagując z innymi cząsteczkami tlenu, tworzą ozon O 3 : O 2 O + O; O + O 2 O 3. Ozon atmosferyczny, pojawiający się często jako składnik smogu spowijającego miasta, jest również reaktywną formą tlenu (bardziej reaktywny niż tlen trypletowy). W roztworach wodnych rozpada się, tworząc rodniki OH i HO 2 oraz H 2 O 2. Wdychanie ozonu niszcząco wpływa na nasze płuca i inne tkanki (m.in. serca, wątroby, mózgu) (3). Szereg związków określanych jako fotosensybilizatory (światłouczulacze) po zaabsorbowaniu kwantu światła może przechodzić w stan wzbudzony, tj. ze stanu singletowego w stan trypletowy i reagować z tlenem trypletowym. W wyniku reakcji wytwarza się anionorodnik ponadtlenkowy, np. w fotoredukcji ryboflawiny (1).
1010 H. Puzanowska i inni Nr 4 Nie tylko fotoredukcja prowadzi do wytwarzania anionorodnika ponadtlenkowego, ale także obecność zredukowanych form niskocząsteczkowych (RH 2 ) składników komórek, np. zredukowana ryboflawina, cukry o właściwościach redukujących (glukoza), związki tiolowe (cysteina, glutation): RH 2 + O 2 RH + H + + O 2 (1). Działanie na roztwory wodne ultradźwiękami, czyli tzw. sonikacja roztworów, prowadzi do powstawania w tych roztworach RFT. I tak w wyniku sonikacji, czyli sonolizy wody tworzą się atomy wodoru i rodniki OH. Rekombinacja rodników OH prowadzi do powstawania H 2 O 2. W roztworach wodnych, zawierających tlen, atomy wodoru reagują z O 2 tworząc HO 2. Sonikacja napowietrzonych roztworów wodnych prowadzi do powstawania NO (1, 4). Jednoelektronowemu utlenianiu mogą ulegać substancje obce dla organizmu (ksenobiotyki), które znajdują się w organizmie jako leki lub składniki pożywienia. Podobnie, jak w przypadku fotosensybilizatorów, ksenobiotyki ulegają w komórkach cyklicznej redukcji i cyklicznie reagują z tlenem (cykle redoks napędzane są jednak nie przez światło, lecz przez metabolizm komórki) (1). Ten ostatni problem nabiera znaczenia, jeśli weźmiemy pod uwagę trucizny stosowane do zwalczania szkodników, np.fungicydy, herbicydy, insektycydy. Mechanizm toksyczności wielu z tych związków polega na wytwarzaniu RFT. W organizmach żywych przebiegają również procesy utleniania białek oddechowych, tj. hemoglobiny i mioglobiny. Zarówno hemoglobina obecna w czerwonych krwinkach, jak i mioglobina występująca w mięśniach zawierają jako grupę prostetyczną hem. W grupach hemowych obecne są jony żelaza Fe 2+, które pod wpływem tlenu mogą się łatwo utleniać do jonów żelaza Fe 3+ : hem-fe 2+ + O 2 hem-fe 3+ + O 2. W przypadku hemoglobiny i mioglobiny jon Fe 2+ jest silnie związany z hemem białek oddechowych, dlatego jest mniej podatny na utlenianie, jednak może temu procesowi ulec. W krwinkach czerwonych człowieka w ciągu doby ok. 3% hemoglobiny ulega utlenieniu do methemoglobiny formy niezdolnej do przenoszenia O 2. Reakcja ta jest głównym źródłem O 2. Krwinki zawierają jednak enzym reduktazę methemoglobinową, który redukuje methemoglobinę do hemoglobiny (5). Źródłem O 2 w mięśniach jest utlenianie białka oddechowego mięśni - mioglobiny. W obecności donorów elektronów (D), np. azotanów(iii), aminofenoli może przebiegać dwuelektronowa redukcja O 2 związanego z hemoglobiną i powstawać H 2 O 2 : 2 H + hem Fe 2+ O 2 + D hem Fe 3+ + H 2 O 2 + D utl. (2). Źródłem O 2 i H 2 O 2 w komórkach są niektóre reakcje enzymatyczne, przebiegające np. z udziałem oksydazy ksantynowej. Enzym ten może redukować cząsteczkę tlenu zarówno jedno-, jak i dwuelektronowo w zależności od stężenia O 2 i ph roztworu. W komórkach możliwa jest także czteroelektronowa redukcja tlenu przebiegająca w mitochondriach w głównym miejscu komórki, w którym zużywany jest tlen. W zachodzącym w mitochondriach cyklu Krebsa dwuwęglowe reszty związane z koenzymem A (tj. acetylokoenzym A) utleniane są do CO 2 i H 2 O. Energia uwalniana podczas tego procesu wykorzystywana jest do syntezy ATP (6). Powstające RFT rozpadają się lub wchodzą w reakcje ze składnikami komórek (uszkadzają główne klasy składników komórek związki niskocząsteczkowe, białka, lipidy i kwasy nukleinowe) (1). W komórkach istnieje równowaga pomiędzy szybkością tworzenia RFT a szybkością ich zaniku.
Nr 4 Reaktywne formy tlenu 1011 Z rozważań wynika, że O 2 i H 2 O 2 są nieuniknionymi produktami ubocznymi wielu reakcji przebiegających w komórkach aerobowych. Znacznie bardziej reaktywny niż O 2 i H 2 O 2 jest rodnik hydroksylowy OH. Początkowo zakładano, że powstaje on w reakcji Habera-Weissa: O 2 + H 2 O 2 OH + OH + O 2 (7). Stwierdzono jednak, że w/w reakcja w warunkach zbliżonych do fizjologicznych nie ma praktycznego znaczenia. Obecnie przyjęta koncepcja zakłada istnienie cyklu dwóch reakcji: jedna z nich to reakcja Fentona (utlenianie Fe 2+ za pomocą H 2 O 2 ), druga reakcja regeneracji jonu Fe 2+ (2). Fe 2+ + H 2 O 2 OH + OH + Fe 3+ ; O 2 + Fe 3+ O 2 + Fe 2+ Sumując oba równania otrzymujemy reakcję Habera-Weissa katalizowaną przez jony żelaza (7): O 2 + H 2 O 2 OH + OH + O 2 Krótkie przypomnienie: rodnik hydroksylowy OH to zupełnie co innego niż anion wodorotlenkowy OH (OH to anion tworzący się w reakcji dysocjacji elektrolitycznej). Obecność jonów żelaza (Fe 2+ /Fe 3+ ) w bardzo małych stężeniach lub jonów miedzi (Cu + /Cu 2+ ) głównie związanych z białkami, a także innych metali przejściowych (manganu, chromu, kobaltu, niklu) jeszcze w niższych stężeniach niż jonów żelaza i miedzi może katalizować w/w reakcję (1). Jony metali przejściowych mają niesparowane elektrony w powłokach walencyjnych i dlatego można je uznać za wolne rodniki, np.: Fe 3+... 3d 5 2+ 9 Cu... 3d Niektóre jony metali przejściowych, jako niezbędne składniki komórek żywych, mogą występować na różnych stopniach utlenienia. Oznacza to możliwość ich utleniania w reakcji z tlenem lub H 2 O 2 i redukcji przez inne substancje, a tym samym katalizowania przez te jony reakcji prowadzących do powstania RFT. W podsumowaniu można stwierdzić, że część RFT to wolne rodniki, które charakteryzuje na ogół wysoka reaktywność. Dążąc do sparowania elektronów pozbycia się nadmiarowego elektronu lub przyłączenia elektronu do innej cząsteczki, zazwyczaj szybko wchodzą w reakcje z wieloma cząsteczkami. Działanie RFT w żywych organizmach Reaktywne formy tlenu znane są z dwojakiego działania w żywych organizmach. Z jednej strony są one potrzebne do prawidłowego funkcjonowania komórek, m.in. do regulacji procesów naprawczych w komórkach, ekspresji genów, regulacji metabolizmu, przekazywania sygnału mutagennego (8), ale mogą być również bardzo szkodliwe (2). Coraz więcej wyników badań świadczy o tym, że szlaki przewodnictwa wewnątrzkomórkowego są aktywowane przez zmiany równowagi redoks z udziałem RFT, np. ozonu, H 2 O 2. Wiadomo także, że działanie podwyższonych stężeń RFT jest przyczyną wielu chorób cywilizacyjnych, tak jak cukrzyca, miażdżyca uszkodzenie mięśnia sercowego lub mózgu (2). Przekroczenie określonych stężeń RFT w komórkach powoduje groźne dla organizmu konsekwencje i określane jest mianem stresu oksydacyjnego (9), który odpowiada za powstawanie wielu chorób.
1012 H. Puzanowska i inni Nr 4 Najczęściej badanym procesem, związanym ze skutkami zachodzenia w organizmie reakcji z RFT, jest peroksydacja lipidów. Przez peroksydację lipidów rozumiemy wolnorodnikowy proces utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych lub innych lipidów, w którym powstają nadtlenki tych związków (z ang. nadtlenek to peroxide). Peroksydacja lipidów, jak każdy proces wolnorodnikowy, składa się z trzech etapów: inicjacji, propagacji (prolongacji), terminacji. Inicjacja peroksydacji lipidów polega na oderwaniu atomu wodoru od cząsteczki wielonienasyconego kwasu tłuszczowego lub reszty takiego kwasu wchodzącego w skład fosfolipidu. Reakcja inicjacji przekształca cząsteczkę kwasu tłuszczowego w wolny rodnik alkilowy L, gdyż przy atomie węgla, który stracił atom wodoru, pozostaje niesparowany elektron. Do czynników odrywających wodór od wielonienasyconego kwasu tłuszczowego (L), inicjującego peroksydację lipidów należy zaliczyć rodnik hydroksylowy OH oraz rodniki: nadtlenkowy LOO, alkoksylowy LO, bądź alkilowy L substancji obecnych w komórce. Peroksydację lipidów mogą też inicjować: ozon, NO, NO 2, SO 2 oraz kationorodniki ferrylowy bądź nadferrylowy oraz kompleks Fe 2+ -O 2 -Fe 3+ (1). Należy zaznaczyć, że naturalnie występujące kwasy tłuszczowe nie zawierają sprzężonych wiązań podwójnych. Pojawienie się tych wiązań jest możliwe podczas procesu peroksydacji. Do wiązań podwójnych może przyłączać się ozon bądź tlen singletowy. In vivo procesowi peroksydacji ulegają przede wszystkim reszty wielonienasyconych kwasów tłuszczowych wchodzące w skład fosfolipidów, gdyż fosfolipidy są głównym składnikiem budulcowym błon komórkowych, a wolne kwasy tłuszczowe występują w błonach w bardzo małych ilościach. Przebieg procesu peroksydacji lipidów można przedstawić w trzech etapach (10): inicjacja: LH + O 2 L + HOO ; 2 LH + O 2 2 L + H 2 O 2 propagacja: L + O 2 LOO ; LOO + LH LOOH + L ; LOOH LO + OH terminacja: L + L L L ; L + LOO LOOL ; LOO + LOO LOOL + O 2 Wolne rodniki powstające w procesach peroksydacji lipidów mogą reagować z białkami. W rezultacie powstają wolne rodniki białek, które mogą uczestniczyć w reakcjach terminacji, tworząc mieszane połączenia białkowo-lipidowe. W procesie peroksydacji lipidów może wystąpić zjawisko reinicjacji polegające na tym, że nadtlenki lipidów (nierodnikowe produkty peroksydacji) mogą ulegać rozkładowi i prowadzić do ponownego powstania wolnych rodników. Rozpad taki inicjowany może być przez jony metali przejściowych, głównie jony żelaza i miedzi (1): LOOH + Fe 2+ LO + OH + Fe 3+ ; LOOH + Fe 3+ LOO + H + + Fe 2+ Dalsze przemiany produktów peroksydacji, zachodzące w wyniku reakcji β-eliminacji, prowadzą do rozpadu reszt wielonienasyconych kwasów tłuszczowych i powstania aldehydów (np. dialdehydu malonowego), hydroksyaldehydów i węglowodorów (np. etanu, pentanu). Im więcej wiązań podwójnych zawiera reszta kwasu tłuszczowego, tym łatwiej ulega ona peroksydacji. Optymalne parcjalne ciśnienie tlenu w tym procesie waha się w granicach 1 10 mm Hg. Wcale nie jest więc tak, że im więcej tlenu, tym szybsza peroksydacja lipidów (1). Przedstawiony powyżej opis peroksydacji lipidów to proces nieenzymatyczny. Powstawanie wielu ważnych biologicznie związków, np.prostaglandyn, trombok-
Nr 4 Reaktywne formy tlenu 1013 sanów czy leukotrienów z kwasu arachidonowego inicjowana jest przez reakcje peroksydacji. Reakcje te katalizowane są przez cykloksygenazę i lipoksygenazy enzymy katalizujące wbudowanie cząsteczki tlenu w określoną pozycję cząsteczki kwasu tłuszczowego, w wyniku czego powstają nadtlenki kwasów tłuszczowych (1). Produkty końcowe procesu peroksydacji lipidów, zwłaszcza aldehydy, są mniej reaktywne niż wolne rodniki. Reagują jednak z grupami tiolowymi białek oraz z resztami aminokwasów, np. lizylowymi, histydylowymi, arginylowymi, tyrozylowymi. Mogą zmieniać właściwości antygenowe białek, z którymi się łączą i hamować aktywność szeregu enzymów, co prowadzi m.in. do hamowania replikacji DNA (11). Produkty peroksydacji lipidów modyfikują także właściwości fizyczne błon komórkowych, osłabiają zależność pomiędzy transportem elektronów przez łańcuch oddechowy a syntezą ATP w mitochondriach. Reakcje reaktywnych form tlenu z białkami prowadzą do modyfikacji reszt aminokwasowych, modyfikacji grup prostetycznych (czyli nieaminokwasowych składników białek złożonych) oraz agregacji lub fragmentacji cząsteczek białkowych (1). Reakcja rodnika hydroksylowego OH z białkami (B) powoduje oderwanie atomu wodoru od cząsteczki białkowej. Niesparowany elektron zlokalizowany początkowo na atomie, od którego oderwany został wodór (B H + OH B + H 2 O) może ulegać przemieszczeniu w cząsteczce białka i umiejscowić się na jednej z reszt aminokwasowych, np. na resztach cysteiny (białko 1 Cys S + S Cys białko 2 białko 1 Cys S S Cys białko 2. Rekombinacja wolnych rodników białkowych prowadzi do powstania dimerów białkowych (1). Działanie promieniowania jonizującego na roztwory białek w warunkach tlenowych prowadzi z kolei do fragmentacji cząsteczek białkowych, napromieniowanie zaś w warunkach beztlenowych do agregacji. Szczególnie wrażliwe na uszkodzenia oksydacyjne są oprócz reszt cysteiny reszty metioniny, tyrozyny, argininy, tryptofanu, lizyny, proliny, histydyny, fenyloalaniny (np. utlenianie reszt metioniny niektórych białek prowadzi do utraty funkcji biologicznej białka) (11). Reakcje RFT z białkami powodują nie tylko utlenianie białek, ale także powstanie w białkach grup redukujących, zdolnych do redukcji cytochromu C i jonów metali. Reakcje z RFT mogą prowadzić do powstawania nadtlenków aminokwasów i białek oraz uszkodzeń zasad nukleinowych i kwasów nukleinowych. Kwasy nukleinowe są związkami bardziej stabilnymi niż białka i lipidy, odpowiadają bowiem za powielanie, przechowywanie i przekazywanie informacji genetycznej. Nadtlenek wodoru H 2 O 2 i anionorodnik ponadtlenkowy O 2 nie powodują uszkodzeń składników kwasów nukleinowych. Natomiast rodnik hydroksylowy OH może uszkodzić zasady nukleinowe, reszty cukrowe (np. deoksyrybozę w DNA, rybozę w RNA) lub rozerwać wiązania fosfodiestrowe łączące nukleotydy. Uszkodzenia te stara się organizm naprawić, gdyż DNA jest zbyt ważny, aby jego uszkodzenia pozostawić. Uszkodzone zasady są wycinane z DNA i w znacznej mierze nie metabolizowane dalej, lecz wydalane z komórek organizmu. Oceniono, że liczba uszkodzeń DNA przez endogenne RTF w przeciętnej komórce człowieka jest rzędu 10 4 na dobę (1). Reaktywne formy tlenu mogą uszkodzić cukrowce lub reszty sacharydowe białek, np. mukopolisacharyd kwas hialuronowy (istotny składnik mazi stawowej). Stwierdzono, że działanie RFT na roztwory kwasu hialuronowego powoduje rozry-
1014 H. Puzanowska i inni Nr 4 wanie wiązań glikozydowych pomiędzy monomerami, czyli depolimeryzację wielocukru, co prowadzi do zmniejszenia lepkości roztworów kwasu (nie pozostaje to bez znaczenia dla właściwego funkcjonowania stawów) (12). Obrona komórek przed RFT Organizmy żywe zawierają specjalne enzymy katalizujące rozkład anionorodnika ponadtlenkowego O 2 lub H 2 O 2. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) jest enzymem katalizującym reakcję dysmutacji (dysproporcjonowania) anionorodnika ponadtlenkowego: (O 2 + O 2 + 2 H + SOD H 2 O 2 + O 2 ), natomiast peroksydaza gluta- tionowa katalizuje reakcję pomiędzy glutationem (GSH) a H 2 O 2, w wyniku której powstaje utleniona forma glutationu, czyli disulfid glutationu (GSSG): 2 GSH + H 2 O 2 GSSG + 2 H 2 O (1). Enzym ten redukuje nie tylko H 2 O 2, ale także nadtlenki organiczne oraz znajdujące się w błonach komórkowych nadtlenki fosfolipidów. Peroksydaza glutationowa współdziała z reduktazą glutationową enzymem odtwarzającym zredukowaną formę glutationu. Podobnie S-transferazy glutationowe, które w odróżnieniu od peroksydazy glutationowej nie zawierają selenu, katalizują reakcje redukcji nadtlenków lipidów przez glutation (1). Reakcję dysproporcjonowania nadtlenku wodoru katalizuje enzym katalaza, natomiast metalotioneiny (białka) wiążą i detoksykują jony metali ciężkich, np. kadm, rtęć oraz magazynują takie metale niezbędne dla organizmu, jak cynk i miedź (12). W krwinkach zdrowego człowieka w ciągu doby około 3 % hemoglobiny ulega utlenieniu do methemoglobiny, nie mogącej przenosić tlenu. Reakcja ta jest głównym źródłem O 2 w tych komórkach (8). Gdyby nie enzym reduktaza methemo- globinowa, która redukuje methemoglobinę do hemoglobiny, po kilkunastu dniach większość hemoglobiny w krwinkach przeszłaby w niezdolną do przenoszenia O 2 methemoglobinę. Również białka hemowe mogą w pewnych warunkach i we współdziałaniu z niskocząsteczkowymi oksydantami bronić się przed RFT. Przykładowo hemoglobina i mioglobina hamują tworzenie rodnika OH w układzie zawierającym askorbinian, a to dzięki swej aktywności peroksydazowej. Reagują one z H 2 O 2 wykorzystując askorbinian w reakcji: askorbinian + H 2 O 2 dehydroaskorbinian + O 2 (1). Szereg białek enzymatycznych także chroni przed RFT. Katalizują one reakcje nie wytwarzające RFT, np. ceruloplazmina (białko zawierające miedź) zapobiega powstawaniu anionorodnika ponadtlenkowego O 2 ) (13). Poza enzymami rozkładającymi RFT w organizmie, szereg innych związków niskocząsteczkowych wykazuje właściwości antyoksydacyjne, np. kwas moczowy, cysteina, kreatynina. Również melaniny i melatoniny zdolne są do reakcji z wolnymi rodnikami (1). Przykładowo melatonina, rozpuszczalna w roztworach wodnych i lipidach, może pełnić funkcję antyoksydanta hydrofilowego, który chroni środowisko wodne komórki, jak i antyoksydanta hydrofobowego chroniącego wnętrze błon komórkowych. Peroksydację lipidów hamują z kolei składniki błon komórkowych, jak cholesterol, prowitamina D 3, witamina D 3, witamina D 2 (1). Również grupa tiolowa glutationu (GSH) powszechnego składnika bardzo różnych komórek naszego ciała łatwo reaguje z wolnymi rodnikami, najszybciej z rodnikiem hydroksylowym OH, wolniej z rodnikami organicznymi, w tym wolnymi rodnikami białek i innych makrocząsteczek (białko + GSH białko-h + GS ) (1). Za najistotniejszy
Nr 4 Reaktywne formy tlenu 1015 antyoksydant płynów komórkowych w organizmie uważa się kwas askorbinowy, czyli witaminę C. Jest on reaktywny wobec O 2, H 2 O 2, OH, tlenu singletowego i rodników nadtlenkowych (1). Fizjologicznym antyoksydantem hydrofobowym, chroniącym błony komórkowe jest witamina E, czyli α-tokoferol (14) oraz karotenoidy (zwłaszcza β-karoten), oksykaroteinoidy, bilirubina i produkt jej utlenienia biliwerdyna oraz koenzym Q (9). I tak np. β-karoten (K) jest efektywnym wygaszaczem tlenu singletowego oraz reaguje z wolnymi rodnikami organicznymi powstającymi w procesie peroksydacji lipidów: LOO + K LOO-K ; LOOK + LOO LOO-K-OOL. Właściwości antyoksydacyjne wykazują żeńskie hormony płciowe pochodne estronu i estradiolu oraz niektóre jony metali, np. selen, cynk (ten ostatni wypiera jony Fe 2+ i Cu 2+ z centrów wiążących w błonach komórkowych i DNA). Aktywność enzymów antyoksydacyjnych w krwinkach czerwonych i osoczu omówiono w pracy Winterbourna (5) oraz w monografii Bartosza (15). Podsumowując rozważania można stwierdzić, że wszystkie antyoksydanty zapobiegają niekontrolowanym, zwłaszcza wolnorodnikowym reakcjom utleniania przebiegającym w organizmie. H. Puzanowska-Tarasiewicz, B. Starczewska, L. Kuźmicka REACTIVE OXYGEN SPECIES PIŚMIENNICTWO 1. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wyd. Naukowe, PWN, Warszawa 2003. 2. Halliwell B., Gutteridge J.M.: Free radicals in biology and medicine. Oxford University, Press Oxford, New York, 1999. 3. Mudway I.S., Kelly F.J.: Ozone and the lungs a sensitive issue. Mol. Aspets Med. 2000; 21: 1-48. 4. Mark G., Schuchmann H.P., Sonntag C.: Formation of peroxynitrite by sonication of aerated water. J. Am. Chem. Soc., 2000; 122: 3781-3782. 5. Winterbourn C.C.: Oxidative reactions of hemoglobin. Methods Enzymol., 1990; 186; 265-272. 6. Cadenas E., Davies K.: Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic. Biol. Med., 2000; 29: 222-230. 7. Kehrer J.P.: The Haber Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology, 2000; 14: 43-50. 8. Dębski B., Milner J.A.: Molekularne mechanizmy przeciwnowotworowego działania czosnku; rola reaktywnych form tlenu. Bromat. Chem. Toksykol., 2007; 40: 223-228. 9. Valko M., Rhodes C.J., Moncol J., Izakovic M., Mazur M.: Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress induced cancer. Chem. Biol. Interact., 2006; 160: 1-40. 10. Gibka J.: Antyutleniacze w kosmetykach. Rynek Chem., 2001; 2: 42-45. 11. Stadman E.R., Levine R.L.: Protein oxidation. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2000; 899: 191-208. 12. Miles A.T., Hawksworth G.M., Beattie J.H., Rodilla V.: Induction, regulation, degradation, and biological significance of mammalian metallothioneins. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 2000: 35: 35-70. 13. Floris G., Medda R., Padiglia A., Musci G.: The physiopathological significance of ceruloplasmin. Biochem. Pharmacol. 2000; 60: 1735-1741. 14. Van Acker S.A., Koymans L.M., Bast A.: Molecular pharmacology of vitamin E: structural aspects of antioxidant activity. Free Radic. Biol. Med., 1993; 15: 311-328.- 15. Bartosz G.: Erytrocyty, W. Fizjologia krwi, red. Z. Dąbrowski, t. 2. 2000; Wyd. Naukowe PWN, Warszawa. Adres: 15-399 Białystok, ul. Hurtowa 1.