Agnieszka Ludwikowska, Hanna Lutnicka ZMIANY HISTOPATOLOGICZNE W WĄTROBIE RYB EKSPONOWANYCH NA SUBTOKSYCZNE STĘŻENIE PYRETROIDÓW

Transkrypt

1 Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych nr 49, 2011 r. Agnieszka Ludwikowska*, Hanna Lutnicka* ZMIANY HISTOPATOLOGICZNE W WĄTROBIE RYB EKSPONOWANYCH NA SUBTOKSYCZNE STĘŻENIE PYRETROIDÓW HISTOPATHOLOGICAL CHANGES IN LIVER OF FISH EXPOSED TO THE SUBTOXIC CONCENTRATION OF THE PYRETHROIDS Słowa kluczowe: syntetyczne pyretroidy, ryby, wątroba, zmiany histopatologiczne. Key worlds: synthetic pyrethroids, fish, liver, histopathological changes. Synthetic pyrethroids, a group of insecticides, are potent neurotoxic substances. Their mechanism of action is blocking the membrane ion channels in the nervous system of animals. These compounds also affect non-target organisms including fish, and cause disturbances in functioning of their bodies. This study was aimed to investigate the effects of pyrethroids on liver of fish by observing the histopathological changes. The experiment was conducted in aquaria conditions, using river water, on carp (Cyprinus carpio L.), weighing 70 ± 10 g average. Cypermethrin and deltamethrin were added to the water only once, in subtoxic concentration: 0,02 µg l -1 for each. The exposure time was 2 weeks one group of fish was exposed for one active substance of the pyrethroids. After it fish were transferred to river water without pyrethroids, for the next 4 weeks for a possible recovery. The recovery period was considered sufficient for eventual tissue regeneration process. Fish liver was collected from experimental and control group and histological preparations were made. No histopathologial changes were observed in the liver of the control fish. In the liver of the experimental fish most commonly observed: loosening of hepatocyte structure (especially in the vicinity of blood vessels), congestion of tissue, fatty degeneration and focal necrosis. Recovery period was too short for complete regeneration of the organ. * Mgr Agnieszka Ludwikowska, dr hab. lek. wet. Hanna Lutnicka Katedra Hodowli Drobiu, Zwierząt Futerkowych i Zoohigieny, Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie, al. Mickiewicza 24/28, Kraków; tel ; ; aga.ludwikowska@onet.eu, lutnicka@op.pl 142

2 Zmiany histopatologiczne w wątrobie ryb eksponowanych na subtoksyczne stężenie pyretroidów 1. WPROWADZENIE Powszechne stosowanie pestycydów jest nieodłącznym elementem współczesnego rolnictwa. Najmłodsza chronologicznie klasa insektycydów, syntetyczne pyretroidy, wywodzą się z pyretryn naturalnych pyretroidów wyodrębnionych z kwiatów niektórych odmian chryzantem Tanacetum cinerariaefolium. Pod względem chemicznym są to estry kwasu chryzantemowego (3-(2,2-dimetylowinylo)-2,2dimetylocyklopropanokarboksylowego) albo halogenowych analogów tego kwasu i alkoholi pierwszorzędowych lub drugorzędowych, zawierających w cząsteczce przynajmniej jedno wiązanie podwójne. W odróżnieniu od naturalnych, syntetyczne pyretroidy charakteryzuje wyższa fotostabilność przy jednoczesnym zachowaniu właściwości bójczych [Casida 1980]. Środki te znalazły szerokie zastosowanie w ochronie roślin uprawnych i lasów, a także w przechowalnictwie produktów rolno-spożywczych. Tak szeroki zakres wykorzystania wynika z ich dużej aktywności insektobójczej przy zastosowaniu relatywnie małej dawki użytkowej oraz niskiej ich ceny. Pyretroidy nie są persystentne w środowisku. Co równie ważne, odznaczają się niską toksycznością dla organizmów stałocieplnych (ssaków), w których ulegają szybkiemu metabolizmowi. Nie wykazują także tendencji do biokumulacji [Casida 1980, Haya 1989, Mijamoto 1976]. Syntetyczne pyretroidy są silnymi neurotoksynami. Ich docelowym miejscem działania są bramkowane napięciem kanały Na + błon komórek nerwowych, które utrzymują w stanie otwartym przez ekstremalnie długi czas, prowadząc do przedłużonej depolaryzacji błony. U organizmów docelowych wywołują natychmiastowe zatrucie, dając efekt tzw. knock-down lub ich natychmiastową śmierć [Katsuda 1999]. Liczne badania potwierdzają, iż pyretroidy wykazują wysoką toksyczność w stosunku do organizmów wodnych, w tym ryb. Najczęściej dostają się do wód w wyniku spływów powierzchniowych i/lub przenikania z gleby do wód gruntowych, zwłaszcza w razie nadmiernego ich użycia oraz podczas wykonywania samolotowych oprysków pól uprawnych i lasów przy wietrznej pogodzie. Stosowane są także świadomie w celu zwalczania szkodliwych owadów występujących w pobliżu zbiorników wodnych, np. komarów [Dębski i Zalewski 1997]. Toksyczność pyretroidów w naturalnym środowisku wodnym jest znacznie niższa niż uzyskana w badaniach laboratoryjnych. Wynika to z silnych właściwości adsorpcyjnych tych związków na naturalnej zawiesinie organicznej oraz ich szybkiej fotodegradacji [Crossland i in. 1982, Hadfield i in. 1993]. Zatrucie ryb pyretroidami, w porównaniu z wyższymi kręgowcami, następuje już w bardzo niskich ich koncentracjach rzędu dziesiętnych części µg l -1 do kilkunastu µg l -1 [Bradbury i Coats 1989, Haya 1989, Karasu Benli i in. 2009, Şener Ural i Sağlam 2005, Wang i in. 2007]. Obserwuje się wtedy nieprawidłowe zachowanie behawioralne, przejawiające się niepokojem ryb, zwiększoną ruchliwością, utratą równowagi i zachowania ławicowego, oraz problemy z oddychaniem szybsze ruchy pokryw skrzelowych oraz dziubkowanie ryb [Borges i in. 2007, El-Sayed i in. 2007, Karasu Benli i in. 2009, Ra- 143

3 Agnieszka Ludwikowska, Hanna Lutnicka dhaiah, Rao 1990, Yilmaz i in. 2004]. Zatrucie syntetycznymi pyretroidami nie pozostaje bez wpływu także na fizjologię ryb. Dochodzi do zaburzenia parametrów hematologicznych czy biochemicznych, świadczących o wystąpieniu stresu chemicznego. Przedłużający się stan stresu prowadzi do rozwoju zmian histopatologicznych w narządach wewnętrznych ryb [El- Sayed i in. 2007, Svobodová i in. 2003, Velíšek i in. 2009]. 2. CEL BADAŃ, MATERIAŁ I METODY Analiza histologiczna tkanek jest jedną z metod oceny toksyczności związków chemicznych. Zmiany patologiczne w tkankach obserwowane są zwłaszcza przy ekspozycji chronicznej i subtoksycznych stężeniach substancji chemicznych. Celem pracy było poznanie wpływu wybranych pyretroidów na rozwój zmian histopatologicznych w wątrobie karpia. Badania zostały przeprowadzone w warunkach akwaryjnych. Akwaria o 100-litrowej pojemności napełniono wodą rzeczną, średnio zanieczyszczoną o następujących parametrach: temperatura C, ph 7,7, tlen rozpuszczony 10,5 mg O 2 l -1, BZT 5 ok. 2,2 mg O 2 l -1 i twardość ogólna 126 mg CaCO 3 l -1. Dodatkowo woda była napowietrzana i filtrowana za pomocą filtrów węglowych w celu usunięcia ubocznych produktów przemiany materii i resztek pokarmowych. Zastosowanie wody rzecznej miało na celu stworzenie rzeczywistych warunków narażenia ryb na insektycydy, ponieważ adsorpcja pyretroidów na znajdującej się w niej naturalnej zawiesinie organicznej wpływa na zmniejszenie ich biodostępności [Hadfield i in. 1993]. W doświadczeniach zastosowano dwa obecnie najczęściej stosowane w rolnictwie pyretroidy: 1) cypermetrynę (1RS)-cis,trans-3-(2,2-dichlorowinylo)-2, 2-dimetylocyklopropanokarboksylan (RS) α-cyjano-3-fenoksybenzylu; 2) deltametrynę (1R,3R)-3-(2,2-dibromowinylo)-2,2-dimetylocyklopropanokarboksylan (S)-α-cyjano-3-fenoksybenzylu. Badane preparaty zastosowano jako czyste substancje aktywne (pochodzące z Promochem Sp. z o.o. w Warszawie), w subtoksycznych ich koncentracjach 0,02 µg l -1 każdy. Czas ekspozycji ryb wynosił 2 tygodnie. Stężenie badanych substancji i czas ekspozycji wyznaczono na podstawie badań dynamiki rozkładu w modelowych wodach powierzchniowych, stosowanych dawek użytkowych oraz stopnia ich przenikania do wód [Lutnicka 2001]. Do eksperymentu użyto narybku karpia (Cyprinus carpio L.) o masie ciała 70 ± 10 g. Ryby podzielono na 3 grupy po 10 sztuk każda: 2 doświadczalne i 1 kontrolna. Po okresie aklimatyzacji (2 tygodnie) do warunków akwaryjnych, ryby doświadczalne eksponowano przez 2 tygodnie na badane pyretroidy jedną grupę ryb na jedną substancję aktywną. Po okresie ekspozycji karpie przeniesiono do wody rzecznej bez pyretroidów na kolejne 4 tygodnie w celu zbadania możliwości przywrócenia homeostazy organizmu. 144

4 Zmiany histopatologiczne w wątrobie ryb eksponowanych na subtoksyczne stężenie pyretroidów Wycinki wątrobo-trzustki ryb doświadczalnych i kontrolnych pobrano dwukrotnie w ciągu okresu badawczego: po 2-tygodniowej ekspozycji i po 4-tygodniowej rekonwalescencji. Preparaty półcienkie (0,5 0,6 µm) do badań w mikroskopie świetlnym przygotowano według standardowych metod (utrwalenie w glutaraldehydzie, odwodnienie w serii alkoholi o wzrastających stężeniach, zatapianie w żywicach epoksydowych). Wykonane preparaty barwiono roztworem błękitu metylowego i Azuru II. Następnie dokonano dokumentacji fotograficznej. 3. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Wątrobę ryb kontrolnych i doświadczalnych przedstawiono na fot Przeprowadzone badania wykazały szkodliwe działanie cypermetryny i deltametryny na wątrobę karpi. Obserwowano zniszczenie struktury beleczkowej i zrazikowej narządu. Wyraźnie doszło także do zatarcia struktury komórkowej, zwłaszcza w okolicy trzustki i dużych naczyń krwionośnych (fot. 2). Nieco dalej leżące hepatocyty wykazywały niedobarwliwość cytoplazmy, skupiającą się głównie w okolicy jądra komórkowego, pozostawiając resztę komórki pustą. W niektórych komórkach obecne były drobne krople tłuszczu (fot. 4). Narząd był znacznie przekrwiony w porównaniu z wątrobą ryb kontrolnych (fot. 1 i 4). Obserwowano miejscami występujący naciek leukocytarny i martwicę (fot. 3). Zmiany te były charakterystyczne zarówno dla cypermetryny, jak i deltametryny. Jednakże wydaje się, iż ekspozycja na deltametrynę spowodowała bardziej nasilone zmiany histopatologiczne w wątrobie karpia silniejsze przekrwienie oraz rozleglejsze zatarcie struktury beleczkowej, zrazikowej i komórkowej (fot. 6). Po 4-tygodniowym okresie rekonwalescencji obraz histologiczny wątroby był podobny do opisanego powyżej. Nie zaobserwowano wyraźnej regeneracji narządu (fot. 5-6). Fot. 1. Prawidłowe hepatocyty karpia. Azur II-Błękit metylenowy. 400x Phot. 1. Hepatocytes of control carp. Azure II-Methylene blue. 400x 145

5 Agnieszka Ludwikowska, Hanna Lutnicka Fot. 2. Wątroba karpia eksponowanego na subtoksyczne stężenie cypermetryny. Zatarcie struktury komórkowej w okolicy trzustki. Azur II-Błękit metylenowy. 300x Phot. 2. Liver tissue of carp exposed to subtoxic concentration of cypermethrin. Loosening of hepatocyte structure in the vicinity of pancreas. Azure II-Methylene blue. 300x Fot. 3. Wątroba karpia eksponowanego na subtoksyczne stężenie cypermetryny. Całkowite zatarcie struktury beleczkowej, zrazikowej i komórkowej (d), rozszerzenie sinusoidów (s) oraz zmiany martwicze (n). Azur II-Błękit metylenowy. 400x Phot. 3. Liver tissue of carp exposed to subtoxic concentration of cypermethrin. Destruction of trabecular, lobular and hepatocyte structure (d), dilatation of sinusoids (s) and necrosis (n). Azure II-Methylene blue. 400x 146

6 Zmiany histopatologiczne w wątrobie ryb eksponowanych na subtoksyczne stężenie pyretroidów Fot. 4. Wątroba karpia eksponowanego na subtoksyczne stężenie deltametryny. Stłuszczenie drobnobańkowe (f) i przekrwienie (c). Azur II-Błękit metylenowy. 300x Phot. 4. Liver tissue of carp exposed to subtoxic concentration of deltamethrin. Fatty degeneration small droplets of fat (f) and congestion (c). Azure II-Methylene blue. 300x Fot. 5. Wątroba karpia po 4-tygodniowej rekonwalescencji po ekspozycji na cypermetrynę. Różnobarwliwość narządu. Azur II-Błękit metylenowy. 300x Phot. 5. Liver tissue of carp after 4-week recovery period after exposure to cypermethrin. Anisochromia of the liver. Azure II-Methylene blue. 300x 147

7 Agnieszka Ludwikowska, Hanna Lutnicka Fot. 6. Wątroba karpia po 4-tygodniowej rekonwalescencji po ekspozycji na deltametrynę. Silne przekrwienie narządu i naciek leukocytów. Azur II-Błękit metylenowy. 300x Phot. 6. Liver tissue of carp after 4-week recovery period after exposure to deltamethrin. Potent congestion of the tissue and infiltration of leukocytes. Azure II-Methylene blue. 300x Zmiany w obrazie histologicznym wątroby w wyniku ekspozycji na różne pyretroidy zaobserwowało wielu autorów [Cengiz i Unlu 2006, Sarkar i in. 2005, Singh i Singh 2008, Velíšek i in. 2009, Velmurugan i in. 2007]. W wątrobie suma indyjskiego (Heteropneustes fossilis) po 45-dniowej ekspozycji na subtoksyczne stężenie cypermetryny obserwowano patologiczne zmiany nieprawidłowy kształt hepatocytów i ich hipertrofię, wzrost ilości komórek Kupffera, zaburzenia krążenia oraz stłuszczenie narządu. W komórkach wątroby doszło do silnej wakuolizacji i nekrozy [Singh i Singh 2008]. Podobnie procesy wakuolizacji cytoplazmy, piknozy jądra komórkowego i nekrozy obserwował u tego samego gatunku Joshi i in. [2007] po 60-dniowej ekspozycji suma indyjskiego na cypermetrynę. Autorzy sugerują, iż tak silny proces wakuolizacji jest wynikiem zaburzenia równowagi pomiędzy tempem syntezy i szybkością usuwania ksenobiotyków z organizmu ryb. Inne badania wyraźnie wskazują na relację pomiędzy dawką, czasem ekspozycji i wystąpieniem zmian patologicznych w wątrobie. Ekspozycja gambuzji pospolitej (Gambusia affinis) na subletalne dawki deltametryny (0,25 i 0,50 µg l -1 ) spowodowała: hipertrofię hepatocytów, wzrost ilości komórek Kupffera, zaburzenia krążenia, stłuszczenie i nekrozę ogniskową. Niektóre z tych zmian obserwowano również w badaniach własnych (fot. 3, 4 i 6). Jednakże w doświadczeniach Cengiza i Unlu [2007] stwierdzono rozwój zmian patomorfologicznych w czasie trwania ekspozycji. Wzrost ilości komórek Kupffera oraz zaburzenia w krążeniu pojawiły się już po 10-dniowej ekspozycji na powyższe stężenia. Natomiast zmiany takie, 148

8 Zmiany histopatologiczne w wątrobie ryb eksponowanych na subtoksyczne stężenie pyretroidów jak zwężenie sinusoidów, piknoza jądra komórkowego, nekroza i stłuszczenie obserwowano po 20- i 30-dniowej ekspozycji na wymienione stężenia deltametryny. Co więcej, zmiany te nasilały się wraz z wydłużeniem czasu ekspozycji i wzrostem stężenia [Cengiz i Unlu 2006]. Podobny, zależny od dawki efekt toksyczny zanotował Velmurugan i in. [2007] po ekspozycji mrigala (Cirrhinus mrigala) na subletalne stężenia lambda-cyhalotryny. W razie ostrej ekspozycji pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) ( g m. c.) na deltametrynę (0,02 mg l -1 ) nie stwierdzono zmian histologicznych w badanych narządach [Velíšek i in. 2007]. Jednakże ten sam autor, eksponując narybek karpia (15 20 g m. c.) na bifentrynę (6 µg l -1, 96 h), obserwował u 40% ryb doświadczalnych degenerację komórek wątroby, zwłaszcza w obrębie naczyń krwionośnych, a uszkodzone hepatocyty przejawiały piknozę jądra komórkowego i wakuolizację cytoplazmy [Velíšek i in. 2009]. Wątroba metabolizuje pyretroidy znacznie szybciej u ssaków w porównaniu z rybami, co spowodowane jest wyższą temperaturą ciała zwierząt stałocieplnych. W wątrobie królików eksponowanych przewlekle na pyretroidy stwierdzono zmiany podobne do występujących u ryb. Obserwowano m.in. obkurczenie hepatocytów, powiększenie komórek Kupffera, rozszerzenie naczyń krwionośnych, kondensację jądra komórkowego, a miejscami nekrozę i zmiany nowotworowe [Shakoori i in. 1990a i b]. Na podstawie badań własnych i piśmiennictwa można stwierdzić, iż chroniczna ekspozycja na pyretroidy skutkuje rozwojem zmian patologicznych w wątrobie. Jako miejsce metabolizowania ksenobiotyków jest szczególnie narażona na ich toksyczne działania. Rozwój tego typu zmian świadczy, że obecność subtoksycznych stężeń pyretroidów w wodach powierzchniowych może powodować dysfunkcję narządu, co w konsekwencji pociąga za sobą pogorszenie kondycji ryb. Praca finansowana z grantu N N PIŚMIENNICTWO BORGES A., SCOTTI L.V., SIQUEIRA D.R., ZANINI R., AMARAL F., JURINITZ D. F., WAS- SERMANN G.F Changes in haematological and serum biochemical values in jundiá, Rhamdia quelen due to sub-lethal toxicity of cypermethrin. Chemosphere 69: BRADBURY S.P., COATS J. R Comparative toxicology of the pyrethroid insecticides. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 108: CASIDA J. E Pyrethrum flowers and pyrethroid insecticides. Environ. Health Perspect. 34: CENGIZ E. I., UNLU E Sublethal effects of commercial deltamethrin on the structure of the gill, liver and gut tissues of mosquitofish, Gambusia affinis: a microscopic study. Environ. Toxicol. Pharmacol. 21:

9 Agnieszka Ludwikowska, Hanna Lutnicka CROSSLAND N. O., SHIRES S. W., BENNETT D Aquatic toxicology of cypermethrin. III. Fate and biological effects of spray drift deposits in fresh water adjacent to agricultural land. Aquatic Toxicol. 2: DĘBSKI B., ZALEWSKI W Implikacje stosowania permetryny w ekosystemie. Nowa Weterynaria 2 (4): EL-SAYED Y. S., SAAD T. T., EL-BAHR S. M Acute intoxication of deltamethrin in monosex Nile Tilapia, Oreochromis niloticus with special reference to the clinical, biochemical and haematological effects. Environ. Toxicol. Pharmacol. 24: HADFIELD S. T., SADLER J. K., BOLYGO E., HILL S., HILL I. R Pyrethroid residues in sediment and water samples from mesocosm and farm pond studies of simulated accidental aquatic exposure. Pestic. Sci. 38, HAYA K Toxicity of pyrethroid insecticides to fish. Environ. Toxicol, Chem. 8: JOSHI N., DHARMLATA, SAHU A. P Histopathological changes in liver of heteropneustes fossilis expose to cypermethrin. J. Environ. Biol. 28 (1): KARASU BENLI A. C., SELVI M., SARIKAYA R., ERKOÇ F., KOÇAK O Acute toxicity of deltamethrin on Nile Tilapia (Oreochromis niloticus L.1758) larvae and fry. G. U. Journal of Science 22: 1 4. KATSUDA Y Development of and future prospects for pyrethroid chemistry. Pestic. Sci. 55: LUTNICKA H Wpływ zanieczyszczenia wód pyretroidami na organizm ryb. Rozprawy Naukowe AR w Lublinie. Wydział Medycyny Weteryn. 252: MIJAMOTO J Degradation, metabolism and toxicity of synthetic pyrethroids. Environ. Health Perspect. 14: RADHAIAH V., RAO K. J Toxicity of the pyrethroid insecticide fenvalerate to a fresh water fish, Tilapia mossambica (Peters): changes in glycogen metabolism of muscle. Ecotoxicol. Environ. Safety 19: SARKAR B., CHATTERJEE A., ADHIKARI S., AYYAPPAN S Carbofuran- and cypermethrin-induced histopathological alternations in the liver of Labeo rohita (Hamilton) and its recovery. J. Appl. Ichthyol. 21: ŞENER URAL M., SAĞLAM N A study on the acute toxicity of pyrethroid deltamethrin on the fry rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792). Pesticide Biochem Physiol. 83: SHAKOORI A. R., ALAM J., AZIZ F., ALI S. S. 1990a. Biochemical effects of bifenthrin (Telstar) administrered orally for one month on the blood and liver of rabbit. Proc. Pakistan Congr. Zool. 10: SHAKOORI A. R., SABIR M., ASLAM F., ALI S. S. 1990b. Toxic effects induced in blood and liver of rabbit after short duration exposure to a synthetic pyrethroid, karate (cyhalothrin).. Proc. Pakistan Congr. Zool. 10:

10 Zmiany histopatologiczne w wątrobie ryb eksponowanych na subtoksyczne stężenie pyretroidów SINGH P. B., SINGH V Cypermethrin induced histological changes in gonadotrophic cells, liver, gonads, plasma levels of estradiol-17β and 11-ketotestosterone, and sperm motility in Heteropneustes fossilis (Bloch). Chemosphere 72: SVOBODOVÁ Z., LUSKOVÁ V., DRASTICHOVÁ J., SVOBODA M., ŽLÁBEK V Effect of deltamethrin on haematological indices of common carp (Cyprinus carpio L.). Acta Vet Brno 72: VELÍŠEK J., JURČÍKOVÁ J., DOBŠÍKOVÁ R., SVOBODOVÁ Z., PIAČKOVÁ V., MÁCHO- VÁ J., NOVOTNÝ L Effects of deltamethrin on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Environ.Toxicol. Pharmacol. 23: VELÍŠEK J., SVOBODOVÁ Z.,, MÁCHOVÁ J Effects of bifenthrin on some haematological, biochemical and histopathological parameters of common carp (Cyprinus carpio L.). Fish Physiol. Biochem. 35: VELMURUGAN B., SELVANAYAGAM M., CENGIZ E. I., UNLU E Histopathology of lambda-cyhalothrin on tissues (gill, kidney, liver and intestine) of Cirrhinus mrigala. Environ.Toxicol. Pharmacol. 24: WANG W., CAI D. J., SHAN Z. J., CHEN W. L., POLETIKA N., GAO X.W Comaprison of the acute toxicity for gamma-cyhalothrin and lambda-cyhalothrin to zebra fish and shrimp. Regulatory Toxicology and Pharmacology 47: YILMAZ M., GÜL A., ERBAŞLI K Acute toxicity of alpha-cypermethrin to guppy (Poecilia reticulate, Pallas, 1859). Chemosphere 56: