PRODUKTY FARMACEUTYCZNE - PORÓWNANIE METOD CHEMICZNYCH I BIOTECHNOLOGICZNYCH Dominik Jańczewski
PLAN WYKŁADU Potrzeby przemysłu farmaceutycznego Zmierzch tradycyjnej farmacji Wady i zalety różnych sposobów produkcji Historia metod biotechnologicznych Przykłady produktów Kwas cytrynowy, Paclitaxel, Insulina
POTRZEBY PRZEMYSŁU FARMACEUTYCZNEGO Klasyczne substancje czynne (API) - małe i średnie molekuły organiczne. Screening - poszukiwanie substancji czynnych Problemy z utrzymaniem produktywności i dużej wartości dodanej firm farmaceutycznych, nowe generacje klasycznych leków nie są dużo lepsze od poprzedniej generacji Nowa medycyna: Terapie genetyczne, Terapie z użyciem komórek macierzystych, Terapie z użyciem peptydów i białek. Zrozumienie choroby na poziomie biochemicznym i genetycznym, mniej przypadkowe poszukiwanie terapii Klasyczne API wypierane przez nowe sposoby leczenia
POTRZEBY PRZEMYSŁU FARMACEUTYCZNEGO Klasyczne substancje czynne (API) - małe i średnie molekuły organiczne. Nowa medycyna: Terapie genetyczne, Terapie z użyciem komórek macierzystych, Terapie z użyciem peptydów i białek. Dostępne sposoby produkcji: Synteza organiczna Biosynteza Metody kombinowane - biotransformacje Klasyczne API wypierane przez nowe sposoby leczenia
BIOTECHNOLOGIA historia Rachunek za piwo z Alu, Sumeryjska tabliczka z 2050 r p.n.e. 7000 p.n.e. pierwsza fermentacja zboża - produkcja piwa (Mezopotamia) 6000 p.n.e. produkcja sera i jogurtu z użyciem bakterii (Mezopotamia) 4000 p.n.e. wypiek chleba wspomagany fermentacyjnie (Egipt) 500 p.n.e. fermentowana soja używana jako antybiotyk (Chiny) 1862 Louis Pasteur odkrywa udział bakterii w procesie fermentacji 1928 Alexander Fleming zaobserwował antybakteryjne działanie penicylin w pleśni 1941 Pfizer pierwsza przemysłowa metoda fermentacyjna pozwalająca na otrzymywanie penicyliny 1982 Humulin pierwsza syntetyczna insulina ludzka, produkowana masowo przez genetycznie modyfikowane bakterie
European Biotech week
BIOTECHNOLOGIA historia European Biotech week
BIOTECHNOLOGIA historia European Biotech week
BIOTECHNOLOGIA typowe produkty Alkohole (etanol, butanol, glicerol). Kwasy organiczne (octowy, cytrynowy, mlekowy, glukonowy). Witaminy. Hormony steroidowe. Ketony (aceton). Aminokwasy. Antybiotyki. Największy wolumen produkcji - biopaliwa Największa wartość dodana - substancje czynne (API)
BIOTECHNOLOGIA vs METODY CHEMICZNE Metody Chemiczne Synteza chemiczna: małe ograniczenia co do warunków syntezy, większy zakres temperatur, Wydzielanie produktu: klasyczne operacje jednostkowe: krystalizacja, destylacja. Metody Biotechnologiczne Synteza: zazwyczaj łagodne warunki reakcji, małe zanieczyszczenie środowiska. Wydzielenie produktu: izolacja z roztworów o dużym rozcieńczeniu
KWAS CYTRYNOWY Jak go otrzymać? Izolacja z owoców. Metoda mikrobiologiczna (biotechnologiczna). Synteza chemiczna. Pierwszy raz wyizolowany z owoców w 1784 przez Karla Wilhelma Scheele
KWAS CYTRYNOWY izolacja z owoców Metoda istotna do lat 30 XX wieku. Do otrzymania 1 kg kwasu zużywano 30 40 kg cytryn. Zawartość kwasu w cytrynie to około 8%. Jaka jest wydajność procesu?
KWAS CYTRYNOWY izolacja z owoców metoda laboratoryjna Wyciśnięcie soku z cytryny. Dodatek zasady sodowej i przesączenie. Dodatek CaCl 2, ogrzanie i odsączenie cytrynianu wapnia. Krystalizacja i odsączenie kryształów kwasu cytrynowego. Odsączenie siarczanu wapnia. Dodatek kwasu siarkowego.
KWAS CYTRYNOWY roczna produkcja Początki wieku XX 10 tys. ton (wszystko poprzez izolację z cytryn). Rok 1933 10 400 ton (z czego zaledwie 1800 ton z cytryn). Obecnie (2007) 1,6 mln ton (znikoma część to produkcja z cytryn). Zastosowania: przemysł spożywczy, farmaceutyczny. Przemysłowe zastosowania: plastyfikatory, surfaktanty, oczyszczanie metali, nadruki na tkaninach i inne Cena: 1 / kg
KWAS CYTRYNOWY Produkcja biotechnologiczna Wynik zakłóceń w metabolizmie mikroorganizmów. Najczęściej używane są selekcjonowane szczepy Aspergillus niger. Istotny skład medium hodowlanego.
KWAS CYTRYNOWY Metody hodowli Hodowla w podłożach stałych (marginalna). Hodowla powierzchniowa (klasyczna). Hodowla wgłębna.
Zawiesina pohodowlana Woda KWAS CYTRYNOWY wydzielanie i oczyszczanie Ca(OH) 2 Ca(OH) 2 FILTRACJA Przemywanie i wyciskanie grzybni STRĄCANIE SZCZAWIANU FILTRACJA STRĄCANIE CYTRYNIANU Osad Grzybnia FILTRACJA Przesącz H 2SO 4 ROZPUSZCZANIE CYTRYNIANU FILTRACJA Osad SORPCJA JONITY KRYSTALIZACJA KWAS CYTRYNOWY
KWAS CYTRYNOWY pełna synteza chemiczna kwasu cytrynowego Wiele patentów. Różne substraty: izotetralina, kwas szczawiooctowy, kwas maleinowy, kwas fumarowy, aceton i dwutlenek węgla Metody nie są atrakcyjne w porównaniu z procesami fermentacyjnymi
BIOTECHNOLOGIA
PACLITAXEL Chemoterapeutyk, jedna z bardziej skomplikowanych molekuł stosowana obecnie w farmacji Większą komplikację wykazują jedynie biomakromolekuły (biopolimery)
PACLITAXEL (taxol) Właściwości przeciwnowotworowe ekstraktu z kory Cisu krótkolistnego /Pacific yew/ odkryto w 1963 Związek wyizolowano po raz pierwszy w 1969 a jego strukturę poprawnie zidentyfikowano w 1971 Potrzeba 1,200 kg suchej kory aby wyizolować 10 kg taxolu
PACLITAXEL (taxol) Taxol wykazuje silne selektywne właściwości przeciw komórkom nowotworowym Jest stosowany do chemioterapii nowotworów płuc, piersi, pęcherza, prostaty, jajników oraz czerniaka złośliwego W czasie badań klinicznych stosowano związek ekstrahowany z kory cisu krótkolistnego - z powodu małych zasobów surowca powstały silne obiekcje środowiskowe przeciwko wprowadzaniu tego leku
PACLITAXEL synteza chemiczna Robert A. Holton (Florida State University) - pierwszy ukończył całkowitą syntezę chemiczną Taxolu w 1994 roku (prawie równocześnie wyniki opublikował również Nicolau) Projekt badawczy rozpoczęto w 1982. Cała synteza obejmuje 37 etapów, średnia wydajność z etapu 93% Dotychczas opublikowano 7 metod syntezy chemicznej taxolu żadna nie ma znaczenia produkcyjnego
PACLITAXEL synteza przemysłowa Produkcyjną metodę o praktycznym zastosowaniu opracował R. A. Holton w 1989. Metoda jest półsyntetyczna (semisynthetic) wykorzystuje 10-deacetylbaccatin wyizolowaną z igieł cisu europejskiego (większe ilości niż w korze z cisu krótkolistnego Produkcję uruchomił Bristol-Myers Squibb Koszt licencji 200 m USD, wielkość rynku 2006 ~ 3.6 mld USD, początkowa cena API ~ 5 M / kg obecnie produkt generyczny ~ 100 k / kg
PACLITAXEL biosynteza Obecnie w trakcie badań - główne poszukiwania - modyfikacje genetyczne bakterii w celu otrzymania odpowiedniego prekursora do syntezy Produkt 3 jest już otrzymywany z genetycznie modyfikowanych bakterii Escherichia coli w skali kilogramowej Obecnie są również zaawansowane badania nad wykorzystaniem hodowlanych linii komórkowych kory cisu krótkolistnego - komórki produkują bezpośrednio pożądany lek
BIOTECHNOLOGIA kiedy stosować 80% sukcesu leży po stronie odpowiedniego szczepu Kiedy mamy wydajny szczep produkujący pożądany produkt z opłacalną wydajnością opłaca się produkować nawet małe nieskomplikowane molekuły (kwas cytrynowy, kwas mlekowy) Nawet jeżeli mamy szczep produkujący pożądaną substancję ważne jest zwiększenie wydajności szczepu np: dzikie szczepy wydzielają do 1g pencyliny w m 3, modyfikowane szczepy są w stanie produkować do 50 kg/m 3 Gdy nie mamy odpowiedniego szczepu - wysokie nieprzewidywalne koszty modyfikacji organizmów i pozyskania organizmu do konkretnej transformacji chemicznej. Należy rozważyć zakup szczepu. Jeżeli produkt nie jest typowym metabolitem trzeba zrobić/pozyskać odpowiedni organizm. Zazwyczaj opłacalne tylko dla produkcji w dużej skali bądź o wysokiej wartości dodanej z uwagi na duże koszty i niepewność badań.
BIOTECHNOLOGIA kiedy stosować Inne czynniki: Gdy są problemy z uzyskaniem steroizomerów klasycznymi metodami. Metody fermentacyjne, nie ma problemu racemicznych produktów - synteza jest sterospecyficzna. Gdy mamy szczególnie skomplikowaną strukturę nieopłacalną do otrzymania w sposób syntetyczny, wieloetapowa synteza, np: struktury z dużą liczbą centrów chiralnych. Ostateczna decyzja - zawsze kalkulacja kosztów W pewnych sytuacjach koszty dla obu metod syntezy będą zbliżone bądź zależne od lokalnych uwarunkowań.
INSULINA Proteina, hormon peptydowy działający w całym organizmie i odpowiedzialny za regulację metabolizmu cukrów, 51 aminokwasów, masa 5808 Da. Insulina reguluje absorbcje glukozy z krwi do mięśni i tkanki tłuszczowej U ssaków insulina jest produkowana przez trzustkę, zaburzenia w produkcji insuliny powodują cukrzycę Do czasu wynalezienia dostępnej insuliny odzwierzęcej cukrzyca typu I była chorobą śmiertelną
INSULINA i cukrzyca 1500 p.n.e. (Egipt) - pierwszy opis cukrzycy identyfikujący wysokie stężenie cukru w moczu 1889 - Joseph von Mering i Oskar Minkowski pierwsi zidentyfikowali związek pomiędzy trzustką i cukrzycą 1921 - Frederick Banting and Charles Best wyizolowali roztwór insuliny zwierzęcej i utrzymali przy życiu psa z usuniętą trzustką przez podawanie mu insuliny 1922-14 latek, Leonard Thompson umierający w Toronto General Hospital był pierwszą osobą, której podano ekstrakt z trzustki. Przeżył 32 lata biorąc insulinę odzwierzęcą 1923 - Nagroda Nobla za wyizolowanie insuliny Frederick Banting (z prawej) i Charles Best, 1924
INSULINA zwierzęca Eli Lilly & Company rozpoczęła produkcję insuliny wykorzystując odkrycie Besta i Bantinga, stosując ekstrakt z trzustek świńskich i krowich Produkcja bardzo uciążliwa wymaga 1 tony produktów zwierzęcych do wyprodukowania 100 g insuliny. Problem z zapewnieniem świeżych substratów i ciągłości dostaw Drobne różnice w strukturze oraz zanieczyszczenia powodują reakcje uboczne na insulinę odzwierzęcą. Cały czas produkowana ale o małym znaczeniu
INSULINA ludzka syntetyczna 1978 - naukowcy z biotechnologicznej firmy Genentech wprowadzili ludzki gen kodujący syntezę insuliny do szczepu Esherichia coli bacteria 1982 - Genentech we współpracy z Elli Lilly wprowadza na rynek insulinę otrzymywaną biotechnologicznie (Humulin) - jest to pierwszy lek powstały dzięki rekombinacji DNA Początkowo przyjęta sceptycznie przez środowisko medyczne, obecnie całkowicie wyparła insulinę odzwierzęcą, w Polsce Bioton Modyfikacje genetyczne umożliwiają wprowadzenie analogów insuliny np. lispro (Humalog) and insulin glargine (Lantus). Modyfikowanych protein o specyficznym działaniu ukierunkowanym na inne schorzenia Cukrzyca typu I jest świetną chorobą z perspektywy biznesu farmaceutycznego (nie da się wyleczyć) - rynek insuliny to obecnie 17 mld (2012) Cena za kg = 50-100 k / kg ; w leku 0.5-2 M / kg
INSULINA produkcja Elli Liily Wykorzystywane są modyfikowane szczepy Escherichia coli Do tego etapu fragment DNA odpowiedzialny za produkcję insuliny jest zablokowany białkiem represorowym. Dodatek induktora pozwala na rozpoczęcie syntezy Inokulacja Namnażanie Indukcja syntezy Wirowanie kultur bakteryjnych Krystalizacja Chromatografia kolumnowa Usunięcie C- peptydu Ekstrakcja proinsuliny z masy bakteryjnej 5 ostatnich operacji to wydzielanie i oczyszczanie
INSULINA synteza chemiczna Insulina nie jest dużym białkiem (51 aminokwasów) - możliwa jest synteza chemiczna na podłożu stałym Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS), krok po kroku doklejamy kolejne aminokwasy, można otrzymać białka do 100 aminokwasów Length Coupling Efficiency Coupling Efficiency 1 0.995 0.96 5 0.98 0.85 10 0.96 0.69 15 0.93 0.56 20 0.91 0.46 25 0.89 0.38 30 0.86 0.31 35 0.84 0.25 40 0.82 0.20 45 0.80 0.17 50 0.78 0.14 55 0.76 0.11 60 0.74 0.09 65 0.73 0.07 70 0.71 0.06
BIOTECHNOLOGIA vs METODY CHEMICZNE koszty Metody Chemiczne Synteza: koszty procesowe zależne od warunków reakcji, mogą być zarówno po stronie surowców jak i energii. Względnie niskie koszty operacji jednostkowe, ale często wiele etapów syntezy. Wydzielenie klasyczne, zazwyczaj duża zawartość produktu w produkcie surowym Metody Biotechnologiczne Synteza: zazwyczaj łagodne warunki reakcji, małe zanieczyszczenie środowiska, niskie temperatury, małe zużycie energii, Długie czasy bio-syntzy, duże rozcieńczenia, niska wydajność z jednostki objętości aparatów Wydzielenie - często kłopotliwe typowo wymaga zatężania produktu surowego. W układach z fermentorami periodycznymi kłopotliwe oddzielenie biomasy od roztworu produktu