Kraków 10.05.2016 Prof. dr hab. Maria Słomczyńska Zakład Endokrynologii Katedra Fizjologii Zwierząt Instytut Zoologii Uniwersytet Jagielloński OCENA rozprawy doktorskiej mgr. Piotra Kaczyńskiego Rola receptora PGF2α w interakcjach pomiędzy zarodkiem a endometrium podczas wczesnej ciąży u świni. Przedstawiona do recenzji praca składa się z dwóch oryginalnych publikacji eksperymentalnych opublikowanych w Theriogenology (2013) i w Reproduction (2016). Powyższe publikacje stanowią cykl powiązanych tematycznie badań, których celem było potwierdzenie hipotezy o roli prostaglandyny F2α i jej receptora w procesie implantacji i rozwoju wczesnej ciąży u świni. Opublikowane prace zostały załączone w formie pdf oraz full text, poprzedzone obszernym opracowaniem (36 stron) w języku polskim. W załączonych oświadczeniach współautorzy prac opisują zakres swojego uczestnictwa w opracowaniu koncepcji, wykonywaniu doświadczeń i przygotowaniu każdej z prac do druku. Matczyne rozpoznanie ciąży u zwierząt i ludzi to niezwykle interesujący okres decydujący o powodzeniu rozwoju embrionu i później płodu. Najnowsze doniesienia z laboratoriów w Stanach Zjednoczonych i w Wielkiej Brytanii, w których używano do badań 13 dniowych embrionów ludzkich wzbudziły ogromne zainteresowanie wśród naukowców zaangażowanych w szeroko rozumiane procesy biologii rozrodu. Nic więc dziwnego, że okres wczesnej ciąży, matczynego rozpoznania ciąży oraz implantacji został wybrany przez Doktoranta do przeprowadzenia badań
w ramach pracy doktorskiej. Co więcej, ten okres ciąży świni jest modelowy dla wielokierunkowych badań prowadzonych w Zakładzie Działania Hormonów Instytutu Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii Nauk w Olsztynie. W okresie matczynego rozpoznania ciąży oraz implantacji obserwowana jest wysoka zamieralność zarodków, sięgająca nawet 40%. Jednym z ważnych czynników regulujących prawidłowy proces rozrodczy (oprócz hormonów, cytokin, czynników wzrostu czy też mirna) są prostaglandyny. Prostaglandyna F2α uważana jest za czynnik inicjujący procesy regresji ciałka żółtego, a równocześnie w okresie implantacji jej zawartość w świetle macicy świni jest wyższa niż w odpowiadającym okresie cyklu rujowego, co uważa się za mechanizm ochronny przed luteolizą ciałka żółtego. Jednakże podwyższona synteza PGF2α przez endometrium w okresie rozpoczęcia implantacji zwróciły uwagę badaczy na inną potencjalną rolę tej prostaglandyny działającej przez specyficzne receptory we wczesnej ciąży u świni i innych zwierząt. Celem pracy stało się zatem przedstawienie nowej roli prostaglandyny F2α i jej receptora w interakcji endometrium macicy z zarodkami obecnymi w macicy. Badania prowadzone in vitro i in vivo miały potwierdzić postawiona hipotezę badawczą. Estrogeny wydzielane głównie przez zarodki oraz prostaglandyny i wymienione wcześniej czynniki, warunkują ustanowienie ciąży. Uważa się, że estrogeny zarodkowe zmieniają kierunek sekrecji PGF2α w macicy z endokrynnego (do naczyń) na egzokrynny (do światła macicy). Mechanizm przeciwprądowego przenikania ma swój udział w zwrotnym transferze PGF2α do światła macicy. Z drugiej strony, jak wykazano wcześniej, estradiol stymuluje ekspresję enzymów zaangażowanych w syntezę luteotropowej prostaglandyny E2. Opisane tu procesy skutkują zwiększeniem stosunku luteotropowej PGE2 do luteolitycznej PGF2α. Pozostaje więc do wyjaśnienia jaką rolę pełni wydzielana w okresie implantacji do światła macicy PGF2α, jaki udział w procesach związanych z rozwojem odgrywa jej receptor (PTGFR), jakie szlaki transdukcji sygnału zostają uruchomione i które geny,
uczestniczące we właściwym przygotowaniu błony śluzowej macicy do implantacji, wykazały zmianę ekspresji. Badania rozpoczęto od ustalenia zmian ekspresji genu i białka PTGFR w endometrium świni w wybranych dniach cyklu rujowego oraz w wybranych dniach ciąży. Następny krok stanowiły doświadczenia in vitro, gdzie izolowane endometrium w 11 dniu cyklu było materiałem do hodowli kokultur komórek epitelialnych i stromy. Medium uzyskane po hodowli zarodków z 11. i 15. dnia ciąży zawierało szereg czynników, które jak się okazało miały wpływ na zmianę ekspresji PTGFR w powierzchniowym endometrium. Doktorant zauważył, że blokowanie receptora estrogenowego hamowało wzrost ekspresji receptora PGF2α. Tak więc pośrednio potwierdzony został udział estradiolu w stymulacji ekspresji tego genu. W tym miejscu nasuwa się pytanie, czy badano skład chemiczny medium otrzymanego po inkubacji zarodków aby określić jakie związki oprócz estradiolu mogą się w nim znajdować? Badania prowadzone in vivo na modelu, w którym wykorzystuje się jednostronną ciążę, pozwoliły na wykazanie, że sygnały zarodkowe mogą być transportowane lokalnie lub systemowo przez krew i/lub limfę. Zastosowanie takiego właśnie modelu pozwala na wykazanie, które sygnały obserwowane w endometrium macicy pochodzą miejscowo od zarodka, a które mogą być transportowane do rogu izolowanego, w którym zarodki się nie rozwijały. Ten model, jak można zauważyć z licznych publikacji, jest stosowany z dużym powodzeniem w Zakładzie Mechanizmów Działania Hormonów PAN. W kolejnym doświadczeniu wykorzystano model, w którym do obydwu rogów macicy dokonywano infuzji hormonalnych mających naśladować sygnał zarodkowy. Wykazano, że estradiol podawany tylko do jednego rogu macicy, działając systemowo, stymulował ekspresję białka receptora PGF2α w endometrium pochodzącym z obu rogów. Nie obserwowano natomiast wpływu estradiolu na ekspresję genu PTGFR w badanym układzie doświadczalnym. Czy wiadomo dlaczego zmiany obserwowane były tylko na poziomie białka, a nie mrna?
Doktorant wykazał, że PGF2α stymuluje kinazy MAP, a te z kolei mają swój udział w zwiększeniu ekspresji, a następnie sekrecji czynnika VEGF. Stwierdzone zostało również, że zmiany w proliferacji komórek endotelialnych endometrium były regulowane przez szereg innych czynników badanych przez doktoranta. Media kondycjonowane po inkubacji skrawków endometrium z PGF2α zostały wykorzystane do badań z zastosowaniem linii komórkowych, gdzie użyto specyficznych inhibitorów/antagonistów pozwalających na sprecyzowanie roli jaką pełnią w proliferacji komórek szlaki sygnalizacyjne uruchamiane przez PGF2α. Ten fragment badań został podsumowany na bardzo dobrym schemacie zamieszczonym w publikacji w Reproduction. Cele pracy zostały jasno zdefiniowane, a zastosowana metodyka pozwoliła na realizację założeń pracy. Otrzymane wyniki przyczyniły się do wyjaśnienia nowej, nieznanej dotąd roli prostaglandyny F2α i jej receptora podczas wczesnej ciąży u świni. Rolą recenzenta jest nie tylko skupianie się na walorach recenzowanej pracy, lecz także wskazanie zauważonych niedociągnięć lub elementów wymagających wyjaśnienia. Nie mam właściwie, żadnych istotnych uwag do strony merytorycznej recenzowanej rozprawy. Dwie prace, opublikowane w czasopismach z Listy Filadelfijskiej ułatwiają zadanie recenzentowi. Otrzymane wyniki, ich wartość naukową potwierdzili również recenzenci akceptujący przyjecie prac do druku. Po przeczytaniu prac nie mam żadnych wątpliwości, że doktorant uzyskał nowe interesujące wyniki, które przynoszą ciekawe informacje dotyczące wpływu zarodka na ekspresję receptora PGF2α w endometrium świni, a także udziału PGF2α w ustanowieniu ciąży poprzez wpływ na ekspresję genów zaangażowanych w angiogenezę, remodeling tkanek i interakcję zarodekmatka. Jednakże Rozprawa doktorska, która składa się z kilu opublikowanych prac powinna być opatrzona stosunkowo krótkim wstępem oraz dyskusją komentująca otrzymane wyniki. Wszystkie pozostałe informacje są zawarte w załączonych
publikacjach i stanowią podstawę do oceny wartości naukowej rozprawy doktorskiej. Czytając rozdział Wyniki odsyłani jesteśmy ciągle do obu publikacji, w tym do Supplementary Materials, których z kolei opisy znajdują się jeszcze w innym, wcześniejszym fragmencie maszynopisu. To rozproszenie nie ułatwia z pewnością skoncentrowania się na czytaniu tekstu. Zastrzeżenie moje budzi używanie określenia receptor PTGFR, ponieważ stanowi to pewne powtórzenie. Prawidłową nomenklaturę stosowano natomiast w publikacjach, gdzie mowa była o receptorze PGF2α lub PTGFR. Przy tak skonstruowanej rozprawie doktorskie zabiegiem ułatwiającym ocenę pracy jest dobra korelacja między zaprezentowaniem zamierzeń do realizacji (rozdział Materiał i Metody) i otrzymanych wyników (rozdział Wyniki). Konsekwentna numeracja opisów doświadczeń i zastosowanych procedur znajduje odzwierciedlenie w organizacji rozdziału Wyniki, gdzie podobna numeracja dotyczy otrzymanych wyników. Wnioski ze zrealizowanych badań zamieszczone w Streszczeniu (str.5) nie są tożsame z tymi wnioskami, prezentowanymi w końcowej części opracowania (str.40). Za najważniejsze osiągnięcia pracy uznaję wykazanie, że: - zarodki i sygnały przez nie produkowane (estradiol) regulują ekspresje receptora PGF2α, pokazując że prostaglandyna F2α jest mediatorem sygnałów zarodkowych - procesy zachodzące podczas implantacji zarodka i rozwoju łożyska są kontrolowane przez czynnik VEGF, który z kolei na drodze auto- lub parakrynnej jest regulowany przez PGF2α - PGF2α stymuluje ekspresję genów, których udział jest rozważany w procesach przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej, procesu istotnego dla prawidłowej interakcji pomiędzy endometrium a rozwijającymi się zarodkami.