3. Materiał i metodyka

3. Materiał i metodyka 3.1. Charakterystyka badanych chorych Prospektywnymi badaniami objęto 130 chorych leczonych w okresie od lipca do grudnia 2002 roku w Zakładzie Rehabilitacji 5 Wojskowego Szpitala Klinicznego - SP ZOZ z powodu reumatoidalnego zapalenia stawów ( r.z.s. ). W grupie tej było 35 mężczyzn i 95 kobiet w wieku 31-68 lat. Wszystkich tych chorych objęto terapią kriogeniczną. Kwalifikacja chorych do leczenia kriogenicznego uwzględniała: badanie podmiotowe - wywiad z pytaniami o chorobę zasadniczą, a także przebyte lub współistniejące schorzenia, które mogą stanowić przeciwwskazanie do krioterapii ogólnoustrojowej, przyjmowane leki, tolerancję zimna przez organizm pacjenta. badanie przedmiotowe - osłuchiwanie płuc i serca, palpacyjne badanie jamy brzusznej, pomiar ciśnienia tętniczego krwi i częstości akcji serca oraz podstawowe badanie neurologiczne. badania dodatkowe - morfologia krwi, badanie ogólne moczu, poziom glikemii, mocznika i kreatyniny, badanie elektrokardiograficzne, echokardiograficzne oraz całodobowe monitorowanie EKG metodą Holtera. Do leczenia niskimi temperaturami nie byli kwalifikowani chorzy, którzy wykazywali: nietolerancję zimna, krioglobulinemię, znacznego stopnia niedokrwistość, chorobę Raynaud, cold urticaria, ropno - zgorzelinowe zmiany skórne, miejscowe zaburzenie ukrwienia, zaburzenia czucia skórnego, niedoczynność tarczycy, wady zastawkowe, choroby mięśnia sercowego w okresie niewydolności krążenia, niestabilną chorobę niedokrwienną serca, zaburzenia rytmu serca, wyniszczenie organizmu, klaustrofobię, nadmierną labilność emocjonalną wyrażającą się między innymi nadmierną potliwością a także eliminowano od leczenia kriogenicznego osoby, u których rozpoznano chorobę nowotworową lub które były aktualnie leczone neuroleptykami bądź przebyły chorobę zakrzepowo - zatorową. 29

Badany materiał chorych przeanalizowano pod kątem wybranych cech klinicznych, takich jak : płeć wiek chorych czas trwania choroby od momentu rozpoznania okresy zaawansowania choroby wg. kryteriów Steinbrockera przy uwzględnieniu zmian całkowitego stanu oksydacyjnego, w erytrocytach rejestrowanych przed - i po zakończeniu leczenia kriogenicznego. Przy analizie wieku chorych uwzględniono następujący podział: 30-39, 40-49, 50 59 i 60-69 lat. Przy ocenie czasu trwania dolegliwości przyjęto następujący podział: do 3 lat, 4-6 lat, 7-10 lat, pow. 10 lat. Ocenę zaawansowania choroby dokonywano w oparciu o badanie chorego ( oglądanie i obmacywanie ) badanie ruchomości stawów, a także w oparciu o radiogramy najbardziej zmienionych chorobowo stawów, przyjmując podział zaproponowany przez Steibrockera [ Brühl (1987) ], wyróżniający: wczesną fazę choroby : I i II okres późną fazę choroby : III i IV okres. 3.2 Metody badań 3.2.1.Metoda krioterapii ogólnoustrojowej w komorze niskich temperatur Budowa kriokomory i ogólne zasady jej działania Badania przeprowadzano w komorze niskotemperaturowej ( kriogenicznej ), która składała się z dwóch połączonych ze sobą pomieszczeń; przedsionka i komory właściwej. Obok komory znajdowało się pomieszczenie sterownicze z komputerowym systemem sterowania pracą komory. Wymiary kriokomory to: długość 250 cm, szerokość 450 cm i wysokość 260 cm. Temperatura wewnątrz przedsionka w trakcie zabiegu wynosiła ok.-60 o C, zaś w komorze właściwej 120 o C. Powietrze doprowadzane do wnętrza komory oczyszczano 30

i schładzano w kriooczyszczalnikach. Stężenie tlenu w powietrzu kriokomory utrzymywano na stałym poziomie 21-22% i kontrolowano w sposób ciągły przez dwie niezależne sondy tlenowe ( tlenomierze ). Spadek stężenia tlenu uruchamiał automatycznie sygnał alarmowy i odcinał dopływ azotu do wymienników, przerywając pracę komory. Ściany komory wyłożone były wielowarstwową izolacją termiczną odpowiednią do stosowanych krańcowo niskich temperatur. Schłodzenie kriokomory do temperatur poniżej 100 o C możliwe jest dzięki wymiennikom ciepła zasilanym azotem ze zbiornika o pojemności 9000 dm 3. Komora niskotemperaturowa wyposażona jest w troje drzwi. Dwoje zewnętrznych łączy przedsionek i komorę właściwą z otoczeniem, zaś wewnętrzne łączą przedsionek i komorę właściwą. Każde z drzwi posiada okno z umieszczonymi w nich grzałkami zapewniającymi dobrą widoczność i stałą kontrolę wzrokową przebiegu zabiegu. Praca komory jest całkowicie zautomatyzowana. Elektroniczny sterownik komory sprzężony jest z komputerem, który służy do wprowadzania parametrów pracy komory i ich monitorowania, jednocześnie ze sterowaniem. Przebieg zabiegu kriogenicznego Chorzy zakwalifikowani do leczenia krioterapią ogólnoustrojową przed każdym wejściem do kriokomory mieli zakładane maski chirurgiczne wyłożone dodatkowo kilkoma warstwami gazy. Informowani byli o konieczności powolnego, możliwie niezbyt głębokiego oddychania. Dodatkowo chorych zabezpieczano wełnianymi skarpetami i rękawiczkami, drewniakami, czapką lub przepaską osłaniającą małżowiny uszne. Mężczyźni byli ubrani w spodenki, a kobiety w kostiumy kąpielowe. Przed wejściem do kriokomory każdy z chorych dokonywał skrupulatnego wytarcia całego ciała ręcznikiem. Nie przestrzeganie tej zasady zagrażało szybkim przekształceniem się w warunkach czynnej kriokomory kropelek potu w kryształki lodu, dając krótkotrwałe, aczkolwiek dotkliwe uczucie zimna, a czasem nawet miejscowe odmrożenia. Tak poinstruowanych i przygotowanych chorych wprowadzano do przedsionka komory, gdzie przez 30 sekund w temperaturze ok.- 60 o C adaptowali się do niskich temperatur. Następnie wchodzili do komory właściwej po 5 osób. Czas zabiegu wynosił 180 sekund. Chorzy przez cały czas przebywania w komorze pozostawali w kontakcie wzrokowym z obsługą urządzenia, w której zawsze znajdował się lekarz kwalifikujący chorych do zabiegu. Łączna liczba zabiegów wynosiła 10 w sesji z częstotliwością 1 zabieg dziennie. 31

Ilość zabiegów w sesji jest zgodna z zaleceniami Zakładu Rehabilitacji Reumatolo- gicznej Instytutu Reumatologicznego w Warszawie [ Księżopolska-Pietrzak (2000) ]. 3.2.2. Oznaczanie całkowitego stanu antyoksydacyjnego erytrocytów Oznaczania te u każdego z badanych wykonano: 1-2 dni przed rozpoczęciem leczenia kriogenicznego ( Ko ), do godziny od zakończenia sesji 10 zabiegów ( K 1 ), a następnie po 14 dniach od zakończenia sesji ( K 2 ). Badania analityczne przeprowadzono w Katedrze Biochemii Klinicznej Collegium Medium UJ z wykorzystaniem testów firmy Randox. Procedura analityczna Krew pobierano z żyły odłokciowej systemem aspiracyjno - próżniowym firmy Sarstedt do probówki hematologicznej z heparyną, a następnie probówkę wirowano w przez 5 min przy 2000 obr/min., po czym usuwano osocze. Pozostające na dnie probówki krwinki przepłukiwano trzykrotnie przy pomocy 0,9% roztworu wodnego NaCl, w którym zawieszano krwinki, wirując za każdym razem przez 5 min przy 2000 obr/min. Po ostatnim przepłukaniu, odwirowaniu i usunięciu supernatantu, do krwinek dodano zimnej, redestylowanej wody i po wymieszaniu pozostawiono w lodówce na 10 min. przy +4 o C. Hemolizat ponownie odwirowywano przez 5 min przy 2000 obr/min., a następnie rozcieńczano go 20-krotnie 0,9% roztworem NaCl i używano do oznaczenia. Metodyka Zasady biochemiczne wykorzystywane w metodzie Aby wytworzyć kationorodnik ABTS ( ABTS : 2,2-azino-di/3-thylbenzthiazoline sulphonate ) należy ABTS inkubować z peroksydazą ( metmyoglobina ) i nadtlenkiem wodoru ( H 2 O 2 ). W wymienionym procesie chemicznym powstaje względnie stabilny niebiesko-zielony barwnik, którego absorbancję mierzymy przy 600 nm. Znajdujące się antyoksydanty w badanej próbie powodują zmniejszanie wytwarzania barwnika, proporcjonalnie do stopnia ich stężenia w badanym materiale. Główne reakcje chemiczne: 32

HX-Fe III + H 2 O 2 -.. X - /Fe IV = O/ + H 2 O ABTS +. X (Fe IV = O) - ABTS.- HX - Fe III HX Fe III = Metmyoglobin. X - /Fe IV = O/ = Ferrylmyoglobin Wykonanie oznaczenia: Po zmieszaniu próbki ( 20 μl ) z chromogenem ( metmyoglobin 6,1 μmol/l; ABTS 610 μmol/l ) odczytujemy początkową absorbancję ( A 1 ) a następnie dodajemy substratu ( nadtlenek wodoru 250 μmol/l ). Po dokładnym zmieszaniu odczytujemy absorbancję próbek dokładnie po upływie 3 min. ( A 2 ). Obliczamy różnicę absorbancji między A 2 i A 1. Obliczenie Faktor = -stężenie standardu/ (ΔA Śl - ΔA st )mmol/l = Factor x (ΔA Śl - ΔA B ) Wartości referencyjne: 1,3 1,77 mmol/l surowicy 33