P R A C A O R Y G I N A L N A Acta Haematologica Polonica Original Article 2006, 37, Nr 1 str. 85 90 JAROSŁAW SOKOŁOWSKI, MARZENNA GALAR, JANUSZ KŁOCZKO Aktywna forma aktywowanego przez trombinę inhibitora fibrynolizy (TAFIa) u chorych na ostre białaczki szpikowe Active form of Thrombin Activable Fibrinolysis Inhibitor (TAFIa) in patients with acute myeloid leukaemia Z Kliniki Hematologii Akademii Medycznej w Białymstoku Kierownik: Prof. dr hab. med. Janusz Kłoczko SŁOWA KLUCZOWE: TAFI Hemostaza Ostra białaczka szpikowa KEY WORDS: TAFI Haemostasis Acute myeloid leukaemia STRESZCZENIE: Skaza krwotoczna jest często spotykanym powikłaniem ostrej białaczki szpikowej. U jej podłoża leżą zaburzenia hemostazy charakteryzujące się małopłytkowością, niedoborami osoczowych czynników krzepnięcia oraz wzmożoną fibrynolizą. Aktywowany trombiną inhibitor fibrynolizy (TAFI) opisywany również jako prokarboksypeptydaza B, U i R jest ważnym regulatorem fibrynolizy. Wzrost stężenia aktywnego TAFI w osoczu hamując degradację Cbryny wywiera działanie prozakrzepowe, podczas gdy obniżenie stężenia TAFIa może zwiększać tendencję do krwawień. W pracy oceniano stężenia aktywnej formy TAFI (TAFIa) w osoczach 17 pacjentów ze świeżo zdiagnozowaną ostrą białaczką szpikową oraz w grupie 11 osób zdrowych dobranych pod względem wieku i płci. Wykazano istotne obniżenie średniego stężenia TAFIa w grupie chorych na ostrą białaczkę szpikową (6,36 ± 3,48 g/ml) w porównaniu do grupy kontrolnej osób zdrowych (10,2 ± 4,3 g/ml); p < 0,01. Nie obserwowano występowania korelacji pomiędzy stężeniem TAFIa i markerami aktywacji hemostazy oraz liczbą płytek krwi. Obniżone stężenie TAFIa obserwowane u chorych na ostrą białaczkę szpikową prowadzi do wzrostu aktywności fibrynolitycznej osocza i może przyczyniać się do występowania powikłań krwotocznych. SUMMARY: Haemorrhage diathesis is a common haemostasis complication in patients with acute myeloid leukaemia. This may be partly due to disturbances in regulatory mechanisms of fibrinolysis. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor ftafi), described as procarboxypeptidase B, U and R is a potent regulator of fibrinolysis. The elevated plasma TAFI level induces hypofibrinolytic state while reduced plasma TAFI level induces hyperfibrinolytic state. We measured plasma active form of TAFI (TAFIa) levels in case-controled study in 17 patients with acute myeloid leukaemia before cytostatic treatment and in 11 age- sex-matched control subjects. We observed decreased plasma TAFIa levels in patients with acute myeloid leukaemia (6.36 ± 3,48 µg/ml) compared to control group (10,2 ± 4,3 µg/ml); p < 0,01. There was no [85]
86 J. SOKOŁOWSKI, M. GALAR, J. KŁOCZKO significant correlation between plasma TAFIa levels and studied haemostasis markers and between plasma TAFIa and platelets. Decreased plasma TAFIa level in patients with acute myeloid leukaemia may induce hyperfibrinolysis and thus may strengthen haemorrhagic complications. WSTĘP Niedawno odkryty inhibitor fibrynolizy aktywowany trombiną (TAFI), uważany jest za ogniwo łączące kaskadę krzepnięcia z procesem fibrynolizy (1). TAFI jest propeptydem o masie molekularnej 55kDa syntetyzowanym w wątrobie i uwalnianym do osocza w formie nieaktywnej (6). Jego aktywacja do formy czynnej TAFIa, opisywanej wcześniej jako karboksypeptydaza B, karboksypeptydaza U i karboksypeptydaza R, następuje przy udziale kompleksu trombinatrombomodulina poprzez odłączenie peptydu aktywacji (2, 3, 16). Aktywny TAFI odszczepiając z sieci fibryny C-końcowe reszty lizynowe i argininowe, niezbędne do aktywacji plazminogenu przez t-pa, powoduje zahamowanie tworzenia plazminy. Poza TAFI pochodzącym z wątroby istnieje jego druga forma o masie 50 kda, syntetyzowana w płytkach krwi i uwalniana w procesie ich aktywacji. TAFI pochodzenia wątrobowego i pochodzenia płytkowego wykazują identyczne okresy półtrwania, są aktywowane przez kompleks trombina-trombomodulina oraz hamowane przez inhibitory karboksypeptydaz (10). Opisano dwa polimorfizmy genu TAFI, które mogą modyfikować jego stężenie we krwi (4). Wzrost stężenia aktywnego TAFI w osoczu hamując degradację fibryny wywiera działanie prozakrzepowe, podczas gdy obniżenie stężenia TAFIa może zwiększać tendencję do krwawień (9, 15). Zaburzenia hemostazy występujące w ostrych białaczkach są wynikiem rozwoju choroby, występujących powikłań oraz stosowanego leczenia. Najczęściej manifestują się one skazą krwotoczną, rzadziej zaburzeniami zakrzepowo-zatorowymi (5). W dostępnej literaturze istnieje jedna praca opisująca zachowanie się TAFI u osób chorujących na ostrą białaczkę promielocytarną (obp) (8). Nie opisywano natomiast zachowania się TAFI w innych podtypach ostrej białaczki szpikowej (obs), gdzie ryzyko powikłań wynikających z zaburzeń hemostazy jest również istotnym elementem klinicznym. Ze względu na kluczową rolę aktywowanego przez trombinę inhibitora fibrynolizy w hemostazie postanowiliśmy określić zachowanie się stężeń jego aktywnej formy (TAFIa) w osoczach chorych na ostrą białaczkę szpikową w chwili rozpoznania choroby. W pracy starano się również ustalić ewentualny związek pomiędzy stężeniem TAFIa a stężeniami osoczowych markerów aktywacji hemostazy i liczbą płytek krwi.
Aktywna forma aktywowanego przez trombinę inhibitora fibrynolizy (TAFIa) 87 MATERIAŁ I METODY Grupę badaną stanowiło 17 chorych ze świeżo zdiagnozowaną ostrą białaczką szpikową (Ml-4, M2-6, M3-1, M4-3, M5-3) 9 kobiet i 7 mężczyzn w wieku od 19 do 74 lat hospitalizowanych w Klinice Hematologii AM w Białymstoku. Grupę kontrolną stanowiło 11 zdrowych ochotników (7 kobiet i 4 mężczyzn) w zbliżonym przedziale wieku. Rozpoznanie choroby rozrostowej ustalono na podstawie badań klinicznych oraz badań dodatkowych, takich jak: badanie składu morfotycznego krwi obwodowej, mielogramu, badania cytochemicznego oraz cytometrii przepływowej. Krew do badań pobierano rano z żyły łokciowej, na czczo, do 3,8% cytrynianu sodowego w stosunku 1:9, przed włączeniem chemioterapii Po odwirowaniu (15 min., 1500 g, w temperaturze pokojowej) osocze ubogopłytkowe przechowywano w temperaturze 40 C do chwili wykonania badań. Osoczowe stężenie TAFIa oceniano zestawem Actichrome TAFI Activity Kit firmy American Diagnostica. Stężenia markerów aktywacji krzepnięcia i fibrynolizy: fragmentu protrombiny 1 + 2 (F 1 + 2), D-dimer (D-D) oraz kompleks plazminaa2antyplazmina (PAP) oznaczano zestawami ENZYGNOST Fl + 2, PAP, D-dimer micro firmy Dade Behring. Analiza statystyczna otrzymanych wyników obejmowała obliczenia średniej statystycznej, odchylenia standardowego, współczynnika korelacji i istotności statystycznej z wykorzystaniem programu statystycznego STATISTCA v.5. WYNIKI Przeprowadzone badania wykazały znamienne obniżenie średniego stężenia TAFIa w osoczach osób chorych na ostrą białaczkę szpikową (6,36 ± 3,48 ug/ml) w porównaniu do grypy osób zdrowych (10,2 ± 4,3 µg/ml); p < 0,01. Średnie wartości stężeń osoczowych markerów aktywacji hemostazy Fl + 2, D-dimer i PAP w grupie osób zdrowych i chorych na ostrą białaczką szpikową przedstawia tabela 1. U chorych na ostrą białaczkę szpikową wykazano istotny statystycznie wzrost stężeń badanych markerów aktywacji hemostazy. Nie wykazano znamiennej statystycznie korelacji pomiędzy stężeniami TAFIa a stężeniami badanych markerów aktywacji hemostazy: TAFIa if 1 + 2 (r = 0,18; p = 0,5); TAFIa i D-dimer (r = 0,10; p = 0,71); TAFIa i PAP (r = 0,14; p = 0,6) oraz stężeniami TAFIa i liczbą płytek krwi (r = 0,19; p = 0,5). OMÓWIENIE WYNIKÓW W grupie chorych ze świeżo zdiagnozowaną ostrą białaczką szpikową stwierdzono znamiennie podwyższone średnie wartości stężeń Fl + 2, D-dimeru i PAP wskazujące na wzmożoną aktywację krzepnięcia i fibrynolizy. Sletnes i wsp. (14) oraz Nur i wsp. (11) w chwili rozpoznania ostrej białaczki, diagnozowali występowanie zespołu wykrzepiania śródnaczyniowego u około 10 20% chorych.
88 J. SOKOŁOWSKI, M. GALAR, J. KŁOCZKO TAFIa µg/ml 14 - p<0,01 12 10-8 6-4 - 2 - ZDROWI CHORZY Ryc 1. Średnie stężenie TAFIa u osób zdrowych (n 11) i chorych na ostrą białaczkę szpikową (obs) (n 17) Fig. 1. Mean plasma TAFIa level in healthy subjects (n = 11) and patients with acute myeloid leukaemia (AML) (n = 17) Tabela 1. Średnie wartości stężeń osoczowych markerów aktywacji hemostazy F 1 +2, D-dimeru, PAP w grupie osób zdrowych i chorych na ostrą białaczką szpikową Table 1. Mean plasma levels of thrombosis and fibrinolysis activation markers in healthy subjects and patients with acute myeloid leukaemia Badany parametr Zdrowi x ±SD Obs x ± SD Znamienność statystyczna F 1+2 nmol/1 1,04 ± 0,25 (0,63 1,58) D-dimer ug/ml 13,7 ± 11,7 (2,4 45,6) PAP ug/ml 513 ± 249 (170 959) 4,82 ± 3,97 (1,25-13,49) 614,7 ± 749,8 (13 1864) 2091 ± 2431 (188 8779) p < 0,001 p < 0,003 p < 0,003 Rodeghiera i wsp. (13) wykazali, że częstość powikłań wynikających z zaburzeń hemostazy zależy od podtypu białaczki. DIC jest rozpoznawany w 75 90% przypadków ostrej białaczki promielocytarnej, w 5 10% przypadkach podtypu Ml, M2 oraz M4, w 5 25% przypadkach podtypu M5 i do 5% w podtypie ostrej białaczki limfoblastycznej (15).
Aktywna forma aktywowanego przez trombinę inhibitora fibrynolizy (TAFIa) 89 U osób z ostrymi procesami rozrostowymi układu krwiotwórczego opisywane są zaburzenia w funkcji inhibitorów hemostazy: antytrombiny, alfa2-makroglobuliny, alfa2-antyplazminy oraz inhibitora zewnątrzpochodnej drogi krzepnięcia (12). Obserwowane przez nas obniżenie średniej wartości stężenia TAFIa o około 30% u chorych na obs może wpływać na wzmożenie procesu fibrynolizy. Mejiers i wsp. (8) obserwowali w grupie 15 osób z ostrą białaczką promielocytarną spadek stężenia TAFIa o około 60%. Interesującym wydaje się być fakt, iż stężenie antygenu TAFI u tych chorych utrzymywało się w zakresie wartości prawidłowych. W badaniach in vitro wykazano, że plazmina powodując częściową degradację TAFI obniża znacznie jego aktywność nie wpływając istotnie na stężenie antygenu (7). Wzmożona generacja plazminy, na którą wskazują wysokie stężenia PAP i D-dimeru, występująca u chorych na obs, może w części odpowiadać za obniżenie stężenia aktywnego TAFI. Interesująca byłaby ocena częstości występowania u chorych na obs isoformy TAFI (TAFI-Thr325) charakteryzującej się zmniejszoną stabilnością i mniejszą aktywnością antyfibrynolityczną (4). Obniżenie stężenia TAFIa w osoczach chorych na ostre białaczki szpikowe może, przynajmniej częściowo odpowiadać za obserwowany wzrost aktywności fibrynolitycznej i przyczyniać się do występowania powikłań krwotocznych. PIŚMIENNICTWO 1. Bajzar L, Manuel R, Nesheim ME. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J Biol Chem 1995; 270: 14477-14484. 2. Bajzar L, Morser J, Nesheim ME. TAFI, or plasma procarboxypeptidase B, cuoples the coagulation and Dbrinolytic cascade through the thrombin-thrombomodulin complex. J Biot Chem 1996; 271: 16603-8. 3. Bouma BN, Meijers JCM. Thrombin-activable fibrinolysis inhibitor (TAFI, plasma procarboxypeptidase B, procarboxypeptidase R, procarboxypeptidase U). J Thromb Haemost 2003; 1: 1566 74. 4. Brouwers GJ, Vos HL, Leebeek FW, Bulk S, Schneider M, Boffa M. Koschinsky M, van Tilburg NH, Nesheim ME, Bertina RM, Gómez Garcia EB. A novel, possibly functional, single nucleotide polymorphism in the coding region of the thrombin- activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) gene is also associated with TAFI levels. Blood 2001; 98: 1992-3. 5. Chojnowski K. Zaburzenia hemostazy w ostrych białaczkach. Acta Haematol 2002; 33(2): 139-151. 6. Eaton DL, Maloy BE, Tsai SP, Hemzel W, Drayana D. Isolation, molecular cloning and partial characterization of novel carboxypeptidase B from human plasma. J Biol Chem 1991; 266: 21833 8. 7. Marx PF, Dawson PE, Bouma BN, Meijers JCM. Plasmin-mediated activation and inactivation of thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. Biochemistry 2002;4 1: 6688 96. 8. Mejiers JCM, Oudijk EJD, Mosnier LO, Bos R, Bouma BN, Nieuwenhuis HK, Fijheer R. Reduced activity of TAFI in acute promyelocytic leukaemia. Br J Haematol 2000; 108: 518-523. 9. Meijers JCM, Tekelenburg WL, Bouma BN, Bertina RM, Rosendal FR. High levels of coagulation factor XI as a risk factor for venous thrombosis N Engl J Med. 2000; 342: 696-701. 10. Mosnier LO, Buijtenhuij P, Manc PF, Meijers JCM, Bouma BN. Identification of thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) in human platelets. Blood 2003; 101: 4844-6. 11. Nur S, Anwar M, Saleem M, Ahmad PA. Disseminated intravascular coagulation in acute leukaemias at first diagnosis. Eur J Haematol 1995; 55: 78 82. 11 Radziwon P, Schenk JF, Mazgajska K, Boczkowska-Radziwon B, Galar M, Kłoczko J, Wojtukiewicz MZ, Stężenie czynnika tkankowego i jego inhibitora u chorych na guzy układu moczowego i choroby rozrostowe układu krwiotwórczego. Poi Merk Lek 2002; 76: 308 15.
90 J. SOKOŁOWSKI, M. GALAR, J. KŁOCZKO 13. Rodeghiero F, Castaman G. The coagulopathy of acute leukaemia. Leuk Lymph 1992; 7: 42 48. 14. Sletnes KE, Godal HC, Wisloff F. Disseminated intravascular coagulation (DIC) in adult patients with acute leukaemia. Eur J Haematol 1995; 54: 34-8. 15. Vileg AV, Van der Linden IK, Bertina RM, Rosendaal FR. High levels of factor IX increase the risk of venous thrombosis. Blood 2000; 95: 3678-82. 16. Wang W, Hendrks DF, Scharpe SS. Carboxypeptidase U, a plasma carboxypeptidase with high affinity for plasminogen. J Biol Chem 1994; 269: 15937-44. Praca wpłynęła do Redakcji 15.11.2004 r. i została zakwalifikowana do druku 10.01.2006 r. Adres Autorów. Jarosław Sokołowski Klinika Hematologii SPSK ul. Marii Skłodowskiej-Curie 24A 15-276 Białystok