prace oryginalne Dent. Med. Probl. 2010, 47, 2, 177 181 ISSN 1644-387X Copyright by Wroclaw Medical University and Polish Dental Society Agnieszka Wójtowicz, Anna Malm Wpływ chlorheksydyny in vitro na tworzenie biofilmu przez drożdżaki Candida albicans kolonizujące ontocenozę jamy ustnej Influence of Chlorhexidine in vitro on the Ability of Biofilm Formation of Candida albicans Isolates from Oral Cavity Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej z Pracownią Diagnostyki Mikrobiologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie Streszczenie Wprowadzenie. Biofilm jest czynnikiem patogenności wielu drobnoustrojów, w tym również mikroflory kolonizującej jamę ustną, która może być czynnikiem etiologicznym tzw. zakażeń stomatologicznych. Zakażenia te mają charakter endogenny, przewlekły i często nawracający ze względu na naturalną oporność drobnoustrojów tworzących biofilm na antyseptyki, chemioterapeutyki czy antybiotyki. Jednym z czynników etiologicznych zakażeń stomatologicznych mogą być drożdżaki z rodzaju Candida, głównie Candida albicans. Cel pracy. Ocena wpływu chlorheksydyny in vitro na fazę adhezji szczepów C. albicans kolonizujących ontocenozę jamy ustnej; faza ta jest niezbędnym etapem dla wytworzenia biofilmu. Materiał i metody. Ocenie poddano 50 szczepów C. albicans mających zdolność tworzenia biofilmu, wyizolowanych z ontocenozy jamy ustnej zdrowych osób. Oznaczano MIC chlorheksydyny (najmniejsze stężenie hamujące) dla komórek planktoidalnych C. albicans mikrometodą podwójnych rozcieńczeń oraz MBIC chlorheksydyny (minimalne stężenie hamujące powstanie biofilmu), z użyciem MTT oraz menadionu; w obu metodach stosowano polistyrenowe 96-dołkowe płytki titracyjne. Wyniki. Zakres wartości MIC chlorheksydyny dla komórek C. albicans w formie planktoidalnej wynosił 0,00075 0,006%, a zakres wartości MBIC chlorheksydyny dla komórek tworzących biofilm wynosił 0,00075 0,0048%. Wnioski. Potwierdzono skuteczność obecnie stosowanych w profilaktyce stomatologicznej preparatów zawierających chlorheksydynę w stężeniach (0,1 2%), obejmujących swoim spektrum zarówno komórki C. albicans w formie planktoidalnej, jak i tworzące biofilm (Dent. Med. Probl. 2010, 47, 10, 177 181). Słowa kluczowe: chlorheksydyna, biofilm, zakażenia stomatologiczne, Candida albicans. Abstract Background. Biofilm is an important factor responsible for pathogenicity of many microorganisms, including the microflora colonizing oral cavity, which can be regarded as potential etiological agent of dental infections. These infections are endogenous, chronic and frequently recurrent due to the natural resistance of microorganisms forming a biofilm to antiseptics, chemiotherapeutics or antibiotics. One of the etiological agents of dental infections may be the yeasts from the genus Candida, mainly C. albicans. Objectives. The aim of this study was to assess the influence of chlorhexidine in vitro on adhesion of C. albicans isolates from oral cavity, adhesion phase being a necessary step of biofilm production. Material and Methods. A total of 50 C. albicans strains with the ability to form a biofilm were isolated from the oral cavity of healthy people. Determination of chlorhexidine MIC (minimum inhibitory concentration) for C. albicans planktonic cells were performed by microdilution method, while that of chlorhexidine MBIC (minimal biofilm inhibitory concentration) was performed using MTT and menadione; in both methods the polystyrene 96-well titration plates were used. Results. MIC of chlorhexidine for C. albicans cells in the planktonic form ranged from 0.00037 0.006%, while MBIC of chlorhexidine for biofilm forming cells ranged from 0.00075 0.048%. Conclusions. The results confirm the efficacy of dental preparations containing chlorhexidine in concentrations (0.1 2%) active against either planktonic or biofilm forming cells of C. albicans (Dent. Med. Probl. 2010, 47, 10, 177 181). Key words: chlorhexidine, biofilm, dental infections, Candida albicans.
178 A. Wójtowicz, A. Malm Biofilm jest czynnikiem patogenności wielu drobnoustrojów, w tym również mikroflory kolonizującej jamę ustną, która może być czynnikiem etiologicznym tzw. zakażeń stomatologicznych [1]. Zakażenia te mają charakter endogenny, przewlekły i często nawracający ze względu na naturalną oporność drobnoustrojów tworzących biofilm na antyseptyki, chemioterapeutyki czy antybiotyki. Jednym z czynników etiologicznych tych zakażeń mogą być drożdżaki z rodzaju Candida, głównie Candida albicans. Szacuje się, iż w ontocenozie jamy ustnej osób zdrowych nosicielstwo tych drożdżaków wynosi 40 75% [2]. W sprzyjających warunkach mogą być czynnikiem etiologicznym stanów zapalnych błony śluzowej jamy ustnej oraz periodontopatii. Biofilm Candida spp. jest strukturą zbudowaną z różnych form morfologicznych komórek drożdżaków (blastospor, pseudostrzępek, strzępek), przylegających do powierzchni ożywionej lub nieożywionej oraz do siebie nawzajem. Struktura ta jest otoczona polisacharydową substancją pozakomórkową [3, 4]. Tworzenie się biofilmu jest procesem złożonym i wielostopniowym. Pierwsza faza adhezja jest związana z niespecyficznymi oddziaływaniami fizycznymi, a następnie specyficznymi oddziaływaniami chemicznymi między strukturami powierzchniowymi komórek drożdżaków a ligandami obecnymi na kolonizowanym podłożu. Jest to niezbędny etap dla powstania biofilmu [5]. Chlorheksydyna jest wykorzystywana w praktyce lekarskiej już od 1957 roku, jako jeden z najczęściej używanych antyseptyków w stomatologii. Wyniki wielu prac potwierdzają jej najszerszy zakres działania przeciwgrzybiczego w porównaniu do innych antyseptyków stosowanych w stomatologii; wyróżnia się szczególnie dużą skutecznością w stosunku do C. albicans [6]. Udowodniono również jej właściwości przeciwbakteryjne w stosunku do większości bakterii bytujących w jamie ustnej [6 8]. Chlorheksydyna, należąca do grupy bisguandiów, ma silny ładunek dodatni, co powoduje łączenie się tego antyseptyku z ujemnie naładowaną błoną komórkową drożdżaków, prowadząc do zaburzeń osmotycznych i lizy komórki. Związek ten ma również zdolność do łączenia się z powierzchnią błony śluzowej jamy ustnej i pelikulą na powierzchni zębów, stopniowo ulegając uwalnianiu, przedłużając swoje działanie antyseptyczne nawet do 24 godzin [6, 9 11]. Chlorheksydyna występuje w postaci płynnej, jako wodny roztwór dwuglukonianu chlorheksydyny, ale również jako składnik preparatów złożonych, jest dostępna w postaci kremów, lakierów, żeli i tabletek do ssania. Chlorheksydyna jest ważnym środkiem wspomagającym w leczeniu stanów zapalnych przyzębia, profilaktyce próchnicy oraz w leczeniu kandydozy jamy ustnej, jako uzupełnienie terapii antymikotykami. Liczne doniesienia wskazują na jej szczególną rolę w leczeniu endodontycznym. Celem tego leczenia jest uzyskanie wolnego od drobnoustrojów światła kanału korzeniowego, gdzie poza mechanicznym opracowaniem kanału używa się wielu środków do płukania kanału, w tym chlorheksydynę [2, 6, 9, 10]. Antyseptyk ten znalazł zastosowanie również jako składnik wkładki dokanałowej i środek do dezynfekcji materiałów stosowanych do wypełnienia kanałów. Fakt łączenia się z twardymi tkankami zębów umożliwia uzyskanie długotrwałego dużego stężenia leku w kanale korzeniowym, co przyczynia się do zwiększenia skuteczności terapii. Kolejną ważną cechą jest jej mała szkodliwość dla tkanek okołowierzchołkowych i brak działania toksycznego. Chlorheksydyna skutecznie eliminuje Enterococcus faecalis oraz C. albicans, które aż w 75% przypadków są odpowiedzialne za rekolonizację kanału i niepowodzenia w leczeniu endodontycznym, dlatego też w tych sytuacjach klinicznych jest polecane zastosowanie 2% chlorheksydyny [11]. Celem pracy była ocena wpływu chlorheksydyny in vitro na fazę adhezji, będącą niezbędnym etapem dla wytworzenia biofilmu przez szczepy C. albicans izolowane z ontocenozy jamy ustnej. Materiał i metody Materiał biologiczny W badaniach użyto 50 szczepów C. albicans o potwierdzonej zdolności do tworzenia biofilmu, wyizolowanych z ontocenozy jamy ustnej zdrowych osób z różnych grup wiekowych. Osoby uczestniczące w badaniach lub ich opiekunowie wyrazili zgodę na pobranie wymazu z błony śluzowej jamy ustnej. Materiałem wyjściowym była 18 h hodowla drożdżaków w temp. 37 o C w płynnym podłożu Sabourauda suplementowanym 100 mm glukozą. Określenie najmniejszego stężenia hamującego chlorheksydyny wobec komórek planktoidalnych C. albicans Wartości MIC (minimal inhibitory concentration) chlorheksydyny dla komórek planktoidalnych C. albicans zostały oznaczone mikrometodą seryjnych rozcieńczeń w podłożu płynnym Sabourauda, z użyciem polistyrenowych 96-dołkowych płytek titracyjnych. Wykonywano wiele seryjnych
Chlorheksydyna in vitro a adhezja C. albicans 179 rozcieńczeń chlorheksydyny w płynnym podłożu Sabourauda i do każdego dołka na płytce titracyjnej dodawano 2 µl zawiesiny badanych drożdżaków o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, przygotowanej w tym samym podłożu. Następnie płytki inkubowano 48 h w temp. 37 o C, po czym dokonywano odczytu absorbancji przy długości fali 490 nm (A 490 ) za pomocą czytnika ELISA ELx800 (BioTek). Za wartość MIC chlorheksydyny uznawano najmniejsze stężenie, przy którym nie obserwowano wzrostu drożdżaków w postaci zmętnienia, w porównaniu z próbą kontrolną zawierającą tylko podłoże Sabourauda oraz antyseptyk. Dla każdego szczepu oznaczenie wartości MIC wykonywano w dwóch powtórzeniach. Określenie najmniejszego stężenia chlorheksydyny hamującego fazę adhezji w trakcie formowanie się biofilmu C. albicans (MBIC minimal biofilm inhibitory concentration) W celu określenia wpływu chlorheksydyny na fazę adhezji wykorzystywano również 96-dołkowe płytki titracyjne oraz MTT-bromek 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H tetrazoliowy. Z użyciem płytek titracyjnych wykonywano wiele seryjnych rozcieńczeń chlorheksydyny w płynnym podłożu Sabourauda. Wyjściowe stężenia chlorheksydyny wynosiły od 0,25 MIC do 4 MIC oznaczonych dla komórek planktoidalnych C. albicans. Na płytki titracyjne nanoszono 100 µl zawiesiny badanych drożdżaków o gęstości 4 w skali McFarlanda, przygotowanej w tym samym podłożu. Płytki inkubowano 1,5 h w temp. 37 o C w celu zahamowania adhezji komórek drożdżaków. Po fazie adhezji odpłukiwano płytki dwukrotnie za pomocą PBS (zbuforowanej soli fizjologicznej), usuwając komórki, które nie uległy adhezji oraz antyseptyk. Następnie dodawano 100 µl podłoża Sabourauda suplementowanego 100 mm glukozą i inkubowano 48 h w temp. 37 o C. Po trzykrotnym przemyciu powstałego biofilmu z użyciem PBS dodawano 40 µl MTT o stężeniu 1 mg/ml, 2 µl 0,4 mm roztworu menadionu oraz 158 µl PBS, w celu wizualizacji powstałego biofilmu. MTT redukuje się do fioletowego formazanu, co jest wyrazem aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej żywych komórek. Po 3 h inkubacji w temp. 37 o C dokonywano pomiaru absorbancji przy długości fali 490 nm (A 490 ) za pomocą czytnika ELISA ELx800 (BioTek) po przeniesieniu 100 µl roztworu do pustego dołka płytki titracyjnej [12]. Za wartość MBIC chlorheksydyny uznawano najmniejsze stężenie, przy którym wartość A 490 była porównywalna z wartością A 490 próby kontrolnej (podłoże Sabourauda z antyseptykiem). Dla każdego szczepu oznaczenie wartości MBIC wykonywano w dwóch powtórzeniach. Wyniki Jak wskazuje ryc. 1, zakres wartości MIC dla komórek C. albicans w formie planktoidalnej wynosił 0,00037 0,006%, a zakres wartości MBIC chlorheksydyny dla komórek tworzących biofilm, czyli stężeń hamujących fazę adhezji, wynosił 0,00075 0,048%. 50 45 komórki planktoidalne planktonic cells biofilm 40 35 liczba szczepów number of strains 30 25 20 15 10 5 0 0,00037 0,00075 0,0015 0,003 0,006 0,012 0,024 0,048 stężenie chlorheksydyny (%) chlorhexidine concentration (%) Ryc. 1. Porównanie aktywności chlorheksydyny in vitro wobec komórek Candida albicans planktoidalnych (MIC) i tworzących biofilm (MBIC) Fig. 1. Comparison of chlorhexidine activity in vitro against planktonic (MIC) and biofilm forming (MBIC) cells of Candida albicans
180 A. Wójtowicz, A. Malm Tabela 1. Porównanie aktywności chlorheksydyny in vitro wobec komórek Candida albicans planktoidalnych i tworzących biofilm Table 1. Comparison of chlorhexidine activity in vitro against planktonic and biofilm forming cells of Candida albicans Parametry (Parameters) Zgodnie z danymi przedstawionymi w tabeli 1, wartość MBIC 50, czyli stężenia hamującego fazę adhezji 50% szczepów, była 4-krotnie wyższa niż wartość MIC 50 dla komórek planktoidalnych, czyli stężenia hamującego wzrost 50% szczepów. Wartość MBIC 90 (stężenie hamujące fazę adhezji 90% szczepów) była dwukrotnie wyższa od wartości MIC 90 dla komórek planktoidalnych (stężenie hamujące wzrost 90% szczepów). Omówienie Stężenie chlorheksydyny (Chlohexidine concentration) % MIC 50 0,00075 MIC 90 0,003 Zakres MIC 0,00037 0,006 MBIC 50 0,003 MBIC 90 0,006 Zakres MBIC 0,00075 0,048 Jednym z czynników etiologicznych zakażeń stomatologicznych mogą być drożdżaki z rodzaju Candida, głównie C. albicans. Drożdżak ten jest uważany za jeden z najważniejszych drobnoustrojów odpowiedzialnych za niepowodzenia w leczeniu endodontycznym [2, 6]. Chlorheksydyna odznacza się najwyższą skutecznością w porównaniu do innych preparatów stosowanych w eradykacji tego drożdżaka z kanałów zębowych. W leczeniu endodontycznym stosuje się stężenia tego antyseptyku 0,02 2%, do odkażania jamy ustnej są zalecane stężenia 0,1 0,2%, a do odkażania płytkowych uzupełnień protetycznych 0,2 1% [6]. Wiadomo, iż C. albicans będący przyczyną zakażeń stomatologicznych znajduje się nie tylko na płytce nazębnej, ale także na grzbietowej części języka czy na błonie śluzowej policzków, a najważniejszym czynnikiem wirulencji tych drożdżaków jest zdolność tworzenia biofilmu. Zjawisko formowania biofilmu jest obecnie poważnym problemem stomatologicznym, a poszukiwanie substancji aktywnych wobec biofilmu jest pilną potrzebą współczesnej stomatologii; istnieje konieczność stosowania odpowiednich antyseptyków jako uzupełnienie mechanicznych zabiegów usuwania biofilmu. W badaniach własnych oceniono wpływ chlorheksydyny najpopularniejszego w stomatologii antyseptyku na fazę adhezji szczepów C. albicans izolowanych z ontocenozy jamy ustnej. Na pierwszym etapie pracy określono wrażliwość na chlorheksydynę komórek planktoidalnych C. albicans (MIC = 0,00037 0,006%). Przedstawione wyniki zgodne są z danymi innych autorów. Wg Patel et al. [13] zakres MIC chlorheksydyny dla tego typu komórek wynosił 0,008 0,16 mg\ml (0,0008 0,016%). Doniesienia te oraz wyniki własne potwierdzają skuteczność stężeń tego antyseptyku stosowanych w preparatach stomatologicznych wobec komórek planktoidalnych C. albicans. Liczne dane z piśmiennictwa wskazują również na skuteczność chlorheksydyny w stosunku do biofilmu, tworzonego przez różne drobnoustroje, w tym przez C. albicans [6, 7, 14, 15]. Wrażliwość biofilmu C. albicans na ten antyseptyk zależy jednak od stopnia dojrzałości tej struktury. Badania korelacji między stopniem dojrzałości biofilmu a MIC chlorheksydyny wskazują, iż wraz z dojrzewaniem biofilmu wartości te rosną, a struktura dojrzałego biofilmu może wykazywać całkowitą oporność na ten antyseptyk nawet w stężeniu 2% [16]. Dane przedstawione w niniejszej pracy wskazują na skuteczność działania chlorheksydyny na fazę adhezji, stanowiącą wstępny etap tworzenia biofilmu, już w stężeniach 0,048%. Różnice w stężeniach chlorheksydyny hamujących tworzenie biofilmu w zależności od stopnia jego rozwoju mogą być wynikiem oddziaływania chlorheksydyny jedynie na powierzchniowe warstwy biofilmu i jej ograniczonej penetracji w tę strukturę [17]. Należy zwrócić uwagę na monitorowanie oporności szczepów C. albicans na ten antyseptyk ze względu na powszechność jego stosowania i długi czas aplikacji sprzyjający selekcji szczepów o obniżonej wrażliwości. Zjawisko narastania oporności wobec chlorheksydyny opisywano np. po długotrwałych 2-tygodniowych cyklach leczniczych. Wnioski Uzyskane rezultaty potwierdzają skuteczność obecnie stosowanych w profilaktyce stomatologicznej preparatów zawierających chlorheksydynę w stężeniach obejmujących swoim spektrum zarówno komórki C. albicans w formie planktoidalnej, jak i tworzące biofilm. Należy jednak monitorować stopień oporności szczepów C. albicans na ten powszechnie używany antyseptyk w stomatologii.
Chlorheksydyna in vitro a adhezja C. albicans 181 Piśmiennictwo [1] Suci P. A., Tyler B. J.: Action of chlorhexidine digluconate against yeast and filamentous forms in an early stage Candida albicans biofilm. Antimicrob. Agents. Chemother. 2002, 46, 3522 3531. [2] Miranda T. T., Vianna C. R., Rodrigues L., Monteiro A. S., Rosa C. A., Correa A.: Diversity and frequency of yeasts from the dorsum of the tongue ad necrotic root canals associated with primary apical periodontitis. Int. Endod. J. 2009, 42, 839 844. [3] Mnichowska-Polanowska M., Giedrys-Kalemba S.: Metody i techniki stosowane w badaniach nad biofilmem Candida. Mikol. Lek. 2009, 16, 238 244. [4] Dorocka-Bobkowska B., Konopka K.: Powstawanie biofilmu Candida i jego znaczenie w patogenezie zakażeń przewlekłych przegląd piśmiennictwa. Dent. Med. Prob. 2003, 40, 405 410. [5] Strużycka I., Stępień I.: Biofilm nowy sposób rozumienia mikrobiologii. Nowa Stomatol. 2009, 14, 3, 85 89. [6] Mohammadi Z., Abbott P.: The properties and applications of chlorhexidine in endodontics. Int. Endod. J. 2009, 42, 288 302. [7] Takeuchi Y., Guggenheim B., Filieri A., Baehni P.: Effect of chlorhexidine/thymol and fluoride varnishes on dental biofilm formation in vitro. Eur. J. Sci. 2007, 115, 468 472. [8] Filoche S. K., Soma K., Sissons C. H.: Antimicrobial effects of essential oils in combination with chlorhexidine digluconate. Oral Microbiol. Immuol. 2005, 20, 221 225. [9] Malicka B., Ziętek M., Grzebieluch W.: Zastosowanie chlorheksydyny w stomatologii. Dent. Med. Prob. 2005, 42, 497 505. [10] Turk B. T., Sen B. H., Ozturk T.: In vitro antimicrobial activity of calcium hydroxide with different vehicles against Enterococcus faecalis and Candida albicans. J. Endod. 2007, 108, 297 301. [11] Wujec P., Pawlicka H.: Standardowe środki płuczące polecane w leczeniu endodontycznym przegląd piśmiennictwa. Dent. Med. Probl. 2008, 45, 466 472. [12] Zaw M. T., Samaranayake Y. H., Samaranayake L.P.: In vitro biofilm formation of Candida albicans and nonalbicans Candida species under dynamic and anaerobic conditions. Arch. Oral Biol. 2007, 52, 761 767. [13] Patel M., Coogan M.: Antifungal activity of the plant Dodonaea viscose var. angustifolia on Candida albicans from HIV-infected patients. J. Ethnopharmacol. 2008, 118, 173 176.14. [14] Redding S., Bhatt B., Rawls R., Siegel G., Scott K., Lopez-Ribot J.: Inhibition of Candida albicans biofilm formation on denture material. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 2009, 107, 669 672. [15] Pusateri C., Monaco E., Edgerton M.: Sensitivity of Candida albicans biofilm cells grown on denture acrylic to antifungal proteins and chlorhexidine. Arch. Oral Biol. 2009, 54, 588 594. [16] Chandra J., Kuhn D. M., Mukherjee P. K., Hoyer L. L., McCormick T., Ghannoum M. A.: Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. J. Bacteriol. 2001, 183, 5385 5394. [17] Kittel E., Kamysz E., Bartoszewicz M., Junka A., Smutnicka D., Mączyńska B., Kamysz W., Kittel M.: Biofilm infekcyjny i płytka bakteryjna w zapaleniu przyzębia i tkanek okołowierzchołkowych: procedury zabiegowe i okołozabiegowe ograniczające rekolonizację wyniki badań. Sepsis 2009, 2, 237 240. Adres do korespondencji: Agnieszka Wójtowicz ul. Chodźki 1 20-093 Lublin tel./faks: +48 81 742 37 72 e-mail: mikrospszw@wp.pl Praca wpłynęła do Redakcji: 4.06.2010 r. Po recenzji: 21.06.2010 r. Zaakceptowano do druku: 21.06.2010 r. Received: 4.06.2010 Revised: 21.06.2010 Accepted: 21.06.2010