P R A C A O R Y G I N A L N A Acta Haematologica Polonica Original Article 2006, 37, Nr 1 str. 67 73 BEATA ZALEWSKA-SZEWCZYK, KRYSTYNA WYKA, WITALIJ ANDRZEJEWSKI, JERZY BODALSKI Wpływ wybranych leków przeciwnowotworowych na komórki śródbłonka u dzieci z chorobą nowotworową doniesienie wstępne The influence of chosen anticancer agents on endothetial cells in children with neoplasms pretitninary data Klinika Chorób Dzieci Katedry Pediatrii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med. Jerzy Bodalski SŁOWA KLUCZOWE: Śródbłonek - Chemioterapia - Dzieci KEY WORDS: Endothelium - Chemotherapy - Children STRESZCZENIE: Celem pracy była ocena wpływu wybranych leków przeciwnowotworowych na stan komórek śródbłonka. U 14 dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną i nieziarniczymi chloniakami złośliwymi oznaczono stężenie markerów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego przed i po zakończeniu 7-dniowej kuracji z użyciem prednizonu, a także bezpośrednio przed i po zakończeniu infuzji doksorubicyny i L-asparaginazy. Badano stężenie inhibitora aktywatora plazminogenu (PAI), tkankowego aktywatora plaztninogenu (tpa), czynnika von Willebranda (vwf) oraz endoteliny (ENA-1). W analizowanej grupie nie zaobserwowano istotnych różnic w stężeniu wymienionych markerów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego po zastosowaniu kuracji z prednizonem. Zanotowano nieznaczny wzrost stężenia PAI-1 i t-pa. Po zastosowaniu L-asparaginazy zanotowano obniżenie VWF, co wiązano z bezpośrednim wpływem L-asparaginazy na syntezę czynników krzepnięcia; stężenie pozostałych markerów nie wykazywało istotnych różnic. Po zastosowaniu daunorubicyny stwierdzono istotny wzrost stężenia VWF i endoteliny (średnie wartości odpowiednio 0,59 vs 1,77; 0,5 vs 0,9, p,0.02). Wstępna analiza wskazuje na prawdopodobieństwo bezpośredniego toksycznego działania doksorubicyny na komórki śródbłonka. SUMMARY: The aim of the study was evaluation of the influence of some anticancer drugs on endothelial cells. The concentration of endothelial injury markers i.e. the concentration of plasminogen activator inhibitor (PAI-1), plasminogen tissue activator (t-pa), von Willebrand factor (vwf) and endothelin (ENA-1), was estimated in 14 children with acute lymphoblastic Pracę zrealizowano w ramach prac własnych UM nr 502-11-175 [67]
68 B. ZALEWSKA-SZEWCZYK, K. WYKA, W. ANDRZEJEWSKI, J. BODALSKI leukemia or non-hodgkin lymphoma. The blood samples were collected at following timepoints: before and after one-week prednisone therapy, immediately before and after intravenous infusion of doxorubicin and L-asparaginase. There were no signiilcant differences in the concentration of those markers after prednisone therapy, only slight increase of PAI-1 and t-pa was noted. After L-asparaginase infusion a signiilcant decrease of vwf concentration was observed; there were no differences in the concentration of other markers. After doxorubicin infusion, we noted a significant increase of vwf and ENA-1 (mean values 0,59 vs 1,77 and 0,5 vs 0,9; p,0.02). Our observation indicates that doxorubicin may have a direct toxic effect on endothelial cells. Dzieci leczone z powodu chorób nowotworowych stanowią grupę zwiększonego ryzyka wystąpienia żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej. Etiopatogeneza zakrzepicy w tej grupie pacjentów jest wieloczynnikowa i nie do końca wyjaśniona. Na jej rozwój może wpływać zarówno obecność nowotworu, jak też i stosowane leczenie (8, 13). Dotychczasowe badania dotyczące tego problemu koncentrowały się głównie na zaburzeniach osoczowej składowej układu hemostazy. Mimo teoretycznych przesłanek oraz danych klinicznych niewiele wiadomo na temat udziału uszkodzenia śródbłonka naczyniowego w patogenezie procesu zakrzepowego, który może towarzyszyć samej chorobie nowotworowej i stosowaniu leków cytostatycznych. Celem pracy była ocena wpływu wybranych leków przeciwnowotworowych (glikokortykoidów, L-asparaginazy, antybiotyków antracyklinowych) na stan komórek układu śródbłonka u dzieci poddanych chemioterapii z powodu złośliwych nowotworów. MATERIAŁ I METODY Badania przeprowadzono u 14 dzieci (9 chłopców i 5 dziewczynek), średnia wieku 9,7. Jedenaścioro dzieci było leczonych z powodu ostrej białaczki limfoblastycznej, troje z powodu nieziarniczego chłoniaka złośliwego, T-komórkowego. W badanej grupie oznaczano stężenie markerów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego: czynnika von Willebranda (vwf), endoteliny (ENA-1), tkankowego aktywatora plazminogenu (t-pa) oraz inhibitora aktywatora plazminogenu (PAI-1). U badanych dzieci pobierano 4 ml krwi przed rozpoczęciem 7-dniowej fazy terapii z udziałem prednizonu oraz po jej zakończeniu, a także bezpośrednio przed i po zakończeniu 2-godzinnej infuzji L-asparaginazy oraz bezpośrednio przed i po zakończeniu 6-godzinnej infuzji doksorubicyny. Krew pobierano do probówek z dodatkiem antykoagulantu (2% EDTA), wirowano (2000 rpm/4 C), uzyskaną surowicę przechowywano w 70 C do momentu analizy. Oznaczenie wybranych markerów przeprowadzano za pomocą komercyjnych testów American Diagnostic, USA. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej przy pomocy programu Statistica. W analizie wykorzystano dokładny test Fishera oraz test znaków.
Wpływ wybranych leków przeciwnowotworowych na komórki śródblonka 69 WYNIKI W badanej grupie po zastosowaniu siedmiodniowej kuracji steroidowej zaobserwowano wzrost stężenia PAI-1 (p < 0,03) i t-pa (p < 0,02). Nie zanotowano istotnych zmian w stężeniu pozostałych parametrów. Po zakończeniu infuzji L- asparaginazy wystąpił spadek stężenia wszystkich badanych markerów, jednak tylko obniżenie stężenia vwf było istotne statystycznie (p < 0,0001). Po zakończeniu infuzji doksoubicyny stwierdzono wzrost stężenia vwf i endoteliny (p < 0,02). Uzyskane wyniki ilustrują ryciny 1 3. 140 22 120 18 0 80 14 60 40 6 20 2 0-20 PAI przed ENC PAI po ENC ±Odch. std. ±Błąd std. Średnia -2 vvvf przed ENC vwf po ENC 40 28 35 30 22 25 20 16 15 5 4 0-5 ENDOTELINA przed ENC ENDOTELINA po ENC -2 t-pa przed ENC t-pa po ENC Ryc. 1. Wybrane markery uszkodzenia śródbłonka naczyniowego w grupie badanej przed I po tygodniowej kuracji z prednizonem Fig. 1. Chosen markers of endothelium damage in the study group before and after one-week prednisone therapy
70 B. ZALEWSKA-SZEWCZYK, K. WYKA, W. ANDRZEJEWSKI, J. BODALSKI 160 22 140 18 120 14 0 80 6 60 2 ±Odch. std. 40 PAI przed ASP PAI po ASP ±Błąd std. Średnia -2 vwf przed ASP vwf po ASP 9 18 7 14 5 3 6 1 2-1 ENDOTELINA przed ASP ENDOTELINA po ASP -2 t-pa przed ASP t-pa po ASP Ryc. 2. Wybrane markery uszkodzenia śródbłonka naczyniowego w grupie badanej przed i po infuzji L-asparaginazy Fig. 2. Chosen markers of endothelium damage in the study group before and after L-asparaginase infusion 180 5,5 160 4,5 140 120 3,5 0 2,5 80 60 1,5 40 0,5 20 ±Odch. std. 0 PAI przed RUB PAI po RUB ±Błąd std. Średnia -0,5 vwf przed RUB vwf po RUB 2,8 220 2,2 180 140 1,6 0 1,0 60 0,4 20-0,2 ENDOTELINA przed RUB ENDOTELINA po RUB -20 t-pa przed RUB t-pa po RUB Ryc. 3. Wybrane markery uszkodzenia śródbłonka naczyniowego w grupie badanej przed i po daunorubicyny
Fig. 3. Chosen markers of endothelium damage in the study group before and after daunorubicin infusion
Wpływ wybranych leków przeciwnowotworowych na komórki śródbłonka 71 DYSKUSJA Zwiększone ryzyko wystąpienia choroby zakrzepowo-zatorowej u pacjentów z chorobą nowotworową wynika zarówno z samej choroby, jak również może być uwarunkowane innymi czynnikami, m.in. centralnym cewnikiem dożylnym, ciężką infekcją, unieruchomieniem, czynnikami genetycznymi (5, 7, 9, 13). Czynnikiem ryzyka może być również stosowana chemioterapia (4, 11). Z praktyki klinicznej wiadomo, że stosowanie leków cytotoksycznych drogą dożylną często wiąże się z miejscowym podrażnieniem naczynia, czego wyrazem jest miejscowy ból, zaczerwienienie skóry na przebiegu naczynia, może również prowadzić do zapalenia żyły {thrombophlebitis). Do objawów takich dochodzi nawet przy braku wynaczynienia leku poza światło naczynia. Szczególnie często takie niepożądane objawy są notowane po podaniu alkaloidów Vinca oraz po zastosowaniu antybiotyków antracyklinowych (6). Ściana naczyń krwionośnych jest czynnym biochemicznie narządem, biorącym udział w procesach krzepnięcia i fibrynolizy. W badaniach in vitro wykazano, że komórki śródbłonka syntetyzują i uwalniają do światła naczynia enzymy bezpośrednio biorące udział w procesach hemostazy, a zwłaszcza aktywatory fibrynolizy (t-pa i u-pa), inhibitory fibrynolizy (PAI), a także kofaktory uczestniczące w procesach krzepnięcia (2, 3). Należy podkreślić, że w przypadku przerwania ciągłości ściany naczynia uwalniany z podścieliska czynnik tkankowy TF odgrywa kluczową rolę w aktywacji kaskady krzepnięcia krwi (3). Stąd też powstaje pytanie, na ile leki cytotoksyczne po osiągnięciu światła naczynia wpływają na funkcję śródbłonka naczyniowego i czy może to mieć wpływ na rozwój powikłań zakrzepowych. Z uwagi na złożony charakter zaburzeń hemostazy u chorych z chorobą nowotworową, potwierdzenie takiego patomechanizmu jest niezwykle trudne. W badaniach własnych wnioskowano o stanie i funkcji śródbłonka naczyniowego na podstawie oceny stężenia wybranych parametrów układu fibrynolizy (tpa oraz PAI), a także markerów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego (czynnika vwf i endoteliny). Spośród wymienionych związków tpa, vwf oraz endotelina są substancjami w przeważającej mierze syntetyzowanymi przez komórki śródbłonka naczyniowego i najczęściej wykorzystywanymi w jego ocenie. Endotelina jest peptydem wpływającym na skurcz naczyń i powodującym wzrost ciśnienia tętniczego krwi. PAI również jest wytwarzany w śróbłonku, a zwiększenie jego stężenia wiąże się ze zwiększonym ryzykiem rozwoju zakrzepicy i choroby wieńcowej. Wzrost stężenia tych związków jest obserwowany w różnych sytuacjach klinicznych, np. zawale mięśnia sercowego, hiperglikemii i jest uważany za marker uszkodzenia struktury śródbłonka. W analizowanej grupie, po zastosowaniu wybranych leków o działaniu przeciwnowotworowym zaobserwowano zmiany w stężeniu markerów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego, choć w większości różnice te nie były istotne statystycznie. Po zastosowaniu tygodniowej kuracji glikokortykoidami zaobserwowano w grupie badanej niewielki wzrost stężenia tpa (p<0.02) i stężenia PAI-1 (p<0.03). Jednocześnie stwierdzono, że stężenie czynnika vwf uległo podwyższeniu, jednak zmiana ta nie była istotna statystycznie. Stężenie endoteliny nie uległo istotnej
72 B. ZALEWSKA-SZEWCZYK, K. WYKA, W. ANDRZEJEWSKI, J. BODALSKI zmianie po siedmiodniowej kuracji z zastosowaniem steroidów. Obserwacje powyższe mogą wskazywać, że stosowanie steroidów zaburzyło procesy fibrynolizy. Podejmując próbę interpretacji uzyskanych wyników po zastosowaniu terapii prednizonem, można zauważyć, że stosowanie steroidów może prowadzić do stanu prozakrzepowego, na skutek wzrostu stężenia inhibitora aktywatora plazminogenu, a także na skutek wzrostu stężenia vwf. Na podstawie uzyskanych danych trudno jednak wnioskować, czy stosowanie steroidów ma wpływ na stan śródbłonka naczyniowego. Po zastosowaniu L-asparaginazy zaobserwowano w grupie badanej obniżenie stężenia wszystkich badanych parametrów, jednak tylko w przypadku vwf zmiana ta była istotna statystycznie. L-asparaginaza jest enzymem, prowadzącym po dożylnym podaniu do natychmiastowej eliminacji z osocza i płynów ustrojowych aminokwasu L-asparaginy i tą drogą prowadzi do zahamowania biosyntezy białek. Po zastosowaniu L-asparaginazy notuje się zarówno obniżenie całkowitego stężenia albumin, jak w szczególności obniżenie produkowanych przez komórki wątrobowe czynników i inhibitorów osoczowego układu krzepnięcia. Nie można jednak jednoznacznie przesądzić, czy obserwowane zmiany w stężeniu badanych parametrów wynikały z wpływu leku na komórki śródbłonka, czy też z upośledzenia biosyntezy białek. Wydaje się jednak, że oprócz upośledzenia syntezy białek u podłoża tak głębokiego obniżenia stężenia vwf leży prawdopodobnie inny mechanizm. Czas połtrwania czynnika von Willebranda w osoczu wynosi ponad 16 godzin, a próbki krwi były pobierane bezpośrednio po zakończeniu dwugodzinnej infuzji leku (). W badaniach własnych wzbudzają zainteresowanie obserwacje dotyczące doksorubicyny. Po jej zastosowaniu zaobserwowano wzrost stężenia vwf, jak również endoteliny (p < 0.02). Być może obserwacja ta wskazuje na bezpośredni toksyczny wpływ antybiotyków antracyklinowych na integralność śródbłonka naczyniowego u pacjentów poddanych chemioterapii. W badaniach własnych nie zaobserwowano wpływu doksorubicyny na proces fibrynolizy. Zanotowano jedynie nieistotny statystycznie spadek stężenia PAI-1. Ze względu na niską liczebność grupy badanej wskazane są dalsze badania dotyczące tego zagadnienia. Z dotychczasowych doniesień wynika, że antracykliny mogą powodować retrakcję komórek śródbłonka, prowadząc do ekspozycji macierzy podśródbłonkowej, zwiększonej adhezji płytek i w konsekwencji do aktywacji krzepnięcia (12). U żadnego z obserwowanych pacjentów nie doszło do rozwoju klinicznie jawnej zakrzepicy. Nie znaczy to jednak, że obserwowane zaburzenia nie mają klinicznego znaczenia. Jak wynika z obserwacji innych autorów, zarówno obniżenie osoczowego tpa, jak i wzrost stężenia osoczowego PAI-1 może mieć udział w rozwoju zakrzepicy zależnej od cewników centralnych u małych dzieci, jak również przedłużać przebieg zakrzepicy u nastolatków (1). Zaobserwowano również, że u dzieci z bezobjawową hiperlipidemią dochodzi do osłabienia aktywności fibrynolitycznej na skutek upośledzonego uwalniania tpa z komórek śródbłonka. Zjawisko to skutkuje zwiększonym ryzykiem rozwoju chorób układu sercowo-naczyniowego we wczesnym wieku dorosłym (1).
PODSUMOWANIE Wpływ wybranych leków przeciwnowotworowych na komórki śródbłonka 73 W grupie badanej nie zaobserwowano wpływu glikokortykoidów i L-asparaginazy na stan komórek śródbłonka. Wstępna analiza pozwala przypuszczać, że antybiotyki antracyklinowe mogą wywierać bezpośredni toksyczny wpływ na komórki śródbłonka naczyniowego. Ze względu na niską liczebność grupy, wskazane są dalsze badania. PIŚMIENNICTWO 1. Albisetti M. The fibrinolytic system in children. Seminars Thromb Hemostasis 2003; 29: 339-347. 2. Albisetti M, Chan AKC, McCrindle BW, Wong D, Vegh P, Adams M, Monagle P, Andrew M. Fibrinolytic response to venous occlusion is decreased in patients after Kawasaki disease. Blood Coagulation and Fibrinolysis 2003; 14: 181-186. 3. Kopeć M, Łopaciuk S. Hemostaza fizjologiczna. W. Zakrzepy i zatory, Red. Łopaciuk S, Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa 2002; 19-52. 4. Kuenen BC, Levi M, Meijers JCM, van Hinsbergh ZWM, Berkhof J, Kakkar AK, Hoekman K, Pinedo HM. J Clin Oncol 2003; 21: 2192-2198 5. Lersch C, Kotowa W, Janssen D. Thromboembolieprophylaxe mit Dalteparin-Na (Fragmin.) bei onkologischen Patienten nach Port-Implantationen. TumorDiagn u Ther 2002; 23: 4-1. 6. Marę M, Maisano R, Caristi N, Adamo V, Altavilla G, Carboni R, Munao S, La Torre F. Venous damade prevention by defibrotide in vinorelbine-treated patients. Support Care Cancer 2003; 11: 593-596. 7. Nowak-Gottl U, Kosch A, Schlegel N, Salem M, Manco-Johnson M. Thromboembolism in children. Current opinion in Hematology, 2002; 9: 448-453 8. Van Ommen CH, Peters M. Venous thromboembolic disease in childhood. Seminars Thromb Hemost 2003; 29: 391-403. 9. Pihusch R, Danzl G, Scholz M, Harisch D, Pihusch M, Lohse P, Hiller E. Impact of thrombophilic gene mutation on thrombosis in patients with gastrointestinal carcinoma. Cancer 2002; 94: 3120 3126.. Scheja A, Akesson A, Geborek P, WUdt M, Wollheim CB, wollheim FA, Vischer UM. Von Willebrandt factor propeptide as a marker of disease activity in systemie selerosis. Arthritis Res 2001; 3: 178-182. 11. Sodhi A, Pai K: Increased produetion of interleukin-1 and tumor necrosis factor by human monocytes treated in vitro with cisplatin or other biological responce modifiers. Immunology Letters 1992; 34: 183-188. IZ Wojtukiewicz MZ. Zakrzepy a nowotwory. W: Zakrzepy i zatory. Red. Łopaciuk S., Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa 2002; 5-124. 13. Zalewska-Szewczyk B, Bodalski J. Zakrzepica u dzieci z chorobą nowotworową aktualny problem kliniczny Przegl Pediatr 2004; 34: 3/4 184-187. Praca wpłynęła do Redakcji 30..2005 r. i została zakwalifikowana do druku.012006 r. Adres Autorów: Beata Zalewska-Szewczyk Klinika Chorób Dzieci UM 91-738 Łódź ul. Sporna 36/50 tel. 0-42 617-77-91 fax. QA2 617-77-98 e-mail: bszewczyk@smrw.lodz.pl