Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych nr 48, 2011 r. Hanna Lutnicka*, Agnieszka Ludwikowska* ZMIANY HISTOPATOLOGICZNE W NERCE TUŁOWIOWEJ KARPIA (CYPRINUS CARPIO L.) EKSPONOWANEGO NA WYBRANE PYRETROIDY HISTOPATHOLOGICAL CHANGES IN POSTERIOR KIDNEY OF CARP (CYPRINUS CARPIO L.) EXPOSED TO THE PYRETHROIDS Słowa kluczowe: karp, pyretroidy, nerka tułowiowa, zmiany histopatologiczne. Key worlds: carp, pyrethroids, posterior kidney, histopathological changes. Synthetic pyrethroids are the IV class of insecticides. They are neurotoxins. The main mechanism of their action is blocking the sodium ion channels (Na + ) in the central and peripheral nervous system of animals. They are a slight toxic to mammals and birds. But for water organisms they are very toxic. The aim of the study was to find out if they cause the pathological changes in posterior kidney of fish exposed to the pyrethroids cypermethrin and deltamethrin. The experiment was conducted in aquaria conditions, using river water, on carp (Cyprinus carpio L.), weighing 70 ± 10 g average. Cypermethrin and deltamethrin, as pure active substances, were added to the water only once, in subtoxic concentration: 0,02 µg l -1 for each. The exposure time was 2 weeks one group of fish was exposed to one pyrethroid. After it fish were transferred to river water without pyrethroids, for the next 4 weeks for a possible recovery. The recovery period was considered sufficient for eventual tissue regeneration process. Fish posterior kidneys were taken out twice: at the end of exposure and after the fourth-week convalescence period. Histological preparations were made using typical method for this procedure (Karnovsky method). Serial semithin cross sections were stained with a mixture of methylene blue and Azur II and used for light microscopy. * Dr. hab. lek. wet. Hanna Lutnicka, mgr Agnieszka Ludwikowska Katedra Hodowli Drobiu, Zwierząt Futerkowych i Zoohigieny, Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie, al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków; tel.: 12 662 41 09; 600 466 427; e-mail: aga.ludwikowska@onet.eu, lutnicka@op.pl 151
Hanna Lutnicka, Agnieszka Ludwikowska No histopathological changes were observed in posterior kidney of the control fish. In posterior kidney of the experimental fish most commonly observed: swelling of epithelial cells of renal tubules and their necrosis. The cells were swollen and so tubules lumen narrowing. Haematopoietic tissue proliferation process were observed between renal tubules after the exposure and convalescence time. 1. WPROWADZENIE Syntetyczne pyretroidy to czwarta, chronologicznie najmłodsza, grupa insektycydów. Została opracowana na bazie naturalnych pyretryn substancji o właściwościach insektobójczych, występujących w kwiatach chryzantemy Tanacetum cinerariaefolium [Różański 1992]. Związki syntetyczne cechuje duża fotostabilność i trwałość w środowisku. Pyretroidy odznaczają się bardzo dużą i selektywną skutecznością owadobójczą przy relatywnie małych dawkach użytkowych oraz brakiem zdolności do biokumulacji. Nie kumulują się też w środowisku naturalnym, w którym szybko ulegają biodegradacji [Łakota i in. 1990, Różański 1992]. Pyretroidy są neurotruciznami, a docelowym miejscem ich działania są bramkowane napięciem kanały sodowe (Na + ) błon komórek nerwowych centralnego i obwodowego układu nerwowego [Bradbury i Coats 1989, Coats 1990, Lund 1984, Vijverberg i van den Bercken 1990]. Związki te modulują kinetykę otwierania i zamykania kanałów, przytrzymując je w stanie otwarcia przez ekstremalnie długi czas (czasem przez kilkanaście sekund) i prowadząc do przedłużonej depolaryzacji błony. Trwały wpływ pyretroidów na przewodnictwo jonowe uniemożliwia przekazywanie impulsów w układzie nerwowym. Niezależnie od działania na układ nerwowy związki te wpływają na organizmy zwierząt na wiele innych sposobów, ponieważ łatwo przenikają przez błony komórkowe. Pyretroidy należą do związków o niskiej toksyczności dla ssaków i ptaków, natomiast wykazują bardzo silne działanie toksyczne w stosunku do organizmów wodnych, w tym i ryb [Bradbury i Coats 1989, Coats i in. 1989, Łakota i in. 1990, Łakota i in. 1987 1988]. Przenikają z wody poprzez nabłonek skrzeli do krwi ryb i za jej pośrednictwem roznoszone są po całym organizmie, a w pierwszej kolejności do mózgu. Jako substancje rozpuszczalne w lipidach znacznie szybciej pokonują barierę krew mózg w porównaniu z ssakami i wywołują znacznie większe efekty zatrucia [Eells i in. 1993]. Metabolizm pyretroidów odbywa się w wątrobie, jednak, ze względu na niską temperaturę wewnętrzną ciała, jest on u ryb znacznie spowolniony [Demoute 1989, Bradbury i Coats 1989, Coats i in. 1989, James 1994]. Jest to jedna z przyczyn silnej toksyczności tych związków dla ryb. Nerki są narządem wydalającym zmetabolizowane substancje toksyczne. Nerki ryb, poza funkcją wydalniczą, pełnią też rolę narządu krwiotwórczego. Elementy krwiotwórcze rozsiane są pomiędzy kanalikami wydalniczymi i razem z nimi reagują na zawarte w wodzie substancje toksyczne. 152
Zmiany histopatologiczne w nerce tułowiowej karpia (Cyprinus carpio L.)... 2. CEL BADAŃ Celem podjętych badań było poznanie wpływu subtoksycznego stężenia cypermetryny i deltametryny na strukturę nerki tułowiowej karpia. 3. MATERIAŁ I METODY Badania przeprowadzono w warunkach akwaryjnych. 100-litrowe akwaria napełniono wodą rzeczną średnio zanieczyszczoną o następujących parametrach fizyko-chemicznych: temperatura 17 19 C, ph 7,7, tlen rozpuszczony 10,5 mg O 2 l -1, BZT 5 ok. 2,2 mg O 2 l -1 i twardość ogólna 126 mg CaCO 3 l -1. Dodatkowo woda była napowietrzana i filtrowana za pomocą filtrów węglowych, aby usunąć uboczne produkty przemiany materii i resztki pokarmowe. Zastosowanie wody rzecznej miało na celu stworzenia rzeczywistych warunków narażenia na insektycydy, ponieważ adsorpcja pyretroidów na naturalnej zawiesinie organicznej wpływa na zmniejszenie ich toksyczności dla ryb [Hadfield i in. 1993, Wu i in. 1999]. W doświadczeniach zastosowano dwa obecnie stosowane w rolnictwie pyretroidy cypermetrynę ((1RS)-cis,trans-3-(2,2-dichlorowinylo)-2,2-dimetylocyklopropanokarboksylan (RS) α-cyjano-3-fenoksybenzylu) i deltametrynę ((1R,3R)-3-(2,2-dibromowinylo)-2,2- dimetylocyklopropanokarboksylan (S)-α-cyjano-3-fenoksybenzylu). Badane preparaty zastosowano w formie czystych substancji aktywnych (pochodzących z Promochem Sp. z o.o. w Warszawie), w subtoksycznych ich koncentracjach 0,02 µg l -1 każda. Podano je do wody jednorazowo, w formie rozpuszczonej w acetonie (ilość acetonu nie przekraczała 1% objętości próbki). Stężenia badanych substancji i czas ekspozycji wyznaczono na podstawie wyników badań dynamiki rozkładu i biodegradacji pyretroidów w modelowych wodach powierzchniowych [Lutnicka i in. 1999], w zalecanych przez Instytut Ochrony Roślin dawkach użytkowych oraz ze stopnia przenikania insektycydów do wód powierzchniowych, wynoszącego 0,085 0,85% stosowanej dawki, w zależności od związku i wielkości aplikacji [Crossland i in. 1982, Hill 1989, Taylor i Bogacka 1979]. Potwierdza to również poziom pyretroidów stwierdzany w wodach powierzchniowych po ich aplikacji na polach, wynoszący dziesiętne części mikrograma w litrze, a bezpośrednio po zastosowaniu jest wyższy rzędu mikrogramów w litrze [Crossland i in. 1982, Hill 1989, Muir 1985]. Do eksperymentu użyto narybku karpia (Cyprinus carpio L.) o masie ciała 70 ± 10 g. Ryby podzielono na 3 grupy: 2 doświadczalne i 1 kontrolną, po 10 sztuk każda. Po 2-tygodniowym okresie aklimatyzacji do warunków akwaryjnych ryby doświadczalne eksponowano przez 2 tygodnie na badane pyretroidy. Jedną grupę ryb eksponowano na jedną substancję aktywną. Po okresie narażenia karpie przeniesiono do wody rzecznej bez pyretroidów na kolejne 4 tygodnie w celu ewentualnej naprawy tkanek. W całym okresie badawczym nie notowano śnięcia ryb w grupach doświadczalnych i kontrolnej. 153
Hanna Lutnicka, Agnieszka Ludwikowska Wycinki nerki tułowiowej ryb doświadczalnych i kontrolnych pobrano dwukrotnie w ciągu okresu badawczego: po 2-tygodniowej ekspozycji i po 4-tygodniowej rekonwalescencji. Preparaty półcienkie (0,5 0,6 µm) do obserwacji w mikroskopie świetlnym przygotowano według standardowych metod skrawki narządu utrwalano według metody Karnovskyego, przepłukiwano 4x15 min w 0,1M buforze kakodylanowym, dokontrastowywano w 1-procentowym OsO 4, odwadniano w serii alkoholi o wzrastających stężeniach. Skrawki po przepojeniu w mieszaninie zawierającej tlenek propylenu i Epon 812 zatapiano w Epon 812. Barwiono je błękitem metylenowym i Azurem II i dokonano dokumentacji fotograficznej. 3. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Wyniki badań nad wpływem cypermetryny i deltametryny na nerkę tułowiową karpia przedstawiają fotografie 1 6. Wskazują one na szkodliwe oddziaływanie niskich stężeń zastosowanych pyretroidów na strukturę nerki tułowiowej karpia. Fot. 1. Nerka tułowiowa ryb kontrolnych. Widoczne kanaliki wydalnicze (Kw) i tkanka krwiotwórcza (Tk). 400x Phot. 1. Posterior kidney structure of control fish. Renal tubules (Kw) and haematopietic tissue (Tk). 400x 154
Zmiany histopatologiczne w nerce tułowiowej karpia (Cyprinus carpio L.)... Fot. 2. Nerka tułowiowa ryb eksponowanych przez 2 tygodnie na subtoksyczne stężenie cypermetryny. Zniszczona struktura kanalików (D) w sąsiedztwie tkanki krwiotwórczej. Zatarta struktura tkanki krwiotwórczej (Tk). 400x Phot. 2. Posterior kidney of fish exposed to subtoxic concentration of cypermethrin for two weeks. Structure disintegration of renal tubules (D) near haematopoietic tissue. Cloudy disintegration process of haematopoietic tissue (Tk). 400x Fot. 3. Nerka tułowiowa ryb eksponowanych przez 2 tygodnie na subtoksyczne stężenie deltametryny. Destrukcja kanalików nerkowych i ogniskowa martwica (Kw). Bardzo silny rozplem tkanki krwiotwórczej (Tk). 400x Phot. 3. Posterior kidney of fish exposed to subtoxic concentration of deltamethrin. Destroying of renal tubules and local necrosis process (Kw). Heavy proliferation process of haematopietic tissue (Tk). 400x 155
Hanna Lutnicka, Agnieszka Ludwikowska Fot. 4. Nerka tułowiowa ryb po 2-tygodniowym okresie ekspozycji na subtoksyczne stężenie cypermetryny i 4-tygodniowym okresie rekonwalescencji. Obrzmienie komórek nabłonka kanalików wydalniczych i ich destrukcja, zmniejszenie światła kanalików i obecność płynu w ich świetle (Kw). Rozplem tkanki krwiotwórczej (Tk). 400x Phot. 4. Posterior kidney of fish after exposure time to subtoxic concentration of cypermethrin and convalescence period. Swelling of epithelial cells of renal tubules and their destroying, narrowing of the tubular lumen. A fluid in the lumen of renal tubules were seen. Proliferation of haematopietic tissue (Tk). 400x Fot. 5. Nerka tułowiowa ryb po 2-tygodniowym okresie ekspozycji na subtoksyczne stężenie deltametryny i 4-tygodniowym okresie rekonwalescencji. Zniszczona struktura kanalików wydalniczych (Kw) pomiędzy tkanką krwiotwórczą, wakuolizacja ich cytoplazmy. Uszkodzony kłębuszek nerkowy (Kn). 400x Phot. 5. Posterior kidney of fish after the exposure time to subtoxic concentration of deltamethrin and after the convalescence period. Destroying of structure of renal tubules (Kw) between haematopietic tissue, vacuolization process in cytoplasm of epithelial cells of renal tubules. Damage of renal glomerulus (Kn). 400x 156
Zmiany histopatologiczne w nerce tułowiowej karpia (Cyprinus carpio L.)... Fot. 6. Nacieki leukocytarne (L) wokół kanalików nerkowych, zniszczona ich struktura i wakuolizacja cytoplazmy komórek nabłonka (W) u ryb eksponowanych na deltametrynę i po okresie rekonwalescencji. 400x Phot. 6. Posterior kidney of fish exposed to subtoxic concentration of deltamethrin and after convalescence period. Leukocytic infiltration around renal tubules (L), destroying of their structure and vacuolization of cytoplasm of endothelial cells (W). W nerkach ryb kontrolnych nie obserwowano zmian patologicznych (fot. 1). Natomiast u ryb eksponowanych na pyretroidy, pomimo subtoksycznej ich koncentracji, zmiany te były nasilone (fot. 2 6). Obserwowano obrzmienie komórek nabłonka kanalików wydalniczych, co powodowało zwężenie ich światła. W świetle kanalików najczęściej obecny był płyn (fot. 2 6). Struktura komórkowa kanalików nerkowych ryb doświadczalnych była często zniszczona, z ogniskową martwicą (fot. 3, 6). Rozplem tkanki krwiotwórczej obserwowano w nerkach ryb obu grup doświadczalnych (fot. 2, 3, 4, 6), jednakże proces był silniej wyrażony u ryb eksponowanych na deltametrynę (fot. 3). Obecne były też w tkance pojedyncze centra melano-makrofagowe. Rozplem tkanki przyczyniał się do rujnowania struktury kanalików w jej sąsiedztwie (fot. 2, 3, 5). Bardzo często, a zwłaszcza po okresie rekonwalescencji obserwowano wakuolizację cytoplazmy w komórkach nabłonka kanalików (fot. 6). Okres rekonwalescencji (4 tygodnie) był zbyt krótki na regenerację narządu. Zmiany histopatologiczne w nerkach ryb doświadczalnych po tym czasie często były jeszcze bardziej nasilone w stosunku do obserwowanych po okresie ekspozycji, a zwłaszcza w nerkach ryb narażonych na deltametrynę. Wokół kanalików nerkowych u tych ryb często formowały się nacieki leukocytarne (fot. 6), uszkodzeniu ulegały kłębuszki nerkowe wskutek przerwania ciągłości torebki Bowmana (fot. 5). Prawdopodobnie doszło do silnego rozszerzenia naczyń krwionośnych kłębuszka. Zmiany histopatologiczne podobne do opisanych obserwował Cengiz [2006] u karpia o masie ciała 59,8±0,62 g poddanego ostrej ekspozycji na deltametrynę w dawce 0,029 i 0,041 mg/lˉ1. Cengiz obserwował hipertrofię i zniszczenie komórek nabłonka kanalików 157
Hanna Lutnicka, Agnieszka Ludwikowska nerkowych i obecność w nich wakuoli, piknozę jąder w komórkach tkanki krwiotwórczej, poszerzenie naczyń kłębuszka. Światło kanalików było zwężone. Zmiany patologiczne obserwowane przez tego autora były bardziej nasilone w stosunku do w obserwacji własnych, co prawdopodobnie wynikało z zastosowania znacznie wyższego stężenia pyretroidu przy znacznie krótszym czasie ekspozycji (96 godzin). Badania El-Sayed i in. [2007] przeprowadzone na tilapii (Oreochromis niloticus L.) o masie ciała 90 ± 5 g, eksponowanej na subtoksyczne stężenie deltametryny (1,46 μg/l) przez 28 dni wykazały umiarkowaną hyperaktywność centrów melano-makrofagowych w nerce tułowiowej po tygodniowej ekspozycji. Podobnie w badaniach Velíšek i in. [2007] stwierdzono brak zmian histopatologicznych u pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) o masie ciała 309,18 ± 64,80 g, eksponowanego na deltametrynę w stężeniu 0,02 mg/l. Również badania Sepici-Dinçel i in. [2009] wykazały brak zmian patologicznych u karpia o masie ciała 100,9 ± 46,4 g eksponowanego na subletalne stężenie cyflutryny (10 μg/l) podczas 48-godzinnej i tygodniowej ekspozycji. Velmurugan i in. [2007] wykazali, że ekspozycja mrigala (Cirrhinus mrigala) jednego z gatunków indyjskiego major karpia o masie ciała 9,36 ± 0,56 g, na subtoksyczne stężenie lambda-cyhalotryny (0,3 i 0,6 ppb) przez 10 dni była przyczyną rozwoju nasilonych zmian patologicznych w nerkach. Autorzy obserwowali nekrozę komórek nabłonka i ich obrzmienie, zwężenie światła kanalików nerkowych, obkurczenie kłębuszków oraz obecność przestrzeni wewnątrz torebki Bowmana. Wydaje się, że rozbieżność wyników badań różnych autorów i własnych dotyczących zmian patologicznych rozwijających się w nerce tułowiowej ryb eksponowanych na pyretroidy może wynikać z kilku przyczyn. Po pierwsze, badania wykonywano na różnych gatunkach ryb i o różnej masie ciała. Im młodsze wiekowo ryby i o mniejszej masie ciała, tym większa na ogół ich wrażliwość na ksenobiotyki. Prawdopodobnie duża masa ciała pstrąga tęczowego w badaniach Velíšek i in. [2007] była przyczyną braku zmian patologicznych w nerce, pomimo większej wrażliwości ryb łososiowatych na substancje toksyczne w porównaniu z wrażliwością karpia. Po drugie, pyretroidy o różnej budowie chemicznej wykazują zróżnicowaną toksyczność dla ryb. Różne były też okresy ekspozycji i stosowane stężenia pyretroidów oraz warunki przeprowadzanych eksperymentów. Jednak należy zauważyć, że na ogół zmiany patologiczne, jeśli były obserwowane, miały podobny charakter i wyrażały się obrzmieniem komórek nabłonka kanalików, zwężeniem ich światła i ogniskową martwicą. Praca finansowana z grantu N N304 279440. Piśmiennictwo BRADBURY S. P., COATS J. R. 1989. Comparative toxicology of the pyrethroid insecticides. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 108: 134 159. 158
Zmiany histopatologiczne w nerce tułowiowej karpia (Cyprinus carpio L.)... CENGIZ E.I. 2006. Gil land kidney histopathology in the fressh water fish Cyprinus carpio after acute exposure to deltamethrin. Environ. Toxicol. Pharmacol. 22: 200 204. COATS J. R. 1990. Mechanisms of toxic action and structure-activity relationships for organochlorine and synthetic pyrethroid insecticides. Environ. Health Perspectives 87: 255 262. COATS J. R., SYMONIK D. M., BRADBURY S. P., DYER S. D., TIMSON L. K., ATCHISON G. J. 1989. Toxicology of synthetic pyrethroids in aquatic organisms: an overview. Environ. Toxicol. Chem. 8: 671 679. CROSSLAND N. O., SHIRES S. W., BENNETT D. 1982. Aquatic toxicology of cypermethrin. III. Fate and biological effects of spray drift deposits in fresh water adjacent to agricultural land. Aquatic Toxicol. 2: 253 270. EELLS J., RASMUSSEN j. l., BANDETTINI P. A., PROPP j. M. 1993. Differences in the neuroexcitatory actions of pyrethroid insecticides and sodium channel-specific neurotoxins in rat and trout brain synaptosomes. Toxicol. Appl. Pharmacol. 123: 107 119. EL-SAYED Y. S., SAAD T. T. 2007. Subacute intoxication of a Deltamethrin-based preparation (Butox 5% EC) in Monosex Nile Tilapia, Oreochromis niloticus L.. Basic & Clinical Pharmacol & Toxicol. 102: 293 299. DEMOUTE J. P. 1989. A brief review of the environmental fate and metabolism of pyrethroids. Pestic. Sci. 27: 375 385. HADFIELD S. T., SADLER J. K., BOLYGO E., HILL S., HILL I. R. 1993. Pyrethroid residues in sediment and water samples from mesocosm and farm pond studies of simulated accidental aquatic exposure. Pestic. Sci. 38: 283 294. HILL I. R. 1989. Aquatic organisms and pyrethroids. Pestic. Sci. 27: 429 465. JAMES M.O. 1994. Pesticide metabolism in aquatic organisms. Chem. Plant Protect. 9: 153 189 KARASU BENLI A. C., SELVI M., SARIKAYA R., ERKOÇ F., KOÇAK O. 2009. Acute toxicity of deltamethrin on Nile Tilapia (Oreochromis niloticus L.1758) larvae and fry. G. U. Journal of Science 22: 1 4. LUND A. E. 1984. Pyrethroid modification of sodium channel: current concepts. Pestic. Biochem. Physiol. 22: 161 168. LUTNICKA H, BOGACKA T., WOLSKA L. 1999. Degradation of pyrethroids in an aquatic ekosystem model. Wat. Res. 33: 3441 3446. ŁAKOTA S., KOŁODZIEJCZYK E., RASZKA A. 1990. Badania nad ubocznym działaniem pyretroidów na środowisko wodne. Pestycydy 4: 19 25. ŁAKOTA S., RASZKA A., UTRACKI T., CHMIEL Z. 1987-88. Wpływ toksyczny deltametryny i cypermetryny na wybrane organizmy wodne. Organika Prace Nauk. Inst. Przem. Org. 1987-88: 71 77. MUIR D. C. G., RAWN G.P., GRIFT N. P. 1985. Fate of the pyrethroid insecticide deltamethrin in small ponds: a mass balance study. J. Agric. Food Chem. 33: 603 609. 159
Hanna Lutnicka, Agnieszka Ludwikowska RÓŻAŃSKI L. 1992. Przemiany pestycydów w organizmach żywych. PWRiL, Warszawa. SEPICI-DINÇEL A., BENLI A. Ç. K., SELVI M., SARIKAYA R., SAHIN D., ÖZKUL I. A., ERKOÇ F.2009. Sublethal cyfluthrin toxicity to carp (Cyprinus carpio L.) fingerlings: biochemical, hematological, histopathological alternations. Ecotoxicol. Environ. Safety 72: 1433 1439. TAYLOR R., BOGACKA T. 1979. Transport of pesticides to thr sea by the Wistula river. Oceanology 11: 129 138. VELÍŠEK J., JURČÍKOVÁ J., DOBŠÍKOVÁ R., SVOBODOVÁ Z., PIAČKOVÁ V., MÁCHO- VÁ J., NOVOTNÝ L. 2007. Effects of deltamethrin on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Environ.Toxicol. Pharmacol. 23: 297 301. VELÍŠEK J., SVOBODOVÁ Z.,, MÁCHOVÁ J. 2009. Effects of bifenthrin on some haematological, biochemical and histopathological parameters of common carp (Cyprinus carpio L.). Fish Physiol. Biochem. 35: 583 590. VELMURUGAN B., SELVANAYAGAM M., CENGIZ E. I., UNLU E. 2007. Histopathology of lambda-cyhalothrin on tissue (gill, kidney, liver and intestine) of Cirrhinus mrigala. Environ. Toxicol. Pharmacol. 24: 286 291. VIJVERBERG H. P. M., VAN DEN BERCKEN 1990. Neurotoxicological effects and the mode of action of pyrethoid insecticides. Toxicology 105 126. WU W.Z., XU Y., SCHRAMM K. W., Kettrup A. 1999. Effect of natural humic material on bioavailability and acute toxicity of fenpropathrin to the grass carp, Ctenopharyngodon idellus. Ecotoxicol. Environ. Safety 42: 203 206. 160