Z Wydziału Biologii Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego KGP w Warszawie Naczelnik: mgr M. Kwietniewska 2

ARCH. MED. SĄD. KRYMINOL., 2011, LXI, 153-160 PRACE ORYGINALNE / ORIGINAL PAPERS Jacek Drabik 1, Agata Jagiełło 2, Anna Niemcunowicz-Janica 3, Witold Pepiński 3 Walidacja i ocena przydatności zestawu pięciu markerów ministr w genetyce sądowej Validation and evaluation of a five ministrs kit in forensic genetics 1 Z Wydziału Biologii Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego KGP w Warszawie Naczelnik: mgr M. Kwietniewska 2 Z Zakładu Bioinżynierii Instytutu Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie Kierownik: dr G. Płucienniczak 3 Z Zakładu Medycyny Sądowej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku Kierownik: dr hab. med. A. Niemcunowicz-Janica Opracowany i zoptymalizowany nowy zestaw multipleksowy ministr zawiera loci D3S3053, D6S474, D9S2157, D20S482 oraz marker płci amelogeninę. Startery użyte do amplifikacji loci ministr hybrydyzują do matrycy DNA w bezpośrednim sąsiedztwie regionu repetetywnego i generują amplikony o niskich masach cząsteczkowych (71-135 pz). Analiza wielkości produktów odbywa się w oparciu o system automatycznej detekcji a allele definiowane są na podstawie wewnętrznego standardu wielkości. Minimalna ilość DNA niezbędna do uzyskania pełnego profilu genetycznego wynosi 250 pg. Udowodniono specyficzność gatunkową i stabilność somatyczną badanych loci, jak również użyteczność zaprojektowanego systemu loci ministr w badaniach zdegradowanych śladów biologicznych, takich jak: plamy krwi i spermy na tkaninie, ślina z ustników niedopałków papierosów oraz fragmentów włosów katagenowych. Loci, które wchodzą w skład zestawu nie należą do standardu używanego w kryminalistyce opartego na systemie CODIS, dlatego mogą one stanowić rozszerzenie typowego panelu badawczego, gdy konieczne jest zwiększenie siły dyskryminacji użytego zestawu loci. The newly designed and optimized miniplex contains the following markers: D3S3053, D6S474, D9S2157, D20S482 and sex-determining marker amelogenin. The target amplicon lengths for the developed multiplex are 71 135 bp. Amplification products were detected in a fluorescence based automated genetic analyzer. A minimal DNA sample required to obtain full genetic profiles was 250 pg. The usefulness of these ministrs in genotyping of severely degraded forensic samples, such as stains of blood and semen, saliva on cigarette butts and telogen hair has been confirmed in validation studies. The designed pentaplex offers a new potential screening tool in cases of old crime scenes, mass disasters, mass graves, etc., where DNA degradation, body fragmentation or large numbers of victims occur. The use of additional non-codis markers may increase typeability of severely degraded samples and ensure a higher potential for genetic discrimination. WSTĘP W praktyce medyczno-sądowej przedmiotem badań jest nierzadko materiał, który poddawany był wpływowi niekorzystnych czynników środowiskowych lub działaniu mikroorganizmów. Procesy te prowadzą do degradacji DNA utrudniając interpretację profilu genetycznego wskutek powstawania artefaktów w postaci nierównomiernej amplifikacji alleli heterozygot, całkowitej utraty jednego z alleli (allelic drop-out), bądź całego locus (locus drop-out) [1, 2, 3, 4]. Podwyższona temperatura i wilgotność, promieniowanie UV czy ogień powodują fragmentację DNA do krótkich odcinków poprzez zachodzące w komórkach procesy biochemiczne lub oksydacyjne [5, 6, 7]. Jedną z metod genotypowania próbek DNA o dużym stopniu fragmentacji jest

154 Jacek Drabik, Agata Jagiełło, Anna Niemcunowicz-Janica, Witold Pepiński Nr 2 zastosowanie starterów PCR przyłączających się w bezpośrednim sąsiedztwie sekwencji powtarzalnej. Skrócenie regionów flankujących umożliwia uzyskiwanie produktów PCR o niskiej masie cząsteczkowej (50-150 pz) [1, 4]. Markery ministr wykorzystano po raz pierwszy na dużą skalę przy identyfikacji ofiar ataku terrorystycznego na World Trade Center w 2001 roku [8]. Opracowano multipleks ministr, w którego skład weszły loci autosomalne: D3S3053, D6S474, D9S2157 i D20S482 oraz marker płci amelogenina. Poszczególne markery autosomalne nie były dotychczas rutynowo używane w badaniach medyczno-sądowych, lecz zostały sklasyfikowane jako użyteczne w identyfikacji osobniczej na podstawie różnych danych populacyjnych [9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]. Celem pracy była ocena przydatności zaprojektowanego pentapleksu w genotypowaniu próbek zdegradowanego DNA. MATERIAŁ I METODY Charakterystykę loci ministr wchodzących w skład opracowanego pentapleksu przedstawiono w tabeli I. Przeprowadzono optymalizację warunków PCR oraz dwuetapową walidację procesu genotypowania zgodnie z wytycznymi SWGDAM (ang. Scientific Working Group on DNA Analysis Methods), które obejmują zbiór definicji dotyczących wdrażania procedur analizy DNA w laboratoriach kryminalistycznych [16]. Walidacja dostarcza niezbędnych informacji na temat zdolności metody badawczej do generowania wiarygodnych rezultatów, ograniczeń nałożonych na procedurę oraz parametrów, których zastosowanie umożliwi uzyskanie właściwych wyników analizy. Ponadto w trakcie przeprowadzania walidacji definiowane są krytyczne etapy procesu w celu ich dokładnego kontrolowania [17, 18]. Tabela I. Table I. Charakterystyka loci zawartych w pentapleksie ministr. Characteristics of loci included in the ministr pentaplex. Locus Numer dostępu w Banku Genów Gene Bank accession number Jednostka powtarzalna Repeat unit Allel referencyjny Reference allele Lokalizacja chromosomowa Chromosomal location Zakres długości alleli (pz) Allele length range (bp) Zakres alleli Allele range D3S3053 AC069259 TATC 9 3q26.31 84 108 7 13 D6S474 AL357514 [AGAT] [GATA] 17 6q21-22 107 135 13 20 D9S2157 AL162417 ATA 10 9q34.2 71 107 7 19 D20S482 AL121781 AGAT 14 20p13 86 126 9 19 AMG X M55418 Xp22.31-p22.1 80 X AMG Y M55419 Yp11.2 83 Y

Nr 2 WALIDACJA I OCENA PRZYDATNOŚCI ZESTAWU PIĘCIU MARKERÓW MINISTR W GENETYCE SĄDOWEJ 155 Specyficzność gatunkową określano na podstawie badań próbek DNA pochodzących z zasuszonych próbek krwi 17 wybranych gatunków zwierząt: domowych (kot, pies), gospodarskich (koń, krowa, koza, owca, świnia, kura, indyk), dziko żyjących (dzik, jeleń, sarna, mysz, szczur, karp, lew) oraz naczelnych (szympans). Stabilność somatyczną analizowano poprzez porównanie zgodności genotypu w materiale wyodrębnionym z różnych tkanek pochodzących do tej samej osoby. Materiał badawczy stanowiły wycinki 10 różnych tkanek (mózg, przysadka mózgowa, serce, płuco, mięsień poprzecznie prążkowany, trzustka, śledziona, wątroba, nerka oraz jądro bądź jajnik) pobranych podczas badania pośmiertnego trzech niespokrewnionych osób o czasie zgonu nie dłuższym niż 14 godzin. Czułość analizy wyznaczano poprzez określenie progowej wartości stężenia DNA niezbędnej do uzyskania pełnego profilu genetycznego. Do tego celu wykorzystano wzorce DNA izolowane z komercyjnych linii komórkowych: 9947A, 9948 (Promega) i AmpFiSTR DNA Control 007 (Applied Biosystems). Powtarzalność otrzymywanych wyników oceniano na podstawie analizy genotypów uzyskiwanych po różnym czasie przechowywania materiału pochodzącego od tej samej osoby. Przydatność w identyfikacji genetycznej śladów biologicznych oceniano badając anonimowy materiał biologiczny: 43 próbki wysuszonej krwi ludzkiej pochodzących z lat 1957 1998, dziewięć próbek krwi ludzkiej w postaci plam zabezpieczonych na tkaninie, sześć próbek nasienia męskiego w postaci plam zabezpieczonych na tkaninie, osiem próbek śliny pobranych z ustników niedopałków papierosów, osiem włosów katagenowych oraz 14 próbek krwi naniesionej na jałowe płótno i poddanych inkubacji w cieplarce w temperaturze 150 C przez 30 min [19]. Próbki DNA izolowano metodą organiczną. Pomiar stężeń DNA ludzkiego w izolatach przeprowadzono metodą qpcr przy zastosowaniu zestawu Quantifiler Human DNA Quantification Kit oraz aparatu 7500 RealTime PCR System (Applied Biosystems). Amplifikację prowadzono w aparacie GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Wyboru starterów PCR dla loci D3S3053, D6S474, D9S2157 i D20S482 dokonano spośród sekwencji zaproponowanych przez Hill i wsp. [12]. Sekwencje starterów PCR dla locus amelogeniny zaczerpnięto z publikacji Haas-Rochholza i Weilera [20]. Startery frontowe (F) wyznakowano na końcach 5 odpowiednimi fluorochromami. Warunki odpowiednie do prowadzenia reakcji PCR z użyciem zestawu pięciu par starterów dobierano poprzez optymalizację dziewięciu różnych zmiennych, mających wpływ na wydajność amplifikacji DNA. Każdorazowo modyfikowano jeden z parametrów, a następnie oceniano, w jaki sposób zmiana ta wpłynęła na jakość uzyskiwanych wyników, w szczególności na wysokość oraz morfologię pików. Rozdział produktów amplifikacji prowadzono w analizatorze genetycznym ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) wobec wewnętrznego standardu wielkości GS500 LIZ (Applied Biosystems) stosując kapilary o długości 36 cm i polimer POP-4 (Applied Biosystems) przy napięciu 15 kv i temperaturze 60 o C. Czas elektroforezy wynosił 25 minut. Dane rejestrowano przy pomocy oprogramowania Data Collection v3.0 (Applied Biosystems). Aparat wykalibrowano za pomocą zestawu barwników matrycowych DS-33 (6-FAM TM, VIC, NED TM, PET, LIZ ) dla wirtualnego filtra G5. Analizę fragmentów prowadzono przy użyciu oprogramowania GeneMapper ID-X (Applied Biosystems). Do skonstruowania drabin alleli użyto fragmentów, dla których liczbę powtórzeń w obszarach zmiennych określono na drodze sekwencjonowania uwzględniając wszystkie ujawnione warianty długości. Szczegóły metodyki są przedmiotem planowanego zastrzeżenia patentowego, dlatego nie mogą zostać ujawnione w bieżącej publikacji. Genotypowanie tych samych izolatów, reprezentujących próbki zdegradowane, przeprowadzono z zastosowaniem zestawu AmpFiSTR SGM Plus (Applied Biosystems) z użyciem 2 ng matrycy DNA, tj. ilości zalecanej przez producenta. Wyniki uzyskane za pomocą multipleksu badanego i referencyjnego przeanalizowano pod kątem jakości zarejestrowanego sygnału oraz liczby oznaczonych markerów. WYNIKI I DYSKUSJA Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń określono optymalne warunki prowadzenia reakcji amplifikacji badanego pentapleksu. Wartości parametrów przedstawiono w tabeli II. W analizowanych próbkach krwi zwierzęcej nie uzyskano profili genetycznych, jedynie w profilu DNA próbki pobranej od szympansa pojawił się po-

156 Jacek Drabik, Agata Jagiełło, Anna Niemcunowicz-Janica, Witold Pepiński Nr 2 Tabela II. Zoptymalizowane warunki PCR. Table II. Optimized PCR conditions. Parametr Parameter startery D3S3053 D3S3053 primers startery D6S474 D6S474 primers startery D9S2157 D9S2157 primers startery D20S482 D20S482 primers startery AMG AMG primers matryca DNA DNA template MgCl2 polimeraza Taq Taq polymerase Wartość Value 0,3 µm 0,2 µm 0,8 µm 0,2 µm 0,2 µm 0,1 0,5 ng 1,5 mm 0,5 U dntps 200 µm denaturacja wstępna initial denaturation denaturacja denaturation hybrydyzacja starterów primer hybridization wydłużanie elongation wydłużanie końcowe final elongation cykle termiczne thermal cycles 95 C, 11 94 C, 1 59 C, 1 72 C, 1 60 C, 45 28 jedynczy, bardzo niski pik w zakresie długości alleli locus D20S482. Uzyskane wyniki dowodzą swoistości gatunkowej starterów PCR zaprojektowanych dla wszystkich badanych loci ministr. Badania przeprowadzone na próbkach DNA pochodzących z 10 różnych rodzajów tkanek pobranych ze zwłok trzech osób wykazały zgodności genotypów we wszystkich analizowanych przypadkach i tym samym dowiodły stabilności somatycznej badanego zestawu loci. Powtarzalność otrzymywanych wyników oceniano na podstawie analizy genotypów oznaczanych po różnym czasie przechowywania materiału pochodzącego od tej samej osoby. We wszystkich badanych przypadkach stwierdzono zgodność uzyskanych profili genetycznych. Świadczy to o spójności wyników uzyskiwanych przy pomocy zaprojektowanego zestawu multipleksowego ministr. Określenie czułości analizy polegało na określeniu najmniejszej ilości DNA pozwalającej na uzyskanie pełnego profilu genetycznego projektowanego pentapleksu. Na jedną reakcję dodawano od 62,5 pg do 1 ng matrycy DNA. Próbę wykonano w dwóch powtórzeniach z użyciem trzech różnych wzorców DNA. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli III. W zakresie ilości od 1 ng do 0,5 ng matrycy DNA dla każdej próby uzyskano pełny profil genetyczny. Przy 250 pg DNA w większości przypadków uzyskano pełne profile genetyczne, tylko w dwóch próbkach zanotowano wypadanie alleli locus D6S474. Dla ilości DNA niższych niż 125 pg uzyskiwano profile częściowe. Zjawisko wypadania alleli obserwowano najczęściej w obrębie loci o najdłuższych amplikonach D6S474 i D3S3053 oraz rzadziej w D20S482. Dla żadnej z analizowanych próbek nie zanotowano utraty sygnału wszystkich loci. Na rycinie 1 przedstawiono elektroforegram produktów amplifikacji 250 pg wzorca DNA uzyskany w trakcie doświadczalnego wyznaczania czułości reakcji. Ze względu na charakter badań, którym dedykowany jest projektowany pentapleks ministr, szczególny nacisk położono na określenie jego czułości w kontekście analizy materiału zdegradowanego. Izolację DNA przeprowadzono metodą organiczną, która ze względu na wysoką wydajność jest jedną z najczęściej stosowanych w laboratoriach genetycznych [19]. Ilościowe oznaczenia DNA przeprowadzono metodą real-time PCR z użyciem zestawu odczynników Quantifiler Human DNA Quantification Kit. Długość amplikonu, na podstawie którego odczytywane jest stężenie próbki wynosi 62 pz, stąd uzyskane wyniki pomiaru powinny być miarodajne nawet w przypadku próbek zawierających materiał zdegradowany [21]. Amplifikowano próbki DNA wyizolowane z różnych rodzajów śladów biologicznych najczęściej spotykanych na miejscach przestępstw. Na 31 przebadanych próbek uzyskano 27 pełnych i trzy częściowe profile genetyczne. W każdym

Nr 2 WALIDACJA I OCENA PRZYDATNOŚCI ZESTAWU PIĘCIU MARKERÓW MINISTR W GENETYCE SĄDOWEJ 157 Tabela III. Oznaczalność profili genetycznych w zależności od ilości matrycy DNA. Table III. DNA typeability depending on template quantity. Wzorzec DNA DNA control 9947A 9948 DNA Control 007 DNA (ng) D3 D6 D9 D20 D3 D6 D9 D20 D3 D6 D9 D20 0,0625 F N F P N N F F N N F F F F F P F N F F P N F F 0,1250 F N F F F N F F F N F F F F F F P F F F F F F F 0,2500 F F F F F P F F F N F F F F F F F F F F F F F F 0,5000 F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F 0,7500 F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F 1,0000 F F F F F F F F F F F F F pełny profil, P częściowy profil, N brak profilu F full profile, P partial profile, N no profile F F F F F F F F F F F F Ryc. 1. Fig. 1. Elektroforegram produktów amplifikacji 250 pg wzorca DNA. Electrophoregram of PCR amplified products from 250 pg of DNA template.

158 Jacek Drabik, Agata Jagiełło, Anna Niemcunowicz-Janica, Witold Pepiński Nr 2 z trzech przypadków utratę sygnału obserwowano dla locus D6S474. W przypadku jednej próbki nie udało się określić genotypu żadnego z oznaczanych układów. Oznaczalność loci zaprojektowanego zestawu ministr w badaniach śladów kryminalistycznych (plamy spermy i krwi na tkaninie, włosy, ślina na ustnikach niedopałków papierosów) wyniosła 87%. Dla dwóch próbek śliny z ustników niedopałków papierosów oraz dla jednej próbki stanowiącej włos katagenowy uzyskano częściowe profile genetyczne z utratą sygnału pojedynczych loci. W jednym przypadku śladu spermy na tkaninie nie zarejestrowano sygnału amplifikacyjnego. Zbliżony odsetek pozytywnych wyników genotypowania (84%) uzyskano w badaniach archiwalnych śladów krwi zabezpieczonych na tkaninie, pochodzących z lat 1957-1998. Wyniki te korelują z doniesieniem Tsukady i wsp. [22], którzy w podobnym doświadczeniu za pomocą czterech skróconych loci analizowali próbki krwi przechowywane w temperaturze pokojowej przez okres 17-26 lat. Wykonane w ramach walidacji zaprojektowanego multipleksu badania czułości potwierdziły również wyniki uzyskane przez Opel i wsp. [7] dla tripleksów ministr. Testując próbki zdegradowanej krwi i materiału kostnego otrzymywali oni 90 94% pełnych profili genetycznych. Dowiedli oni również, że amplifikacja trzech loci ministr zachodzi wydajnie z ilości matrycy większej niż 100 pg. Problem identyfikacji rozłożonych szczątków ludzkich ukrytych w celu zatarcia śladów przestępstwa czy ofiar katastrof lub działań wojennych, pojawia się często w praktyce sądowo-lekarskiej [23, 24, 25, 26, 27, 28]. W niniejszej pracy modelem zdegradowanych śladów biologicznych były próbki krwi inkubowane przez 30 minut w temperaturze 150 o C [19]. Zastosowana metoda degradacji różni się od sposobów opisywanych w piśmiennictwie, polegających na fragmentowaniu DNA poprzez działanie DNAzy I [3, 7, 29, 30]. Genotypowanie 14 zdegradowanych próbek krwi komercyjnym zestawem AmpFiSTR SGM Plus pozwoliło na uzyskanie 13 częściowych profili genetycznych, w których utratę sygnału stwierdzono w większości loci. W jednym przypadku nie uzyskano produktów amplifikacji. W wyniku badania tych samych śladów zaprojektowanym multipleksem ministr uzyskano 12 pełnych oraz dwa częściowe profile genetyczne. W jednej z próbek wygaszenie sygnałów zaobserwowano w loci D6S474 oraz D9S2157, zaś w innej nie zarejestrowano pików układu D20S482. Degradacja DNA uniemożliwiła amplifikację długich fragmentów DNA. Potwierdzono tezę, że wykorzystanie loci ministr daje w takich przypadkach większe szanse na uzyskanie profilu genetycznego. Zdecydowanie wyższą oznaczalność skróconych markerów uzyskano również podczas identyfikacji ofiar ataku na WTC w Nowym Jorku [24], gdzie materiałem badawczym były szczątki ludzkie w stanie daleko posuniętego rozkładu. Analiza wyników amplifikacji z użyciem zestawu AmpFiSTR Profiler Plus opublikowana przez Maciejewską i Pawłowskiego [31] wykazała, że w przypadku próbki wykazującej zdegradowanie DNA do wielkości 600 pz występuje zanik amplifikacji locus D7S820 oraz znaczne osłabienie sygnałów amplifikacyjnych dla fragmentów o największej masie cząsteczkowej (D18S51, FGA, D13S317 i D21S11). W przypadku zdegradowania DNA do wielkości poniżej ok. 300pz autorzy ci uzyskali wyłącznie amplifikację genu amelogeniny, natomiast dla próbki DNA zdegradowanej do wielkości poniżej 100pz niemożliwe było oznaczenie żadnego z badanych loci. Analiza typowych próbek kryminalistycznych i zdegradowanych śladów krwi zabezpieczonych na tkaninie pozwoliła na sformułowanie wniosku, że wybrane markery ministr są przydatne w badaniach medyczno-sądowych, a zaprojektowany zestaw może stanowić użyteczne narzędzie w genotypowaniu zdegradowanego DNA.

Nr 2 WALIDACJA I OCENA PRZYDATNOŚCI ZESTAWU PIĘCIU MARKERÓW MINISTR W GENETYCE SĄDOWEJ 159 PIŚMIENNICTWO 1. Butler J. M., Shen Y., McCord B. R.: The development of reduced size STR amplicons as tool for analysis of degraded DNA. J. Forensic Sci. 2003, 48: 1054-1064. 2. Miloš A., Selmanović A., Smajlović L., Huel R. L. M., Katzmarzyk C., Rizvić A., Parsons T.J.: Success rates of nuclear short tandem repeat typing from different skeletal elements. Croat. Med. J. 2007, 48: 486-493. 3. Mulero J. J., Chien Wei Chang, Lagacé R. E., Wang D. Y., Bas J. L., McMahon T. P., Hennessy L. K.: Development and validation of the AmpFiSTR MiniFilerTM PCR amplification kit: A ministr multiplex for the analysis of degraded and/or PCR inhibited DNA. J. Forensic Sci. 2008, 53: 838-852. 4. Wiegand P., Kleiber M.: Less is more length reduction of STR amplicons using redesigned primers. Int. J. Leg. Med. 2001, 114: 285-287. 5. Bär W., Kratzer A., Machler M., Schmid W.: Postmortem stability of DNA. Forensic Sci. Int. 1988, 39: 59 70. 6. Butler J. M.: Short tandem repeat typing technologies used in human identity testing. Biotechniques. 2007, 43: Sii-Sv. 7. Opel K. L., Chung D. T., Drábek J., Butler J. M., McCord B. R.: Developmental validation of reduced-size STR miniplex primer sets. J. Forensic Sci. 2007, 52: 1263-1271. 8. Holland M. M., Cave C. A., Holland C. A., Bille T. W.: Development of a quality, hight throughput DNA analysis procedure for skeletal samples to assist with the identification of victims from the World Trade Center attacks. Croat. Med. J. 2003, 44: 264-272. 9. Chung U., Shin K.-J., Park M. J., Kim N. Y., Yang W. I., Cho S.-H., Lee H. Y.: population data of nine ministr loci in Koreans. Forensic Sci. Int. 2007, 168: e51-e53. 10. Coble M. D., Hill C. R., Vallone P. M., Butler J. M.: Characterization and performance of new MiniSTR loci for typing degraded samples. Int. Congr. Ser. 2006, 1288: 504-506. 11. Hill C. R., Butler J. M., Coble M. D.: Allele frequencies for 26 ministr loci with U.S. Caucasian, African American, and Hispanic populations. Dane populacyjne dostępne w internecie pod adresem: http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/nistpop.htm. 12. Hill C. R., Kline M. C., Coble M. D., Butler J. M.: Characterization of 26 ministr loci for improved analysis of degraded DNA samples. J. Forensic Sci. 2008, 53: 73-80. 13. Malaghini M., Schneider V., Leite F.: Genetic analysis of 9 non-codis ministr loci in the Brazilian population of Parana. Forensic Sci. Int.: Genetics Suppl. Ser. 2009, 2: 359-360. 14. Shujin L., Ning L., Xue B., Jianli G., Zhiping H., Bin C.: Construction and application of four fluorescence labeled multiplex typing system for 3 ministr loci. Forensic Sci. Int.: Genetics Suppl. Ser. 2009, 2: 31-32. 15. Yong R. Y. Y., Gan L. S. H., Chua E. M., Yap E. P. H: Polymorphism studies of six ministr loci for three ethnic populations in Singapore. Leg. Med. 2009, 11: 195-197. 16. Schneider P. M., Bendera K., Mayrb W. R., Parson W., Hoste B., Decorte R., Cordonnier J., Vanek D., Morling N., Karjalainen M., Carlotti C., Sabatier M., Hohoff C., Schmitter H., Pflug W., Wenzel R., Patzelt D., Lessig R., Dobrowolski P., O Donnell G., Garafano L., Dobosz M., de Knijff P., Mevag B., Pawlowski R., Gusmão L., Vide M. C., Alonso A., Fernández O. G., Nicolás P. S., Kihlgreen A., Walter Bär, Meier V., Teyssier A., Coquoz R., Brandt C., Germann U., Gill P., Hallett J., Greenhalgh M.: STR analysis of artificially degraded DNA results of a collaborative European exercise. Forensic Sci. Int. 2004, 139: 123-134. 17. Butler J. M.: Forensic DNA Typing: Biology and technology behind STR markers. Laboratory validation. Elsevier Academic Press. 2001. 18. Butler J. M.: Validation: What is it, why does it matter, and how should it be done? Applied Biosystems, Forensic News 01, 2007. 19. Dębska M., Drabik J.: Porównanie efektywności różnych metod izolacji genomowego DNA ze śladów biologicznych. Problemy Kryminalistyki 2009, 264: 11-25. 20. Haas-Rochholz H., Weiler G.: Additional primer sets for an amelogenin gene PCR based DNA sex test. Int. J. Leg. Med. 1997, 110: 312-315. 21. Westring C. G., Kristinsson R., Gilbert D. M., Danielson P. B.: Validation of reduced-scale reactions for the Quantifiler Human DNA kit. J. Forensic Sci. 2007, 52: 1035-1043. 22. Tsukada K., Takayanagi K., Asamura H., Ota M., Fukushima H.: Multiplex short tandem repeat

160 Jacek Drabik, Agata Jagiełło, Anna Niemcunowicz-Janica, Witold Pepiński Nr 2 typing in degraded samples using newly designed primers for the TH01, TPOX, CSF1PO, and vwa loci. Leg. Med. 2002, 4: 239-245. 23. Alonso A., Martín P., Albarrán C., García P., Fernández de Simón L., Jesús Iturralde M., Fernández-Rodríguez A., Atienza I., Capilla J., García-Hirschfeld J., Martínez P., Vallejo G., García O., García E., Real P., Álvarez D., León A., Sancho M.: Challenges of DNA profiling in mass disaster investigations. Croat. Med. J. 2005, 46: 540-548. 24. Biesecker L. G., Bailey-Wilson J. E., Ballantyne J., Baum H., Bieber F. R., Brenner C., Budowle B., Butler J. M., Carmody G., Conneally P. M., Duceman B., Eisenberg A., Forman L., Kidd K. K., Leclair B., Niezgoda S., Parsons T., Pugh E., Shaler R., Sherry S. T., Sozer A., Walsh A.: DNA identifications after the 9/11 World Trade Center attack. Science 2005, 310: 1122-1123. 25. Brenner C. H., Weir B. S.: Issues and strategies in the DNA identification of World Trade Center victims. Theor. Popul. Biol. 2003, 63: 173-178. 26. Ladika S.: South Asia tsunami. DNA helps identify missing in the tsunami zone. Science. 2005, 307, 504. 27. Parsons T. J., Huel R., Davoren J., Katzmarzyk C., Miloš A., Selmanović A., Smajlović L., Coble M. D., Rizvić A.: Application of novel mini-amplicon STR multiplexes to high volume casework on degraded skeletal remains. Forensic Sci. Int.: Genetics. 2007, 1: 175-179. 28. Whitaker J. P., Clayton T. M., Urquhart A. J., Millican E. S., Downes T. J., Kimpton C. P., Gill P.: Short tandem repeat typing of bodies from a mass disaster: high success rate and characteristic amplification patterns in highly degraded samples. Biotechniques. 1995, 18: 670-677. 29. Asamura H., Fujimori S., Ota M., Fukushima H.: MiniSTR multiplex systems based on non-codis loci for analysis of degraded DNA samples. Forensic Sci. Int. 2007, 173: 7-15. 30. Meissner C., Bruse P., Mueller E., Oehmichen M.: A new sensitive short pentaplex (ShoP) PCR for typing of degraded DNA. Forensic Sci. Int. 2007, 166: 121-127. 31. Maciejewska A., Pawłowski R.: Wpływ degradacji matrycowego DNA na amplifikację loci zestawu Profiler Plus. Arch. Med. Sąd. Kryminol. 2001, 51: 217-226. Adres do korespondencji: dr hab. n. med. Witold Pepiński Zakład Medycyny Sądowej UMB ul. Waszyngtona 13 15-269 Białystok e-mail: pepinski@umwb.edu.pl