Limfocyty T regulacyjne i ich znaczenie w alergii pokarmowej u dzieci

180 Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 180-188 Limfocyty T regulacyjne i ich znaczenie w alergii pokarmowej u dzieci Regulatory T cells and their role in food allergy in children ANETA KROGULSKA Klinika Alergologii, Gastroenterologii i Żywienia Dzieci Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Streszczenie Limfocyty T regulacyjne (Treg) odgrywają zasadniczą rolę w kontrolowaniu nabytej odporności immunologicznej oraz w utrzymywaniu tolerancji na własne i obce białka. Uważa się, że zaburzenia tych szlaków immunologicznych odgrywają główną rolę w patogenezie wielu chorób immunologicznych, w tym alergicznych. Chociaż liczne badania wykazują niedobór limfocytów regulacyjnych bądź osłabienie ich funkcji w chorobach alergicznych, to wyniki innych badań są sprzeczne. W oparciu o przegląd najnowszej literatury w niniejszym artykule przedstawiono aktualne poglądy na temat nazewnictwa, podziału, charakterystyki molekularnej i mechanizmu działania limfocytów T regulacyjnych oraz przedstawiono ich znaczenie w chorobach alergicznych zarówno u dorosłych, jak i u dzieci, ze szczególnym uwzględnieniem alergii na pokarmy. Poznanie mechanizmów zaburzeń układu immunologicznego, leżących u podstaw chorób alergicznych, może przyczynić się do poprawy leczenia, profilaktyki, a tym samym odległego rokowania. Wydaje się, że rozwój wiedzy na temat limfocytów Treg CD4+CD25+ umożliwi opracowanie nowych strategii terapeutycznych, istotnych szczególnie w odniesieniu do alergii pokarmowej jako pierwszej manifestacji atopii u dzieci. Słowa kluczowe: limfocyty Treg, alergia na pokarmy Summary Regulatory T (Treg) cells play a key role in controlling adaptive immune response and maintaining tolerance to innocuous self- and environmental proteins. There is a growing speculation that impairment in these pathways could be central in pathogenesis of many immune diseases, including allergic diseases. Although several studies suggest deficiencies in allergen-specific Treg cell numbers or function in allergic diseases, others have shown the opposite. Based on a review of recent literature, this article presents current views on naming, distribution, molecular characterization, mechanism of the action of regulatory T lymphocytes, and shows their importance in allergic diseases in both adults and children, with particular reference to food allergy. Understanding the mechanisms of immune system disorders that underly allergic diseases may help improve the treatment, prevention, and thus long-term prognosis. It seems that the development of knowledge on Treg CD4+CD25+ cells will enable the development of new therapeutic strategies, so important especially in relation to food allergy, as the first manifestation of atopy in children. Key words: Treg lymphocytes, food allergy Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 180-188 www.alergia-astma-immunologia.eu Przyjęto do druku: 19.10.2010 Adres do korespondencji / Address for correspondence dr med. Aneta Krogulska ul. Sporna 36/50 91-738 Łódź tel./fax: 042 61 777 92 e-mail: anetkrog@poczta.onet.pl Wykaz skrótów: CD122 (interleukin 2 receptor, beta) łańcuch b receptora IL-2 CD27 (tumor necrosis factor receptor, TNFR) receptor czynnika marwicy guza CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen-4) antygen 4- cytotoksycznego limfocytu T FOXP3 (forkhead box p3) czynnik transkrypcyjny FOXP3 GITR (glucocorticoid-induced TNF receptor) receptor czynnika martwicy nowotworu IPEX (immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome) zespół immunodysregulacji, poliendokrynopatii, enteropatii, związany z chromosomem X LAG-3 (lymphocyte-activation gene 3) gen 3 aktywacji limfocytów NFAT (nuclear factor of activated T cells) czynnik jądrowy aktywowanych limfocytów T TCR (T-cell receptor) receptor limfocytów T TGFβ (transforming growth factor β) transformujący czynnik wzrostu β TSLP (thymic stromal lymphopoietin) limfopoetyna zrębu grasicy XLAAD (X-linked autoimmunity-allergic dysregulation syndrome) związany z chromosomem X zespół dysregulacji autoimmunologiczno-alergicznej

Krogulska A Limfocyty T regulacyjne i ich znaczenie w alergii pokarmowej u dzieci 181 W ostatnich latach coraz więcej uwagi w badaniach nad mechanizmami rozwoju chorób alergicznych poświęca się limfocytom T regulacyjnym (Treg), mającym podstawowe znaczenie w nadzorowaniu odpowiedzi immunologicznej. Po raz pierwszy subpopulacja limfocytów pomocniczych, mająca zdolność hamowania funkcji innych komórek immunokompetentnych, została opisana w latach 70. XX wieku [1]. Przełomem okazały się prace Sakaguchiego, który w 1995 roku odkrył, że komórkami odpowiedzialnymi za hamowanie rozwoju autoimmunizacji u myszy są limfocyty T pomocnicze, mające na swojej powierzchni receptor dla łańcucha α IL-2 (CD25), czyli CD4+CD25+ [2]. Podobną fenotypowo subpopulację limfocytów znaleziono również u ludzi [3]. Nazewnictwo i podział limfocytów T regulatorowych Komórki regulatorowe stanowią heterogenną subpopulację limfocytów T mających zdolność hamowania funkcji tych komórek, które w odpowiedzi immunologicznej pełnią funkcje wykonawcze, tj. efektorowe. Limfocyty Treg mają zdolność hamowania aktywacji układu immunologicznego, prowadząc do utrzymywania immunologicznej homeostazy i tolerancji na własne antygeny. Wśród limfocytów Treg wyodrębnia się naturalne komórki regulatorowe (ntreg) (CD4+CD25+) oraz indukowane (adaptacyjne, aktywowane) Treg (itreg) (Tr1, Th3, CD4+CD25-), które nabywają zdolności immunosupresyjnych odpowiednio podczas różnicowania w grasicy lub na obwodzie (tab. I). Według niektórych naukowców za właściwe komórki regulatorowe uznaje się limfocyty T CD4+CD25+ z wysoką ekspresją cząsteczki CD25, tzn. Treg CD4 + CD25 + (CD4+CD25high) [4,5]. Subpopulacja ta stanowi u ludzi ok. 1-2% krążących limfocytów CD4+. Niektórzy autorzy posługują się sformułowaniami: naturalnie występujące limfocyty Treg CD4 + CD25 + lub limfocyty Treg z konstytutywną ekspresją CD25 +, podkreślając ich odrębność w stosunku do aktywowanych limfocytów TCD4 +. Limfocyty Treg CD4 + CD25 + są anergiczne, nie reagują proliferacją na stymulację TCR. Działają supresyjnie w stosunku do limfocytów T CD4+CD25-, limfocytów TCD8+, komórek NK (NK natural killers) i komórek dendrytycznych (dendritic cells DC). Sugeruje się, że limfocyty T CD4+CD25low mogą być aktywowanymi in vivo limfocytami CD4+, dlatego też nie działają regulatorowo. Należy jednak podkreślić, że funkcje regulatorowe nie są ograniczone jedynie do tej subpopulacji limfocytów Treg. Podobne właściwości mogą wykazywać niektóre subpopulacje limfocytów T CD8+, limfocytów T γδ, naturalnych komórek cytotoksycznych, komórek dendrytycznych oraz limfocytów B wytwarzających interleukinę IL-10 [6]. Charakterystyka molekularna W wielu ostatnich badaniach sugeruje się, że limfocyty Treg można definiować poprzez ekspresję czynnika transkrypcyjnego FOXP3 [7]. FOXP3 FOXP3 jest zasadniczym genem programującym rozwój i funkcję Treg [7,8]. Wycisza on promotory genów cytokin, tzn. hamuje ich ekspresję na skutek oddziaływań z jednym z kluczowych czynników transkrypcyjnych NFAT. Uważa się, że FOXP3 zapewnia blokadę indukcji zarówno limfocytów Th1, jak i Th2 [9,10]. Foxp3, zlokalizowany na chromosomie Xq11.23-Xq13.3, należy do rodziny czynników transkrypcyjnych, działając poprzez interakcje wiążące DNA w trakcie transkrypcji, przede wszystkim jako represor [11]. Białko to jest zakodowane przez 11 eksonów i zawiera domenę, która bezpośrednio, lub w połączeniu z NFAT, może przyłączyć się do promotora IL2 i hamować transkrypcję IL2mRNA. Zatem w odróżnieniu od konwencjonalnych limfocytów T, limfocyty Treg nie produkują IL-2 i dlatego są zasadniczo anergiczne. Tabela I. Właściwości limfocytów Treg Cecha Naturalne Treg (ntreg) Indukowane Treg (itreg) - Tr1 Indukowane Treg (itreg) - Th3 Rozwój grasica na obwodzie (MALT) na obwodzie (MALT) Fenotyp CD4 + CD25 + CD127 low CD4 + CD25 - CD4 + CD25 + z CD25 - prekursorów Inne markery CTLA-4 + GITR + Foxp3 + CD45RB low Foxp3 - CD25 low CD45RB low Foxp3 + Mechanizm supresji kontakt-, Granzyme B, TGFβ IL-10 TGFβ Docelowa komórka supresji APC i limfocyt T efektorowy limfocyt T efektorowy? Znaczenie in vivo supresja autoreaktywnych limfocytów T układ immunologiczny w obrębie błon śluzowych, odpowiedź zapalna układ immunologiczny w obrębie błon śluzowych, odpowiedź zapalna Opisana funkcja w leczeniu jelitowej homeostazy prewencja i leczenie colitis u myszy, tolerancja doustna? prewencja colitis u myszy, tolerancja doustna? tolerancja doustna?

182 Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 180-188 Ekspresja FOXP3 w komórkach CD4+CD25+ koreluje z ich zdolnością regulatorową [9,10,12], jest też ściśle ograniczona do αβ limfocytów T [13] i prawie niewykrywalna w limfocytach B, γδ limfocytach T, komórkach NK, makrofagach i komórkach dendrytycznych [10]. Należy podkreślić, że Foxp3 jest swoiście związany z CD4+CD25+, a jego ekspresja dotyczy przede wszystkim ntreg, ale stwierdzono ją również w mniejszym stopniu i przejściowo w limfocytach T efektorowych oraz niektórych limfocytach TCD8+. W odniesieniu do reakcji alergicznej, po stymulacji antygenowej, powstaje pula indukowanych Treg, reprezentowanych przez CD4+CD25+FoxP3+, generowanych z naiwnych CD4+ limfocytów T (CD4+CD25+FoxP3-). Te indukowane Treg są nie do odróżnienia od naturalnych Treg. Wysoka ekspresja Foxp3 wydaje się być równie ważna dla ntreg i CD4+CD25+ itreg, podczas gdy mniej istotna dla innych subpopulacji Treg. Coraz częściej pojawiają się doniesienia, że niektóre rodzaje komórek regulatorowych mogą nie wykazywać ekspresji FOXP3. Jej brak jest obserwowany np. w przypadku komórek Tr1, jednej z subpopulacji itreg [14]. Wydaje się więc, że niektóre limfocyty Treg mogą różnicować się niezależnie od zaprogramowania przez FOXP3. Tr1 reprezentują ważną gałąź regulacji immunologicznej, zależną i działającą poprzez IL-10 cytokinę o działaniu immunosupresyjnym, biorącą udział w wytwarzaniu tolerancji. Należy przypuszczać, że limfocyty Tr1 mogą odgrywać kompensacyjną rolę w sytuacjach patologicznych, w których różnicowanie ntreg zależne od FOXP3 jest upośledzone. W oparciu o badania, w których u zdrowych nieatopowych osób stwierdzono obecność alergenowo-swoistych limfocytów Treg, sklasyfikowanych jako itreg, działających poprzez IL10 i/lub TGFbeta, sugeruje się istotny wpływ itreg i limfocytów Tr1 na regulację immunologiczną w alergii [15]. Wykazano, że nadekspresja FOXP3 zwiększa liczbę limfocytów Treg [16]. Ekspresja FOXP3 indukowana przez TGFβ, wykazuje zmienność i w znacznym stopniu jest podatna na wpływ środowiska cytokinowego. Wykazano, iż im mniej komórek CD4+CD25high, tym mniejsza ekspresja FOXP3 i mniejsza zdolność do supresji efektorowych limfocytów T [17]. Mutacja FOXP3 prowadzi do rozwoju chorób autoimmunologicznych u ludzi, tzn. XLAAD i IPEX [18]. Początkowo sugerowano, że FOXP3 jest głównym czynnikiem decydującym o rozwoju Treg [10], ale ostatnie badania wskazują, że funkcją FOXP3 jest wzmocnienie i utrwalenie wcześniej zaprogramowanych cech molekularnych komórek Treg [9]. Ekspresja FOXP3 jest niezbędnym elementem utrzymania zdolności supresyjnych dojrzałych komórek Treg na obwodzie. Wiele z genów związanych z FOXP3 może być aktywowanych bądź hamowanych w limfocytach T FOXP3+. Oznacza to, że FOXP3 może działać jako aktywator lub represor transkrypcji. Wykazano, iż IL-6 może indukować utratę zdolności do ekspresji FOXP3 w limfocytach Treg i powodować ich przeprogramowanie w limfocyty Th17 [11,19]. Zarówno u ludzi, jak i u myszy wykazano obecność limfocytów T z równoczesną ekspresją FOXP3 i IL-17 [20]. FOXP3 jest przykładem korelacji między genami a klinicznym rozwojem dysregulacji immunologicznej. Nadal istnieje jednak wiele pytań dotyczących mechanizmów regulacji poprzez FOXP3. Nadzieją mogą napawać badania dotyczące nowych leków wpływających na ekspresję FOXP3 [21]. Inne markery Treg Badania nad identyfikacją i monitorowaniem Treg u ludzi są utrudnione ze względu na niewielką ilość Treg dostępną w materiałach biologicznych (1-2% CD4+) i problemy z ich identyfikacją. Dotychczas stosowano wiele metod badawczych w celu identyfikacji i monitorowania Treg. Początkowo używano wysokiej ekspresji markerów powierzchniowych, takich jak CD25 i CD4 (CD4+CD25+). Jednakże ekspresję CD25 wykazują również nieregulacyjne limfocyty T, powstające w trakcie odpowiedzi immunologicznej na patogeny. Na bardziej szczegółową analizę limfocytów Treg pozwolił pomiar ekspresji wewnątrzkomórkowej białka FOXP3 (komórki CD4+CD25+Foxp3+), jednakże ekspresję FOXP3 wykazują również przejściowo aktywowane ludzkie limfocyty T efektorowe, utrudniając w ten sposób właściwą analizę Treg poprzez zastosowanie markerów CD4, CD25 czy FOXP3 [10]. FOXP3 wyraża ponadto ekspresję wewnątrzkomórkowo, nie może być więc z łatwością stosowany do izolacji komórek Treg. Stąd dla charakteryzacji fenotypowej poszukuje się dodatkowych molekuł powierzchniowych czy też wewnątrzkomórkowych związanych z funkcjonowaniem limfocytów Treg, takich jak: CD45RO, CD152, GITR, LAG-3, CD122 (łańcuch b receptora IL-2), CD27, CTLA-4 oraz CD127 o niskiej ekspresji (łańcuch a receptora IL-7 i TSLP) [22]. Analiza fenotypowa wykazała, że populacja limfocytów Treg CD4 + CD25 + jest dosyć jednorodna i 95% komórek wykazuje ekspresję CD45RO, CD62L, CD152 oraz CD25 i GITR. Tym niemniej żaden z wymienionych antygenów nie jest charakterystyczny wyłącznie dla limfocytów Treg. Mechanizm działania Treg Limfocyty Treg CD4+CD25+ hamują proliferację limfocytów efektorowych, jak i wydzielanie przez nie cytokin prozapalnych. Kontrolują one swoistą odpowiedź immunologiczną na alergen poprzez [12,23-25]: supresję APC; supresję efektorowych komórek Th1, Th2 i Th17 (wewnątrzkomórkowy szlak sygnalizacyjny z udziałem NFAT); supresję alergenowo-swoistych IgE i indukcję IgG4, IgA (regulując funkcję limfocytów B); supresję mastocytów, bazofili i eozynofili; supresję migracji limfocytów efektorowych T do tkanek; bezpośrednią interakcję z komórkami. Treg a alergia Dotychczasowe badania pozwoliły na stwierdzenie, że zaburzenia ilościowe i/lub jakościowe w populacji naturalnych limfocytów Treg CD4 + CD25 + mogą być przyczyną rozwoju chorób autoimmunizacyjnych, alergicznych bądź nowotworowych. Uważa się, że choroby alergiczne są rezultatem nieprawidłowej równowagi między limfocytami Treg CD4+CD25+ aktywowanymi alergenem a komórkami efektorowymi Th2. Ten brak równowagi może wynikać z upośledzonego działania supresyjnego limfocytów Treg. Wykazano, że Treg są zdolne do hamowania zarówno limfocytów Th1, jak i Th2, dzięki czemu mogą kontrolować odpowiedź

Krogulska A Limfocyty T regulacyjne i ich znaczenie w alergii pokarmowej u dzieci 183 immunologiczną na alergeny [24]. Treg blokują przemianę niezróżnicowanych limfocytów w Th2 oraz chronią przed nieodpowiednią odpowiedzią Th2 na czynniki środowiskowe. Do niedawna znaczenie limfocytów Treg w patogenezie chorób alergicznych nie było dokładnie zdefiniowane. Wiadomo, że u pacjentów, u których występuje deficyt CD4+CD25+Treg, np. w przebiegu zespołu IPEX, rozwija się ciężka postać wyprysku, dochodzi do wzrostu IgE, eozynofilii i alergii pokarmowej. Dotychczasowe wyniki badań wykazują obniżenie liczby, jak i funkcji Treg w chorobach alergicznych [15,26,27]. U chorych z atopią stwierdzono obniżoną (w porównaniu do zdrowych) zdolność limfocytów Treg do hamowania limfocytów efektorowych stymulowanych alergenem. Ling wykazał, że u osób z atopią działanie supresyjne limfocytów T CD4+CD25+ jest istotnie osłabione, a w szczególności u osób z pyłkowicą w trakcie sezonu. U tych samych osób po sezonie działanie supresyjne Treg jest nadal mniejsze w porównaniu do osób bez atopii [26]. Podobnie Grindebacke wykazał osłabione hamowanie wytwarzania IL-5 i IL-13 przez limfocyty T CD4+CD25+ u osób z alergią na pyłki brzozy w sezonie pylenia [28]. Robinson wykazał zmniejszony poziom ntreg i Treg produkujących IL-10 u pacjentów z alergią, szczególnie przy przewlekłej ekspozycji na alergen [29]. Jednakże istnieją również prace, w których prezentowane są odmienne wnioski. Wykazano na przykład, że poza sezonem pylenia funkcja immunosupresyjna limfocytów T CD4+CD25+ zarówno u osób z alergią, jak i bez niej była prawidłowa [26]. Wydaje się ponadto, że liczba krążących limfocytów T CD4+CD25+ jest podobna u dorosłych z atopią i bez niej [30]. Niektórzy autorzy przekonują nawet, że zdolność immunosupresyjna Treg u ludzi z chorobami alergicznymi nie jest osłabiona [26,28]. Nie wykazano też zmian w ekspresji FOXP3 limfocytów Treg [31,32]. Wydaje się, że te diametralnie różne wyniki w zakresie liczby czy funkcji Treg w patogenezie chorób alergicznych mogą być związane z trudnościami we właściwej identyfikacji limfocytów Treg CD4+ przy użyciu konwencjonalnych markerów komórkowych. Następstwa zmian liczby czy funkcji limfocytów Treg w zakresie rozwoju chorób alergicznych u dorosłych są przedmiotem wielu badań klinicznych. Treg a astma u dorosłych Lokalizacja FOXP3 w chromosomie Xp11.23 wskazuje na jego powiązanie z astmą i atopią. Akdis wykazał zmniejszenie liczby limfocytów Treg u chorych na astmę w porównaniu do zdrowych [15]. W innym badaniu stwierdzono wzrost Treg CD4+CD25+ we krwi tylko w trakcie zaostrzenia, natomiast brak zmian w stabilnym okresie choroby. Ponadto nie wykazano różnic w ich funkcji supresyjnej pomiędzy chorymi na astmę a zdrowymi [30]. Provoost [33] po raz pierwszy ocenił poziom FOXP3 u dorosłych pacjentów z astmą w okresie stabilnym i wykazał obniżenie jego ekspresji w limfocytach T CD4+CD25high w porównaniu do zdrowych, sugerując równocześnie możliwy wpływ GKS na natężenie ekspresji. Udowodnił równocześnie, że ekspresja białka FOXP3 dotyczyła głównie limfocytów TCD4+CD25high. Nie wykazał różnic w liczbie limfocytów TCD4+CD25high oraz limfocytów TCD4+CD25high FOXP3+ pomiędzy pacjentami z astmą i pacjentami zdrowymi. Provoost sugeruje, że limfocyty TCD4+CD25+ reprezentują heterogenną populację i mieszczą w sobie zarówno ntreg, jak i aktywowane efektorowe komórki T. Ponadto wykazał odwrotną korelację pomiędzy ekspresją FOXP3 i poziomem cige [33]. Z kolei u pacjentów z ciężką astmą Hawryłowicz zwrócił uwagę na zmniejszoną indukcję limfocytów T produkujących IL-10, a co więcej, bez poprawy po zastosowanych GKS [34]. Stosując mysi model astmy, Doganci wykazał, że mniejsza liczba CD25+Treg wiązała się ze zwiększoną nadreaktywnością oskrzeli, potwierdzając tym samym ścisły związek między CD25+Treg a patofizjologią układu oddechowego [35]. Podobnie Boudousquié udowodnił istotne znaczenie CD4+CD25+ Treg w kontrolowaniu zapalenia i nadreaktywności układu oddechowego [36]. Ostatnie badania wskazują, iż mimo że u pacjentów z astmą wykazano (po prowokacji alergenem) wzrost liczby limfocytów Treg z wysoką ekspresją FOXP3 w BAL, to stwierdzono również wzrost poziomu cytokin Th2, co może sugerować niezdolność komórek napływających do płuc do supresji odpowiedzi Th2 [37]. Matsumoto wykazał, że częstość limfocytów T Foxp3+CD4+CD25+ wśród całkowitej liczby limfocytów T CD4+CD25+ w PBMC u pacjentów z astmą była znacząco niższa aniżeli u osób zdrowych, chociaż nie stwierdzono związku między ilością limfocytów T Foxp3+CD4+CD25+ a stopniem ciężkości choroby [38]. Treg a ANN u dorosłych Wykazano, że u pacjentów z pyłkowicą w wyniku ekspozycji na pyłki dochodzi do wzrostu liczby limfocytów T CD4+CD25+, wykazujących defekt funkcji regulacyjnych, które nie potrafią hamować aktywowanych pyłkami limfocytów TCD4+CD25- w trakcie pylenia [28,39]. Ponadto stwierdzono zmniejszoną śluzówkową ekspresję FOXP3 mrna u pacjentów z przewlekłym zapaleniem nosa, zatok i polipami [33]. Z kolei inne badanie wskazuje na prawidłową liczbę i funkcję immunosupresyjną limfocytów T CD4+CD25+ u większości atopowych pacjentów z ANN. Treg a AZS i pokrzywka u dorosłych Wykazano, że dysfunkcja limfocytów T CD4+CD25+FOXP3+ prowadzi do rozwoju zespołu zaburzeń immunologicznych, często skojarzonego z występowaniem atopowego zapalenia skóry (AZS). Verhagen stwierdził dysregulację efektorowych limfocytów T, odpowiedzialnych za rozwój AZS oraz zmniejszenie liczby limfocytów TCD4+CD25+FoxP3+ w zmianach skórnych u chorych z AZS [40]. Niższy poziom białka CD4+CD25+ FOXP3+ w skórze pacjentów z AZS wykazał Ling [26]. Z kolei Ou stwierdził, że dorośli z AZS mają zwiększoną liczbę Treg we krwi obwodowej z prawidłową ich aktywnością immunosupresyjną [32,31]. Chen wykazał osłabioną funkcję zarówno limfocytów T CD4+CD25+, jak i CD4+CD25- u pacjentów z przewlekłą pokrzywką w porównaniu do zdrowych, choć nie stwierdził różnic w poziomie ekspresji FOXP3 i TGFβ [41].

184 Dotychczas przeprowadzono niewiele badań dotyczących oceny znaczenia Treg w patogenezie chorób alergicznych u dzieci. Wiadomo, że wysoki poziom całkowitej IgE we krwi pępowinowej jest czynnikiem ryzyka wystąpienia choroby alergicznej u dziecka. Hinz wykazał ujemną korelację między poziomem cige a liczbą limfocytów Treg, sugerując, iż zmniejszona liczba Treg u matek w ciąży może zwiększać ryzyko choroby alergicznej u dziecka [42]. Z kolei Jarti zamierzał sprawdzić, czy rzeczywiście większa liczba oraz wzmożona aktywność limfocytów T CD4+CD25high są związane ze zmniejszonym ryzykiem atopii u dzieci. Przebadał on populację dzieci z rodzin zwiększonego ryzyka wystąpienia alergii [43]. Wykazał, że im więcej limfocytów T CD4+CD25high, tym większa liczba dodatnich testów skórnych oraz większy poziom cige w okresie pylenia. Z kolei liczba limfocytów T CD4+CD25high była odwrotnie skorelowana z aktywnością supresyjną limfocytów T CD4+CD25+. Jarti sugeruje równocześnie, że sezonowy wzrost ekspresji limfocytów T CD4+CD25high u dzieci z alergią może reprezentować aktywację układu immunologicznego indukowaną ekspozycją na pyłki [43]. Treg a astma u dzieci U dzieci z astmą wykazano obniżony odsetek i zmniejszoną zdolność immunosupresyjną CD4+CD25+ w BALF (choć nie we krwi), jak również zmniejszoną ekspresję mrna dla FOXP3, w porównaniu do dzieci zdrowych. Ponadto u dzieci z astmą stwierdzono, iż zarówno liczba limfocytów T CD4+CD25+, jak i ekpresja FOXP3 mrna w BAL korelowały pozytywnie z FEV1 [44]. Z kolei Lee stwierdził niższy poziom limfocytów CD4+CD25+ u dzieci z astmą lub ANN (w porównaniu do zdrowych), choć równocześnie wykazał, że ich poziom rośnie wraz z ciężkością choroby alergicznej, osiągając poziom jak u zdrowych [45]. Równocześnie stwierdził dodatnią korelację między liczbą limfocytów CD4+CD25+ i poziomem cige u chorych z alergią, czego nie stwierdzono u zdrowych. Wykazał również, niezgodnie z innymi wynikami badań (wskazującymi, że cięższa postać choroby alergicznej jest skorelowana z głębszym defektem ekspresji FOXP3), wyższą ekspresję FOXP3 u pacjentów z bardziej nasiloną chorobą alergiczną. Lee [45] tłumaczy to możliwym wpływem GKS stosowanych przez pacjentów z cięższa postacią choroby [46], a ponadto prawdopodobnym wzrostem indukowanych Treg, generowanych podczas zaostrzenia choroby alergicznej. Komórki te wykazywały się wysoką aktywnością IL-10, co może sugerować, że itreg w odpowiedzi na nasiloną atopię i ciężkość choroby mogą pokonywać możliwy defekt ntreg, który może występować u dzieci z alergią układu oddechowego. Lin wykazał, że choć liczba ntreg w PBMC u dzieci z astmą była zwiększona, to ekspresja FOXP3 i ich funkcja supresyjna były zmniejszone w porównaniu do zdrowych dzieci bez atopii [47]. Co ciekawe zupełnie odwrotne wyniki ekspresji FOXP3 i ich aktywności uzyskano u dzieci z astmą w trakcie immunoterapii swoistej (ITS). ITS powoduje bowiem wzrost CD25+Foxp3+Tcells i komórek wytwarzających IL-10 [24,48]. W modelu zwierzęcym immunoterapii podjęzykowej wykazano, że vit D3 i dexamethason zwiększają skuteczność ITS, wraz z lokalnym wzrostem limfocytów T Foxp3+ [48]. Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 180-188 Treg a AZS u dzieci Rozwój AZS w niemowlęctwie jest związany ze zwiększoną ekspresją FOXP3 mrna indukowaną alergenem [31]. U pacjentów z AZS liczba ntreg była paradoksalnie podwyższona a ich funkcja supresyjna prawidłowa. Treg a alergia pokarmowa u dzieci Istnieją pośrednie dowody na to, że rozwój alergii pokarmowej jest kontrolowany przez limfocyty T CD4+CD25+. Innymi subpopulacjami komórek, które prawdopodobnie są związane z indukcją tolerancji doustnej, przynajmniej u zwierząt, są limfocyty Th3 stymulujące produkcję TGFβ, limfocyty Tr1 stymulujące wydzielanie IL-10 i TGFβ, oraz komórki NK. Nie wiadomo czy komórki te reprezentują odmienne linie komórkowe czy też różne dojrzewające fenotypy [31]. Znaczenie limfocytów TCD4+CD25+ w alergii pokarmowej nie było dotychczas dokładnie przebadane. Karlsson [49] wykazał wyższy poziom limfocytów T CD4+CD25+ u dzieci z alergią na białka mleka krowiego (abmk), które nabyły tolerancję, w porównaniu do dzieci ze stale aktywną postacią choroby. Ponadto u dzieci z tolerancją bmk, stwierdził zmniejszoną in vitro odpowiedź proliferacyjną na β-lactoglobulinę w PBMC w porównaniu do dzieci z alergią. Co więcej usunięcie limfocytów CD25+ z puli PBMC u dzieci z tolerancją prowadziło do wzrostu in vitro odpowiedzi proliferacyjnej na β-lactoglobulinę, sugerując, że indukcja tolerancji na alergeny pokarmowe jest związana z rozwojem limfocytów TCD4+CD25+ [49]. W przeciwieństwie do badań Karlssona, Savilahti [50] prezentuje zgoła odmienne wyniki. Po stymulacji β-lactoglobuliną ekspresja FOXP3 mrna była najwyższa u dzieci z abmk, choć nie stwierdzono różnic w populacji Treg miedzy dziećmi z alergią pokarmową i bez niej. Savilahti sugeruje, że aktywacja FOXP3 po stymulacji β-lactoglobuliną świadczy o aktywacji mechanizmów regulacyjnych u dzieci z abmk. Zatem wyniki tych badań nie potwierdzają koncepcji, że aktywacja Treg we krwi obwodowej wskazuje na indukcję tolerancji w alergii pokarmowej. Wyniki badań Savilahti wydają się być bardziej zgodne z ostatnimi badaniami Shreffler [51], gdzie wykazano różnice w liczebności antygenowo-specyficznych limfocytów Treg, ale nie poliklonalnych limfocytów Treg [50]. Shreffler dowodzi, że pacjenci, którzy tolerują alergeny mleka poddane wysokiej temperaturze (HM heated milk) reprezentują łagodniejszy fenotyp abmk, w przebiegu którego występuje wyższy poziom sigg4, niższy poziom sige, SPT i reaktywność bazofili. Dzieci z tolerancją HM szybciej wyrastają z alergii, niż dzieci z alergią na HM i mają równocześnie wyższy poziom alergenowo-specyficznych limfocytów Treg oraz lepsze rokowanie. Zatem Shreffler podkreśla, że alergenowo-specyficzne limfocyty Treg mogą odgrywać rolę w nabywaniu tolerancji na białka mleka krowiego, stając się ważnym obiektem badań nad leczeniem i monitorowaniem immunologicznym [51]. Sicherer podkreśla znaczenie limfocytów Treg w dyskryminacji różnych fenotypów alergii pokarmowej [52]. W późniejszych badaniach u niemowląt z abmk Sicherer wykazał, że stymulacja alergenem PBMC nie spowodowała zmian w ekspresji CD25, FOXP3, GATA3, IL10, IFNG, TBET (T-box transcription), za wyjątkiem wzrostu ekspresji IL-4, w porównaniu do dzieci zdrowych [53].

Krogulska A Limfocyty T regulacyjne i ich znaczenie w alergii pokarmowej u dzieci 185 Z kolei Smith podkreśla znaczenie Treg we wczesnym okresie rozwoju alergii. Wykazał on bowiem obniżoną funkcję limfocytów TCD4+CD25+ u noworodków z grupy ryzyka rozwoju alergii pokarmowej na jajka. Podkreśla równocześnie, że chociaż wysoka ekspresja FOXP3 jest zdefiniowaną cechą CD4+CD25+CD127lo/- [22], to nie koreluje dobrze ze zmianami funkcji tej populacji Treg. Smith podaje, że poziom FOXP3 oraz poziom ich aktywności supresyjnej wydają się wahać niezależnie od siebie u badanych noworodków, zatem zmiany w stopniu ekspresji FOXP3 nie korelowały z ich możliwościami funkcjonalnymi. Smith podsumowuje, iż choć FOXP3 jest użytecznym markerem populacji regulatorowej u noworodków, to nie pozwala on na ocenę funkcji tych komórek. Według Martino wyższy poziom kolonizacji błony śluzowej jelit przez tzw. korzystne bakterie (szczególnie bifidobakterie) jest związany z wyższą ekspresją markerów Treg i TGFβ [54]. W oparciu o badania markerów immunologicznych w błonie śluzowej dwunastnicy pacjentów z alergią pokarmową wykazano, że stosunek ekspresji FOXP3 mrna do liczby komórek Foxp3 był zmniejszony u pacjentów z alergią pokarmową w porównaniu do zdrowych, co wskazuje, że w błonie śluzowej dwunastnicy pacjentów z nieleczoną alergią występuje większa liczba komórek Foxp3, ale komórki te nie mają możliwości hamowania szkodliwej odpowiedzi immunologicznej, na co wskazuje niska ekspresja FOXP3 [55]. Ponadto wykazano, że dzieci z alergią pokarmową mają zmniejszoną liczbę limfocytów T produkujących TGFβ w błonie śluzowej jelita [56] i mniejszą liczbę limfocytów T produkujących IL-10 we krwi [57]. Mori wykazał, że limfocyty T CD4+CD25+Foxp3+ nie mają znaczenia w odczulaniu doustnym u dzieci z alergią pokarmową, choć odgrywają istotną rolę w osiąganiu naturalnej tolerancji u dzieci z abmk [58]. Wiele dotychczasowych badań wykazało, że im większa liczba i aktywacja alergenowo-specyficznych limfocytów Treg, tym lepsze efekty ITS [59]. Znaczenie Treg w ITS zostało już wielokrotnie opisane, choć mało dotychczas wiadomo na temat immunoterapii w alergii pokarmowej. W oparciu o mysi model alergii pokarmowej, wykazano łagodniejszy przebieg choroby u myszy poddanych immunoterapii peptydowej, a także podkreślono znaczenie TGFβ i FOXP3 [60]. Treg a indukcja tolerancji doustnej Alergia pokarmowa u dzieci najczęściej ustępuje w ciągu pierwszych lat życia dziecka, stąd może stanowić dobry model do badań nad osiąganiem tolerancji na alergeny pokarmowe. W świetle wyników aktualnych badań limfocyty TCD4+CD25+ pełnią rolę tzw. strażników tolerancji obwodowej. Utrzymanie miejscowej homeostazy jest szczególnie ważne w obrębie błony śluzowej jelit. Tutaj wyłącznie pojedyncza warstwa nabłonka oddziela środowisko wewnętrzne od zewnętrznego, bogatego w antygeny, a układ immunologiczny powinien skutecznie różnicować patogeny od antygenów pokarmowych i komensalnej flory jelitowej. Zaburzenia w rozwoju bądź podtrzymywaniu tolerancji wobec nieszkodliwych antygenów jelitowych, które naruszyły barierę nabłonkową, mogą prowadzić do miejscowej bądź systemowej reakcji zapalnej. Nic zatem dziwnego, że w tym miejscu stwierdza się obecność różnych populacji Treg o funkcjach regulacyjnych. Wyróżnia się też niekonwencjonalną subpopulację Treg z ustaloną funkcją regulacyjną, do których zalicza się przede wszystkim limfocyty TCD8+ (jelitowe wewnątrznabłonkowe limfocyty, IEL intestinal intraepithelial lymphocyte), obecne w błonie śluzowej jelita, oraz konwencjonalną subpopulację limfocytów TCD4+, które nie są ograniczone wyłącznie do błony śluzowej jelita. W oparciu o badania na zwierzętach wykazano, że tolerancja doustna może być indukowana zarówno przez dużą dawkę [61], jak i powtarzalne małe dawki antygenu [62]. Te dwie formy indukcji tolerancji są powodowane przez 2 różne mechanizmy immunologiczne. Wysoka dawka antygenu podawana drogą doustną może wywoływać anergię lub delecję limfocytów. Tolerancja wywoływana niską dawką antygenów jest mediowana poprzez limfocyty Treg. W oparciu o badania u ludzi stwierdzono, że w rozwoju tolerancji czy spontanicznej rezolucji abmk zasadniczą rolę odgrywa subpopulacja limfocytów T CD4+CD25+ [27,49,63]. Wiele badań potwierdza znaczenie limfocytów Treg, w tym limfocytów T CD4+CD25+ w rozwoju naturalnej tolerancji, jak również spontanicznej remisji abmk [27,49,63]. Wiadomo, że limfocyty Treg CD4+CD25+FoxP3, pochodzące z grasicy, biorą udział w utrzymywaniu naturalnej tolerancji. Równocześnie wzrasta liczba danych wskazujących narastające znaczenie indukowanych obwodowo adaptacyjnych Treg w regulowaniu odpowiedzi zarówno Th1, jak i Th2 na egzogenne alergeny, do których zalicza się limfocyty T H 3 i limfocyty T R 1 [26]. Zarówno naturalne, jak i indukowane limfocyty T regulatorowe wykorzystują podobne mechanizmy pobudzania tolerancji, jednak komórki ntreg w większym stopniu działają w wyniku bezpośredniego kontaktu z komórką docelową, a ich aktywność jest w mniejszym stopniu związana z wytwarzaniem cytokin. Komórki ntreg wykazują wprawdzie zdolność do wytwarzania TGFβ, jednak czynnik ten nie jest uwalniany do środowiska, ale znajduje się na powierzchni komórek [64]. Natomiast cytokiny przeciwzapalne wytwarzane przez limfocyty itreg odgrywają główną rolę w indukowaniu tolerancji [13]. Limfocyty T H 3 produkują TGFβ z różną ilością IL-4 i IL-10 [25]. TGFβ odgrywa istotną rolę w rozwoju tolerancji doustnej. W oparciu o cytometrię przepływową wykazano, że dzieci z alergią pokarmową mają mniejszą liczbę limfocytów wykazujących ekspresję TGFβ zarówno w nabłonku dwunastnicy, jak i w lamina propria [56]. Regulacyjna cytokina TGFβ produkowana jest nie tylko przez limfocyty T H 3, ale również przez komórki nabłonkowe dwunastnicy. Przy zastosowaniu badań immunohistochemicznych wykazano obniżony poziom tej cytokiny u dzieci z różnymi postaciami alergii pokarmowej [56]. Z kolei Bayer i wsp. wykazali brak ekspresji TGFβ i IL-10 na specyficznych limfocytach błony śluzowej dwunastnicy w tracie hodowli (in vitro) po stymulacji mlekiem u dzieci z gastroenteropatią w przebiegu abmk [65]. Rola TGFβ pozostaje kontrowersyjna. Co prawda wykazano, że immunosupresyjna rola Treg jest mediowana przez TGFβ [16,17], jednakże ostatnio podważono znaczenie TGFβ dla supresyjnej roli CD4+CD25+ [4]. TGFβ wpływa hamująco na proliferację limfocytów T, B i komórek NK oraz podobnie jak IL-10, hamuje ekspresję cząsteczek MHC klasy II na komórkach APC. Limfocyty TR1 wydzielają interleukinę IL-10, która równocześnie stymuluje ich produkcję. Hamuje ona wytwarzanie

186 cytokin prozapalnych przez limfocyty efektorowe, monocyty i makrofagi, obniża również zdolność APC do ekspresji cząsteczek MHC klasy II. Badania na zwierzętach wykazały indukcję IL-10 przez swoiste komórki kępek Payera po stymulacji niskimi dawkami betalaktoglobuliny, a dodatkowo możliwość hamowania przez te komórki odpowiedzi proliferacyjnej limfocytów T in vitro, jak również odpowiedzi zapalnej mediowanej przez limfocyty T in vivo [66]. Kolejnych dowodów na udział IL-10 w indukcji tolerancji doustnej dostarczył Frossard [67], wykazując obecność IL-10 w komórkach kępek Payera u myszy z tolerancją białek mleka, po spożyciu β-lactoglobuliny, w przeciwieństwie do myszy z reakcją anafilaktyczną indukowaną β-lactoglobuliną. Stwierdza on równocześnie, że osłabiona produkcja IL-10 w kępkach Peyera sprzyja rozwojowi alergii na pokarmy [67]. Treg a GKS Udokumentowano, że ekspresja FOXP3 wystarcza, by generować komórki T o supresyjnym fenotypie, ale sygnały, które indukują FOXP3 nie są znane. Wykazano, że GKS aktywują FOXP3 i generują Tr1, a ponadto mogą zwiększać liczbę Treg we krwi u pacjentów z ciężką astmą [68]. GKS nie tylko działają immunosupresyjnie i przeciwzapalnie, ale również promują lub inicjują różnicowanie komórek Tr1 poprzez mechanizm zależny od FOXP3. Dowiedziono, że pod wpływem GKS dochodzi do wzrostu ekspresji FOXP3 oraz liczby limfocytów Treg. Karagiannidis podaje, że zastosowanie GKS wziewnie bądź systemowo przyczyniało się do zwiększenia odsetka limfocytów CD4+CD25+ i poprawy ich funkcji [68]. Wykazał on równocześnie istotny wzrost ekspresji FOXP3 w niestymulowanych limfocytach T CD4+ zarówno u pacjentów z ciężką astmą leczonych systemowo GKS, jak i u pacjentów z umiarkowaną astmą leczonych wgks, w przeciwieństwie do pacjentów z umiarkowaną astmą, ale nie leczonych wgks [68]. Według Liao pobudzenie GITR zwiększa proliferację Treg zarówno in vitro, jak i in vivo, stając się cennym narzędziem Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 180-188 indukcji tolerancji. Naturalne Treg wykazują wysoką ekspresję GITR, tym niemniej stwierdzono również, że aktywacja efektorowych limfocytów T także prowadzi do uaktywnienia ekspresji tego receptora [69]. Ekspresja FOXP3 mrna, indukowana GKS w naiwnych limfocytach TCD4+ różnicowanych in vitro, jest przejściowa i niższa niż w naturalnie występujących CD25 Treg. Karagiannidis wykazał, że choć niższe wartości IgE wiązały się z wyższą ekspresją FOXP3 mrna, to nie była to zależność istotna statystycznie [68]. Podsumowanie W ostatnich latach dokonano ogromnego postępu w odkrywaniu danych dotyczących limfocytów Treg. Podkreśla się ich znaczącą rolę w utrzymywaniu obwodowej tolerancji u ludzi. Tolerancja na alergeny i autoantygeny jest związana ze zwiększeniem liczby Treg i ich funkcji supresyjnej. Sugerując, że manipulacja aktywnością Treg stanowi potencjalną strategię dla przyszłych interwencji terapeutycznych w chorobach alergicznych i autoimmunologicznych. Wydaje się jednak, że ich znaczenie jest bardziej złożone niż wcześniej zakładano. Ekspresja FOXP3 w Treg u ludzi nie jest bezwzględnie związana ze stałą funkcją supresyjną, co niewątpliwie zmniejsza znaczenie Treg w działaniach terapeutycznych. Metody prowadzące do aktywacji Treg, w korelacji z redukcją aktywności limfocytów Th2, budzą nadzieje na nowe możliwości prewencji czy leczenia chorób alergicznych. Należy jednak pamiętać, że manipulacja limfocytami Treg w celach terapeutycznych, choć bardzo obiecująca, równocześnie niesie ze sobą zagrożenie dysregulacji układu immunologicznego, gdyż zarówno nadmiar, jak i niedobór funkcjonalnie aktywnych limfocytów Treg, może doprowadzić do immunopatologii. Piśmiennictwo 1. Gershon RK, Kondo K. Cell interactions in the induction of tolerance: the role of thymic lymphocytes. Immunology 1970; 18: 723-737. 2. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M i wsp. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of selftolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 1995; 155: 1151-1164. 3. Ng WF, Duggan PJ, Ponchel F i wsp. Human CD4(+)CD25(+) cells: a naturally occurring population of regulatory T cells. Blood. 2001; 98: 2736-2744. 4. Saurer L, Mueller C. T cell-mediated immunoregulation in the gastrointestinal tract. Allergy. 2009; 64: 505-519. 5. Baecher-Allan C, Brown JA, Freeman GJ, Hafler DA. CD4+C- D25high regulatory cells in human peripheral blood. J Immunol. 2001; 167: 1245-1253. 6. Ozdemir C., Akdis M., Akdis C.A.: T regulatory cells and their counterparts: masters of immune regulation. Clin. Exp. Allergy 2009; 39: 626-639. 7. Yagi H, Nomura T, Nakamura K, Yamazaki S i wsp. Crucial role of FOXP3 in the development and function of human CD25+CD4+ regulatory T cells. Int Immunol. 2004; 16: 1643-1656. 8. Sakaguchi S, Ono M, Setoguchi R i wsp. Foxp3+ CD25+ CD4+ natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease. Immunol Rev. 2006; 212:8-27. 9. Gavin MA, Rasmussen JP, Fontenot JD i wsp. Foxp3-dependent programme of regulatory T-cell differentiation. Nature. 2007; 445: 771-775. 10. Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Immunol. 2003; 4: 330-336. 11. Ochs HD, Oukka M, Torgerson TR. TH17 cells and regulatory T cells in primary immunodeficiency diseases. J Allergy Clin Immunol. 2009; 123: 977-983. 12. Palomares O, Yaman G, Azkur AK i wsp. Role of Treg in immune regulation of allergic diseases. Eur J Immunol. 2010; 40: 1232-1240. 13. Corthay A. How do regulatory T cells work? Scand J Immunol. 2009; 70: 326-336. 14. Wang J, Ioan-Facsinay A, van der Voort EI i wsp. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol., 2007; 37: 129-138. 15. Akdis M, Verhagen J, Taylor A i wsp. Immune responses in healthy and allergic individuals are characterized by a fine balance

Krogulska A Limfocyty T regulacyjne i ich znaczenie w alergii pokarmowej u dzieci 187 between allergen-specific T regulatory 1 and T helper 2 cells.j Exp Med. 2004; 199: 1567-1575. 16. Xystrakis E, Boswell SE, Hawrylowicz CM. T regulatory cells and the control of allergic disease. Expert Opin Biol Ther. 2006; 6: 121-133. 17. Kekäläinen E, Tuovinen H, Joensuu J i wsp. A defect of regulatory T cells in patients with autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy.j Immunol. 2007; 178: 1208-1215. 18. Bennett CL, Christie J, Ramsdell F i wsp. The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat Genet. 2001; 27: 20-21. 19. Xu L, Kitani A, Fuss I, Strober W. Cutting edge: regulatory T cells induce CD4 + CD25-Foxp3- T cells or are self-induced to become Th17 cells in the absence of exogenous TGF-beta. J Immunol 2007; 178: 6725-6729. 20. Osorio F, LeibundGut-Landmann S, Lochner M i wsp. DC activated via dectin-1 convert Treg into IL-17 producers. Eur J Immunol 2008; 38: 3274 3281. 21. Bacchetta R, Gambineri E, Roncarolo MG. Role of regulatory T cells and FOXP3 in human diseases. J Allergy Clin Immunol. 2007; 120: 227-235. 22. Smith M, Tourigny MR, Noakes P i wsp. Children with egg allergy have evidence of reduced neonatal CD4(+)CD25(+)CD127(lo/-) regulatory T cell function. J Allergy Clin Immunol. 2008; 121: 1460-1406. 23. Akdis M, Blaser K, Akdis CA. T regulatory cells in allergy: novel concepts in the pathogenesis, prevention, and treatment of allergic diseases. J Allergy Clin Immunol. 2005; 116: 961-968. 24. Jutel M, Akdis M, Budak F i wsp. IL-10 and TGF-beta cooperate in the regulatory T cell response to mucosal allergens in normal immunity and specific immunotherapy.eur J Immunol. 2003; 33: 1205-1214. 25. Akdis CA, Akdis M. Mechanisms and treatment of allergic disease in the big picture of regulatory T cells. J Allergy Clin Immunol. 2009; 123: 735-746. 26. Ling EM, Smith T, Nguyen XD i wsp. Relation of CD4+CD25+ regulatory T-cell suppression of allergen-driven T-cell activation to atopic status and expression of allergic disease. Lancet 2004; 363: 608-615. 27. Tiemessen MM, Van Ieperen-Van Dijk AG, Bruijnzeel-Koomen CA i wsp. Cow s milk-specific T-cell reactivity of children with and without persistent cow s milk allergy: key role for IL-10. J Allergy Clin Immunol. 2004; 113: 932-939. 28. Grindebacke H, Wing K, Andersson AC i wsp. Defective suppression of Th2 cytokines by CD4CD25 regulatory T cells in birch allergics during birch pollen season. Clin Exp Allergy. 2004; 34: 1364-1372. 29. Robinson DS, Larche M, Durham SR. Tregs and allergic disease. J Clin Invest 2004; 114: 1389-1397. 30. Shi HZ, Li S, Xie ZF i wsp. Regulatory CD4+CD25+ T lymphocytes in peripheral blood from patients with atopic asthma. Clin Immunol 2004; 113: 172-178. 31. Taylor AL, Hale J, Hales BJ, i wsp. FOXP3 mrna expression at 6 months of age is higher in infants who develop atopic dermatitis, but is not affected by giving probiotics from birth. Pediatr Allergy Immunol 2007; 18:10-19. 32. Ou LS, Goleva E, Hall C, Leung DY. T regulatory cells in atopic dermatitis and subversion of their activity by superantigens. J Allergy Clin Immunol 2004; 113: 756-763. 33. Provoost S, Maes T, van Durme YM i wsp. Decreased FOXP3 protein expression in patients with asthma. Allergy. 2009; 64: 1539-1546. 34. Hawrylowicz C, Richards D, Loke TK i wsp. A defect in corticosteroid-induced IL-10 production in T lymphocytes from corticosteroid-resistant asthmatic patients. J Allergy Clin Immunol 2002; 109: 369-370. 35. Doganci A, Eigenbrod T, Krug N i wsp. The IL-6R alpha chain controls lung CD4+CD25+ Treg development and function during allergic airway inflammation in vivo. J Clin Invest. 2005; 115: 313-325. 36. Boudousquié C, Pellaton C, Barbier N, Spertini F. CD4+CD25+ T cell depletion impairs tolerance induction in a murine model of asthma. Clin Exp Allergy. 2009; 39: 1415-1426. 37. Thunberg S, Gafvelin G, Nord M i wsp. Allergen provocation increases TH2-cytokines and FOXP3 expression in the asthmatic lung. Allergy. 2010; 65: 311-318. 38. Matsumoto K, Inoue H, Fukuyama S i wsp. Frequency of Foxp3+CD4CD25+ T cells is associated with the phenotypes of allergic asthma. Respirology. 2009; 14: 187-194. 39. Anderson AE, Mackerness KJ, Aizen M i wsp. Seasonal changes in suppressive capacity of CD4+ CD25+ T cells from patients with hayfever are allergen-specific and may result in part from expansion of effector T cells among the CD25+ population. Clin Exp Allergy. 2009; 39: 1693-1699. 40. Verhagen J, Akdis M, Traidl-Hoffmann C i wsp. Absence of T-regulatory cell expression and function in atopic dermatitis skin. J Allergy Clin Immunol. 2006; 117: 176-183. 41. Chen WC, Chiang BL, Liu HE i wsp. Defective functions of circulating CD4+CD25+ and CD4+CD25- T cells in patients with chronic ordinary urticaria. J Dermatol Sci. 2008; 51: 121-130. 42. Hinz D, Simon JC, Maier-Simon C i wsp. Reduced maternal regulatory T cell numbers and increased T helper type 2 cytokine production are associated with elevated levels of immunoglobulin E in cord blood. Clin Exp Allergy. 2010; 40: 419-426. 43. Jartti T, Burmeister KA, Seroogy CM i wsp. Association between CD4(+)CD25(high) T cells and atopy in children. J Allergy Clin Immunol. 2007; 120: 177-183. 44. Hartl D, Koller B, Mehlhorn AT i wsp. Quantitative and functional impairment of pulmonary CD4+CD25hi regulatory T cells in pediatric asthma. J Allergy Clin Immunol. 2007; 119: 1258-1266. 45. Lee JH, Yu HH, Wang LC i wsp. The levels of CD4+CD25+ regulatory T cells in paediatric patients with allergic rhinitis and bronchial asthma. Clin Exp Immunol. 2007; 148: 53-63. 46. Fontenot JD, Rudensky AY. A well adapted regulatory contrivance: regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3. Nat Immunol 2005; 6: 331-337. 47. Lin YL, Shieh CC, Wang JY. The functional insufficiency of human CD4+CD25 high T-regulatory cells in allergic asthma is subjected to TNF-alpha modulation. Allergy 2008; 63: 67-74. 48. Van Overtvelt L, Lombardi V, Razafindratsita A i wsp. IL-10-inducing adjuvants enhance sublingual immunotherapy efficacy in a murine asthma model. Int Arch Allergy Immunol 2008; 145: 152-162. 49. Karlsson MR, Rugtveit J, Brandtzaeg P. Allergen-responsive CD4+CD25+ regulatory T cells in children who have outgrown cow s milk allergy. J Exp Med. 2004; 199: 1679-1688. 50. Savilahti EM, Karinen S, Salo HM i wsp. Combined T regulatory cell and Th2 expression profile identifies children with cow s milk allergy. Clin Immunol. 2010; 136: 16-20. 51. Shreffler WG, Wanich N, Moloney M i wsp. Association of allergen-specific regulatory T cells with the onset of clinical tolerance to milk protein. J Allergy Clin Immunol. 2009; 123: 43-52. 52. Sicherer SH, Leung DY. Advances in allergic skin disease, anaphylaxis, and hypersensitivity reactions to foods, drugs, and insects in 2009. J Allergy Clin Immunol. 2010; 125: 85-97. 53. Sicherer SH, Wood RA, Stablein D i wsp. Immunologic features of infants with milk or egg allergy enrolled in an observational study (Consortium of Food Allergy Research) of food allergy. J Allergy

188 Clin Immunol. 2010; 125: 1077-1083. 54. Martino DJ, Currie H, Taylor A i wsp. Relationship between early intestinal colonization, mucosal immunoglobulin A production and systemic immune development. Clin Exp Allergy. 2008; 38: 69-78. 55. Westerholm-Ormio M, Vaarala O, Tiittanen M, Savilahti E. Infiltration of Foxp3- and Toll-like receptor-4-positive cells in the intestines of children with food allergy. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2010; 50: 367-377. 56. Perez-Machado MA, Ashwood P, Thomson MA i wsp. Reduced transforming growth factor-beta1-producing T cells in the duodenal mucosa of children with food allergy. Eur J Immunol. 2003; 33: 2307-2315. 57. Scott-Taylor TH, Hourihane JB, Harper J, Strobel S. Patterns of food allergen-specific cytokine production by T lymphocytes of children with multiple allergies. Clin Exp Allergy 2005; 35: 1473-1480. 58. Mori F, Bianchi L, Pucci N i wsp. CD4+CD25+Foxp3+ T regulatory cells are not involved in oral desensitization. Int J Immunopathol Pharmacol. 2010; 23: 359-361. 59. Akdis Mubeccel, Immune tolerance in allergy. Current Opinion in Immunology 2009, 21: 700-707. 60. Yang M, Yang C, Mine Y. Multiple T cell epitope peptides suppress allergic responses in an egg allergy mouse model by the elicitation of forkhead box transcription factor 3- and transforming growth factor-beta-associated mechanisms. Clin Exp Allergy. 2010; 40: 668-678. 61. Chehade M, Mayer L. Oral tolerance and its relation to food hypersensitivities. J Allergy Clin Immunol 2005; 115: 3-12. Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 180-188 62. Zhang X, Izikson L, Liu L, Weiner HL. Activation of CD25(1)CD4(1) regulatory T cells by oral antigen administration. J Immunol 2001; 167: 4245-4253. 63. Sletten GB, Halvorsen R, Egaas E, Halstensen TS. Memory T cell proliferation in cow s milk allergy after CD25+ regulatory T cell removal suggests a role for casein-specific cellular immunity in IgE-mediated but not in non-ige-mediated cow s milk allergy. Int Arch Allergy Immunol. 2007; 142: 190-198. 64. Sakaguchi S, Wing K, Onishi Y, Regulatory T cells: how do they suppress immune responses? Int. Immunol., 2009; 21: 1105-1111. 65. Beyer K, Castro R, Birnbaum A i wsp. Human milk-specific mucosal lymphocytes of the gastrointestinal tract display a TH2 cytokine profile. J Allergy Clin Immunol. 2002; 109: 707-713. 66. Tsuji NM, Mizumachi K, Kurisaki J. Interleukin-10-secreting Peyer s patch cells are responsible for active suppression in low-dose oral tolerance. Immunology. 2001; 103: 458-464. 67. Frossard CP, Tropia L, Hauser C, Eigenmann PA. Lymphocytes in Peyer patches regulate clinical tolerance in a murine model of food allergy. J Allergy Clin Immunol. 2004; 113: 958-964. 68. Karagiannidis C, Akdis M, Holopainen P i wsp. Glucocorticoids upregulate FOXP3 expression and regulatory T cells in asthma.j Allergy Clin Immunol. 2004; 114: 1425-1433. 69. Liao G, Nayak S, Regueiro JR i wsp. GITR engagement preferentially enhances proliferation of functionally competent CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Int Immunol. 2010; 22: 259-270.