Tetracykliny działanie, zastosowanie oraz metody wykrywania ich obecności w żywności pochodzenia zwierzęcego i paszach Patyra E. Zakład Higieny Pasz, Państwowy Instytut Weterynaryjny Państwowy Instytut Badawczy Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy, ewelina.patyra@piwet.pulawy.pl Streszczenie Tetrracykliny (TC) to antybiotyki o szerokim spektrum działania, przez co znalazły zastosowanie w leczeniu szeregu jednostek chorobowych zarówno u ludzi jak i w medycynie weterynaryjnej. TC są antybiotykami najczęściej zlecanymi przez lekarzy weterynarii w celach leczniczych i profilaktycznych zwierząt gospodarskich. Nadużywanie tych substancji przeciwbakteryjnych wiąże się z możliwością obecności ich pozostałości w żywności pochodzenia zwierzęcego oraz paszach, dlatego ważne jest prowadzenie monitoringu występowania pozostałości tych leków w żywności oraz kontroli ich zawartości w paszach leczniczych i ich pozostałości w paszach czyszczących. Celem tego artykułu jest zaprezentowanie mechanizmu działania, zastosowania tetracyklin oraz uregulowań prawnych dotyczących obecności tych antybiotyków w żywności pochodzenia zwierzęcego oraz paszach i przedstawienie metod analitycznych stosowanych do oznaczania i wykrywania TC.
Tetracykliny działanie, zastosowanie oraz metody wykrywania ich obecności w żywności pochodzenia zwierzęcego i paszach Ewelina Patyra Zakład Higieny Pasz, Państwowy Instytut Weterynaryjny Państwowy Instytut Badawczy Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy, ewelina.patyra@piwet.pulawy.pl Wprowadzenie Antybiotyki z grupy tetracyklin zostały odkryte w 1945 r. Tetracykliny (TC) to rodzina antybiotyków, posiadająca zdolność hamowania syntezy białek poprzez uniemożliwienie związania bakteryjnego aminoacylo-trna do rybosomów. Antybiotyki te wykazują szerokie spektrum działania, zarówno wobec bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych, drobnoustrojów z rodzaju Ricketsia, Coxiella i Mycoplasma oraz krętków i niektórych bakterii z rodzaju Mycobacterium (19). Korzystne właściwości przeciwbakteryjne i brak niepożądanych działań ubocznych doprowadziły do ich szerokiego zastosowania w terapii zakażeń bakteryjnych występujących u ludzi i zwierząt. Ponadto antybiotyki te przez długi czas stosowane były w produkcji zwierzęcej jako tzw. antybiotykowe stymulatory wzrostu (ASW), przyspieszające wzrost zwierząt gospodarskich. Od 1 stycznia 2006 r. w Unii Europejskiej obowiązuje całkowity zakaz stosowania ASW (31). Legalnym sposobem podawania substancji antybiotycznych zwierzętom hodowlanym jest iniekcja, dodatek do wody pitnej lub podawanie chemioterapeutyków w postaci pasz leczniczych. Podawanie substancji przeciwbakteryjnych znajduje się pod ścisłą kontrolą. Substancje antybiotyczne mogą być podawane zwierzętom tylko na zlecenie lekarza weterynarii opiekującego się danym stadem. Współczesne metody produkcji zwierzęcej wydają się prawie niemożliwe bez stosowania antybiotyków, szczególnie w celach terapeutycznych i profilaktycznych. Występowanie ogromnej liczby zwierząt zgromadzonych na ograniczonej powierzchni w nienajlepszych warunkach zoohigienicznych sprzyja m. in. rozprzestrzenianiu się chorób zakaźnych. Obecnie w produkcji zwierzęcej antybiotyki są powszechnie stosowne jako czynniki zapobiegające występowaniu chorób. Szerokie stosowanie antybiotyków w produkcji zwierzęcej może doprowadzać do obecności pozostałości tych związków w jadalnych tkankach zwierzęcych, jajach oraz
mleku, co może powodować powstawanie reakcji alergicznych u ludzi i nabywania lekooporności przez bakterie. Dlatego też w celu zapewnienia bezpieczeństwa i zdrowia ludzi Unia Europejska oraz Stany Zjednoczone ustaliły dopuszczalne poziomy (PL) i najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości (MRL) na obecność tetracyklin i innych substancji przeciwbakteryjnych w produktach pochodzenia zwierzęcego (5,14). Pod szczególnym nadzorem znajdują się także pasze lecznicze i pasze czyszczące powstające w trakcie czyszczenia linii technologicznych. W przypadku pasz leczniczych ważne jest, aby kontrolować zawartość substancji aktywnych w partii wyprodukowanego towaru na zgodność z deklaracją producenta oraz eliminować przypadki nadużyć substancji przeciwbakteryjnych w paszach. Historia i klasyfikacja tetracyklin Systematyczne badania nad antybiotykami w latach 40-tych XX w. doprowadziły do odkrycia pierwszych przedstawicieli tetracyklin chlorotetracykliny i oksytetracykliny. Antybiotyki te są wytwarzane przez bakterie Streptomyces aureofaciens i S. rimosus. Kolejne antybiotyki z tej grupy zostały odkryte w kolejnych latach, jako naturalnie występujące cząsteczki, np. tetracyklina wyizolowana z drobnoustrojów S. aurefaciens, S. rimosus i S. viridofaciens oraz demeklocyklina otrzymana z S. aureofaciens lub też produkty półsynetyczne takie jak: metacyklina, doksycyklina i minocyklina (8). Pomimo sukcesów pierwszych tetracyklin poszukiwano analogów posiadających większą zdolność rozpuszczania w wodzie w celu umożliwienia podawania pozajelitowego lub zwiększenia wchłaniania po podaniu doustnym. Spowodowało to, iż nastąpił rozwój półsynetycznych związków takich jak rolitetracyklina i limecyklina. Niedawno odkryta grupa związków półsynetycznych to glikocykliny, np.: 9-(N,N-dimetyloglikoamido)-6-demetylo-6- deoksytetracyklina, 9-(N,N-dimetyloglikoamido)-minocyklina i T-9-(butyloglikoloamido)- minocyklina, posiadające podstawnik 9-glikoamidowy. Antybiotyki z rodziny tetracyklin można podzielić na 3 generacje: antybiotyki pierwszej generacji, odkryte w latach 1948 1963, drugiej generacji 1965-1972 r. oraz tetracykliny trzeciej generacji wynalezione w lata 90-tych XX w. Niektóre z opisywanych związków, takie jak np.: klomocyklina nie są już obecne na rynku, a inne, np. rolitetracyklina, limecyklina i chlorotetracyklina nie są dopuszczone do stosowania we wszystkich krajach (5). Aktywność przeciwbakteryjna Tetracykliny są antybiotykami o szerokim zakresie działania. Wykazują aktywność wobec wielu bakterii Gram-dodatnich (Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus,
Enterococcus) i Gram-ujemnych (Neisseria gonorrhoae, Vibrio cholerae, Shigelle dysenteriae, Brucella) oraz w stosunku do niektórych bakterii beztlenowych. Działają bakteriostatycznie na chlamydia, mykoplazmy, riketsje oraz niektóre wirusy (32). Należy zauważyć, że ze względu na lekooporność drobnoustrojów, używanie TC w leczeniu schorzeń wywołanych przez gronkowce, paciorkowce i pneumokoki jest ograniczone. Szerokie spektrum antybakteryjne TC związane jest z ich dobrą absorpcją, niską toksycznością i stosunkowo niskimi kosztami otrzymywania (15). Mechanizm działania i oporność na tetracykliny Tetracykliny hamują rozwój bakterii poprzez blokowanie syntezy białek. Antybiotyki te wiążą się do rybosomu 30S podjednostki białka S7 i blokują przyłączanie bakteryjnego aminoacylo-trna do miejsc akceptorowych na m-rna, uniemożliwiając translację (32). Połączenie TC z rybosomami jest procesem odwracalnym wspieranym przez białka rybosomalne oraz niektóre geny 16S-rRNA. Do interakcji z cząsteczkami docelowymi, tetracykliny muszą przenikać przez komórki bakteryjne i przechodzić przez błony komórkowe. W przypadku drobnoustrojów Gram-ujemnych, tetracykliny przechodzą przez błonę zewnętrzną w postaci dodatnio naładowanych kompleksów magnez-antybiotyk oraz przez błonę cytoplazmatyczną w wyniku biernej dyfuzji jako nie naładowane cząsteczki lipofilowe (5, 33). Ruchy błony cytoplazmatycznej bakterii Gram-dodatnich zależne są od energii. W cytoplazmie tetracykliny mogą tworzyć kompleksy, ponieważ ph i stężenie jonów metali dwuwartościowych wewnątrz komórki jest wyższe niż na zewnątrz. W związku z tym aktywne postaci tych leków wiążące się do rybosomów to kompleksy magnez-tetracyklina (5, 20). Słabe hamowanie syntezy białek rybosomów 80S i niewielka akumulacja TC w komórkach ssaków wyjaśnia ich brak aktywności w stosunku do komórek eukariotycznych. Tetracykliny hamują syntezę rybosomów 70S w mitochondriach, dlatego też niektóre z działań niepożądanych mogą wystąpić u ludzi, ale tylko po podaniu dużych dawek antybiotyku (5). W ciągu ostatnich dwóch dekad wykorzystywanie tetracyklin w wielu zakażeniach bakteryjnych zostało ograniczone ze względu na powszechny rozwój bakterii opornych na działanie antybiotyków z grupy tetracyklin. Wykształcone przez wiele rodzajów drobnoustrojów mechanizmy ochronne na działanie tetracyklin polegają na przyłączaniu pewnych genów do rybosomów bakteryjnych uniemożliwiając w ten sposób wiązanie antybiotyku do rybosomu, bądź też wydalaniu antybiotyków z komórki zaraz po
wniknięciu. Ochrona rybosomalna jest rozwinięta przede wszystkim u bakterii Gramdodatnich natomiast ochrona poprzez wyciek z komórki u bakterii Gram-ujemnych (32). Aby rozwiązać problemy wynikające z pojawiania się bakterii lekoopornych na antybiotyki z grupy tetracyklin, na początku lat 90-tych XX w. rozpoczęto badania mające na celu uzyskanie nowych pochodnych tetracyklin wykazujących aktywność przeciwbakteryjną wobec szczepów opornych. Modyfikacja grupy arylowej w pochodnych 9-acyloamidowych minocykliny poprzez włączenie grupy N,N-dialkiloaminowej wykazuje aktywność wobec drobnoustrojów opornych na tetracykliny. Glikocyckliny obecnie są w fazie badań klinicznych, ale wiąże się z nimi duże nadzieje w zwalczaniu bakteryjnych szczepów opornych na tradycyjne tetracykliny (15). Zastosowanie tetracyklin w weterynarii Tetracykliny stosowane są w weterynarii w leczeniu zapalenia błony śluzowej żołądka, zapalenia wątroby, leczeniu chorób układu oddechowego, układu moczowopłciowego oraz zakażeń bakteryjnych skóry i zakażeń wielonarządowych. Stosowanie antybiotyków z grupy tetracyklin w weterynarii jest regulowane odpowiednimi przepisami UE i FDA. Organizacje te dopuszczają do stosowania w medycynie weterynaryjnej antybiotyki z grupy tetracyklin, takich jak oksytetracyklina, tetracyklina, doksycyklina i chlorotetracyklina, natomiast gatunkami zwierząt, u których mogą być zastosowane te antybiotyki to bydło, świnie, owce, kozy, psy, koty, drób oraz króliki i ryby (24). Tetracykliny podaje się doustnie lub pozajelitowo w dawkach od 10 do 50 mg/kg masy ciała, w zależności od przygotowania leku i gatunku zwierząt. Teteracykliny nie mogą być podawane drogą per os przeżuwaczom z powodu możliwości zniszczenia mikroflory żwacza. Dożylne podawanie tych antybiotyków może natomiast powodować zaburzenia krążenia krwi, zapaść oraz nieprawidłowości w zapisie elektrokardiograficznym, co może być spowodowane chelatowaniem wolnych jonów wapnia. Podawanie tetracyklin jest zabronione w drugiej połowie ciąży oraz zwierzętom poniżej pierwszego miesiąca życia ponieważ powodują odbarwienie zębów oraz nieprawidłowości w formowaniu i rozwoju kości ze względu na tworzenie kompleksów z jonami wapnia. Wszelkie połączenia TC z lekami zobojętniającymi kwasy żołądkowe, jonami wapnia, żelaza, sodu mogą powodować zmiany ich stężenia we krwi (32). TC stosowane są głównie w profilaktyce i leczeniu zakażeń bakteryjnych układu oddechowego i przewodu pokarmowego. Obecnie są szeroko stosowane w postaci pasz leczniczych w leczeniu i profilaktyce całych grup zwierząt. Pasze lecznicze stosowane są głównie u trzody chlewnej i drobiu. Do 1975 r. tetracykliny stosowane były w dawkach
subterapeutycznych jako dodatki paszowe stymulujące wzrost zwierząt gospodarskich. W związku z pojawieniem się drobnoustrojów lekoopornych zakazano ich stosowania jako antybiotykowych stymulatorów wzrostu. Zastosowanie tetracyklin w medycynie Głównymi wskazaniami do podawania tetracyklin u ludzi są zakażenia wywołane przez bakterie, głównie E. coli i H. influenzae, zakażenia przewodu pokarmowego oraz bakteryjne zakażenia układu oddechowego, przewodu pokarmowego, brucelozy, tularemii, leptospirozy, dżumy, cholery i riketsjozy. Podawanie tetracyklin nie jest wskazane kobietom ciężarnym, w przypadku niewydolności wątroby i nerek oraz dzieciom poniżej 12 roku życia. Działaniami niepożądanymi mogącymi pojawić się po przyjęciu antybiotyków z grupy tetracyklin są zaburzenia żołądkowo-jelitowe, zmiany zabarwienia skóry i zębów, niewydolność wątroby i zespół Fanconiego u dzieci. (5,32). Leki z tej grupy reagują z jonami wapnia tworząc nierozpuszczalne i nieaktywne kompleksy. Z uwagi na to nie należy ich przyjmować z preparatami zawierającymi wapń. Ich skuteczność jest również osłabiona poprzez spożywanie pokarmów zawierających dużo jonów wapnia, magnezu, żelaza i glinu. Tetracykliny działają antagonistycznie z cefalosporynami i penicylinami. Uwagę należy zwrócić na okres ważności preparatów zawierających tetracykliny, gdyż po upływie daty ważności można poważnie uszkodzić nerki. Tetracykliny są silnymi wypieraczami innych leków połączonych z białkami krwi powodując zaburzenia krzepnięcia, mają wpływ na stężenie glukozy we krwi, osłabiają efekt działania doustnych leków antybakteryjnych. Nie powinny być stosowane równocześnie z lekami psychotropowymi (np. karbamazepiną) i witaminą A (17). Regulacje prawne dla antybiotyków weterynaryjnych Zastosowanie antybiotyków z grupy tetracyklin w leczeniu i zapobieganiu występowaniu chorób zakaźnych u zwierząt, może powodować pozostawanie ich pozostałości w mleku, jajach i mięsie, które po spożyciu przez ludzi mogą okazać się toksyczne bądź powodować reakcje alergiczne. Nawet niski poziom antybiotyków spożywanych przez dłuższy czas może doprowadzić do pojawienia się drobnoustrojów opornych na działanie danego antybiotyku. Unia Europejska uznała za jeden z ważnych celów swojej działalności zapewnienie bezpieczeństwa żywności pochodzenia zwierzęcego oraz ochronę zdrowia konsumentów. Liczne Rozporządzenia i Dyrektywy wydane przez UE zajmują się kwestią bezpieczeństwa żywności, z których niektóre przepisy regulują stosowanie antybiotyków w medycynie weterynaryjnej i hodowli
zwierząt, jak również kontrolę ich pozostałości w żywności pochodzenia zwierzęcego. Stosowanie tetracyklin w weterynarii jako dodatków paszowych i stymulatorów wzrostu zostało zakazane w krajach Unii Europejskiej w roku 1975 zgodnie z Dyrektywą 70/524/EWG (37). Ponadto UE w celu ochrony zdrowia konsumentów opracowała maksymalne poziomy pozostałości (MRL) dla produktów leczniczych weterynaryjnych w środkach spożywczych, w drodze rozporządzenia Rady 2377/90/EC (38). Zgodnie z tym rozporządzeniem, wszystkie rodzaje pozostałości PLW sklasyfikowane są w czterech kategoriach. Pierwsza kategoria zawiera substancje, dla których zostały zdefiniowane maksymalne limity pozostałości (MRL), druga zawiera substancje, dla których nie zostały ustalone poziomy MRL, natomiast trzecia i czwarta kategoria zawiera substancje o ustalonym tymczasowym poziomie MRL oraz bez poziomów tolerancji. Tetracykliny należą do pierwszej kategorii. Maksymalne limity pozostałości zostały ustalone na 100 µg/kg w tkankach oraz mleku dla wszystkich TC, natomiast dla jaj, wątroby i nerek MRL ustalono na 200, 300 i 600 µg/kg. Ważnym rozporządzeniem jest również Dyrektywa Rady 96/23/EC (39) określająca warunki i metody kontroli pozostałości środków przeciwbakteryjnych w produktach takich jak: mięso, jaja, mleko i miód. Dyrektywa dzieli wszystkie pozostałości na dwie grupy. W grupie A znajdują się substancje bez wyznaczonego poziomu MRL, w grupie B substancje dla których wyznaczono maksymalne poziomy pozostałości, w tym leki weterynaryjne. W UE nie ma zdefiniowanych standardowych technik i metod, które są obowiązkowo wykorzystywane przez laboratoria do kontroli pozostałości substancji przeciwbakteryjnych. Dyrektywa 96/23/WE określa metody działania, kryteria i ograniczenia, które powinny spełniać techniki i metody wybrane do badania. Decyzja Rady 657/2002/EC (40) uzupełnia wymogi stawiane przez Dyrektywę 96/23/WE i definiuje z dokładnością wybór technik i metod analitycznych, które mogą być stosowane jako metody potwierdzające w kontroli pozostałości produktów leczniczych weterynaryjnych w żywności pochodzenia zwierzęcego. Techniki analityczne zalecane do stosowania w analizie pozostałości to chromatografia cieczowa (LC) i chromatografia gazowa w połączeniu z detektorem mas bądź spektroskopią w podczerwieni (MS i IR) dla substancji należących dla grupy A natomiast dla substancji z grupy B zalecana jest chromatografia cieczowa z detektorem diodowym i fluoroscencyjnym. W przypadku pasz leczniczych nie ma żadnych wytycznych do stosowania odpowiednich metod analitycznych, dlatego jedną z najczęściej stosowanych metod oznaczania tetracyklin w Polsce są obecnie testy mikrobiologiczne.
Metody analizy tetracyklin w żywności Najczęściej wykorzystywaną techniką oznaczania antybiotyków z grupy tetracyklin w żywności stanowi chromatografia cieczowa z detektorem diodowym, fluorescencyjnym bądź z detektorem mas (LC-MS, LC-MS/MS). Techniki chromatograficzne stanowią 80% wszystkich technik wykorzystywanych do analiz tetracyklin w próbkach żywnościowych. Jednym z głównych problemów oznaczania tetracyklin z wykorzystaniem techniki chromatografii cieczowej jest obecność dwóch grup ketonowych w cząsteczce antybiotyku, które łatwo chelatują z jonami metali. Mają przez to tendencję do nieodwracalnego wiązania się do fazy stacjonarnej kolumny chromatograficznej z grupami silanolowymi krzemionki, stanowiącej wypełnienie kolumny. Problem ten został rozwiązany poprzez dodanie kwasu szczawiowego do fazy ruchomej lub też przez zastosowanie kolumn chromatograficznych z wypełnieniem polistyrenowodiwinylobenzenowym. Najczęściej stosowanymi kolumnami chromatograficznymi do rozdziału TC są kolumny z wypełnieniem C18 i C8. Prawie połowa z proponowanych metod chromatograficznych wiąże się z zastosowaniem jako składnika fazy ruchomej kwasu szczawiowego, często wykorzystywany jest bufor fosforanowy, kwas mrówkowy i EDTA. Najtrudniejszym i najbardziej czasochłonnym etapem w każdej metodzie analitycznej stosowanej w analizie żywności jest etap ekstrakcji i izolacji TC z matryc biologicznych. Etap ten wymaga dobrania odpowiedniego rozpuszczalnika, czasu ekstrakcji oraz odpowiedniej procedury oczyszczania. Problem z wydobyciem tetracyklin z matryc biologicznych wiąże się, tak jak w przypadku kolumn chromatogrficznych z tym, że TC łączą się nieodwracalnie z grupami silanolowymi krzemionki (C8, C18) tworzą kompleksy z jonami metali dwuwartościowych, a także łączą się z białkami próbek, dlatego też do ekstrakcji tych antybiotyków z próbek żywnościowych stosowane są rozpuszczalniki o ph kwasowym celem deprotenizacji próbek. Do ekstrakcji TC z matryc żywnościowych stosowane są kwaśne roztwory buforowe często w połączeniu z czynnikiem chelatującym. Najczęściej stosowany jest roztwór buforu McIlvaine a z Na 2 EDTA, bufor bursztynianowy oraz cytrynianowy w różnych stężeniach i kwas trichlorooctowy (TCA), a także odczynniki organiczne takie jak metanol, acetonitryl i octan etylu. Do oczyszczania ekstraktów używa się najczęściej techniki ekstrakcji do fazy stałej (SPE) z użyciem kolumienek C18 lub hydrofilowo-lipofilowych (HLB-SPE). Do innych technik oczyszczania ekstraktów stosowana jest ekstrakcjia ciecz-ciecz i mikroekstrakcja dyspersyjna do fazy stałej. Natomiast odczyt uzyskanych wyników
uzyskiwany jest przy zastosowaniu takich detektorów jak detektor diodowy (DAD), fluoroscencyjny (FLD) oraz detektor mas (MS, MS/MS). Do innych metod oznaczania pozostałości tetracyklin w żywności pochodzenia zwierzęcego stosowne są testy mikrobiologiczne, z użyciem jako szczepu testowego Bacillus cereus, B. subtilis (1, 25, 28), a także elektroforeza kapilarna (13, 35), fluorymetria (34) biosensory luminescencyjne (10, 11, 18, 30), chromatografia cienkowarstwowa (TLC) (4, 26, 27) oraz test ELISA. Metody oznaczania tetracyklin w paszach Antybiotyki z grupy tetracyklin stosowane są w profilaktyce i leczeniu chorób zakaźnych zwierząt gospodarskich, głównie trzody chlewnej i drobiu. Ze względu na to, iż podawanie antybiotyków pojedynczym zwierzętom jest trudne do zrealizowania, antybiotyki podawane są całemu stadu w postaci pasz leczniczych. Według ustawy o paszach z dnia 22 lipca 2006 r. za paszę leczniczą uważa się mieszaninę jednego lub kilku premiksów leczniczych weterynaryjnych z jedną lub kilkoma paszami, przeznaczoną ze względu na swoje właściwości profilaktyczne lub lecznicze, do podawania zwierzętom w formie niezmienionej. Zgodnie z tą ustawą, pasza lecznicza może być wytwarzana wyłącznie w zakładzie zatwierdzonym przez właściwego wojewódzkiego lekarza weterynarii. Z kolei proces technologiczny produkcji pasz powinien być poddawany szczegółowej kontroli, zarówno wewnętrznej (zakładowa kontrola jakości) jak i zewnętrznej, pełnionej przez Inspekcję Weterynaryjną. Głównym celem kontroli zewnętrznej jest ustalenie zawartości substancji czynnej w partii paszy leczniczej oraz jej jednorodnego wymieszania, czyli sprawdzenie jej homogeniczności. Kontrola ta ma na celu badanie trwałości paszy leczniczej, deklarowanej przez producenta zawartości substancji czynnej oraz ustalenie czasu jej bezpiecznego składowania. Pod kontrolą znajdują się również tzw. pasze czyszczące powstające w trakcie czyszczenia linii technologicznych. Kontrola tego rodzaju pasz wymagana jest ze względu na ograniczenia wprowadzania na rynek pasz zawierających subterapeutyczne dawki substancji antybiotycznych. Próby pasz pobierane są również bezpośrednio z gospodarstw przez inspektorów weterynaryjnych w ramach urzędowej kontroli pasz. Wzrastająca produkcja pasz leczniczych zmusza do opracowywania odpowiednich, nowoczesnych metod analitycznych. Metodami analitycznymi używanymi do analizy obecności tetracyklin w paszach dla zwierząt są testy mikrobiologiczne (7), chromatografia cienkowarstwowa (TLC) (21), wysokosprawna chromatografia cieczowa (22, 23), chromatografia cieczowa z detektorem
mas (9) oraz wysokosprawna elektroforeza kapilarna (HPCE) (3, 36). Klasyczne metody mikrobiologiczne pozwalające na oznaczenie zawartości bądź stwierdzenie obecności antybiotyków z grupy tetracyklin są przede wszystkim niespecyficzne i czasochłonne. Szczepami testowymi w tej metodzie są drobnoustroje z rodzaju Bacillus (B. subtilis, B. cereus). Testy mikrobiologiczne jak i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) nie daje dokładnego wyniku ilościowego oznaczanych antybiotyków. Technika wysosokosprawnej chromatografii cieczowa (HPLC) służy do oznaczania tych antybiotyków w paszach dla zwierząt, ale jest podatna na wpływy związków znajdujących się w matrycy paszowej, a czułość jest niewystarczająca do oznaczania pozostałości TC w paszach. Metodą, która daje najbardziej wiarygodne wyniki oznaczania pozostałości TC w paszach jest technika chromatografii cieczowej z detektorem mas (LC-MS). Technika ta wykazuje dobrą czułość na poziomie zanieczyszczeń śladowych w żywności i paszach i jest skuteczna w potwierdzaniu analitu docelowego. Jedną z nowych dostępnych metod analizy chemicznej do oznaczania pozostałości TC w paszach jest wysokosprawna elektroforeza kapilarna (HPCE). Należy zaznaczyć, iż pasze dla zwierząt są złożoną i zmienną matrycą zawierającą węglowodany, białka, tłuszcze, związki mineralne, witaminy i inne dodatki. Ponadto pasze różnią się znacznie składem, w zależności od gatunku zwierząt, płci, wieku, stosowanej diety. Z tych względów opracowanie odpowiednich metod analizy tego rodzaju matryc jest praco i czasochłonne. W literaturze światowej istnieją nieliczne doniesienia na temat metod stosowanych w celu wykrywania obecności TC i oznaczania ilościowego tych antybiotyków w paszach leczniczych. Należy mieć na uwadze to, iż stosowanie dawek subtetrapeutycznych antybiotyków oraz ich nadużywanie w produkcji zwierzęcej może mieć konsekwencje dla zdrowia człowieka poprzez wystąpienie reakcji alergicznych i toksycznych oraz rozwój drobnoustrojów lekoopornych na działanie środków przeciwbakteryjnych. Wybrane metody analityczne opierające się o wykorzystanie techniki chromatografii cieczowej dostępne w literaturze światowej zestawiono w tabeli 1.
Tab. 1. Przegląd metod HPLC wykorzystywanych do oznaczania tetracykli w paszach Analit Próbka Przygotowanie próbek Warunki chromatograficzne Detekcja Odzysk (%) Autor CTC Pasza dla drobiu/trzody chlewnej Ekstrakcja: 4N HCl-aceton-H2O (1:8:6 v/v/v), homogenizacja, wirowanie, filtracja, oczyszczanie SPE, kolumienki C 18 Kolumna Nova-Pack C 18, faza ruchoma 0,01 M kwas szczawiowy/ch3oh/acn (3.5:1.5:1 v/v/v), ph 2, przepływ 1 ml/min UV 370 nm Premiksy 94,6 %, pasza dla przeżuwaczy: 74,8 83,2% Pasza dla drobiu/trzody chlewnej 70,5 82,9 (57) (12) OTC Pasza dla ryb Ekstrakcja: octan etylu z dodatkiem 0,01M EDTA, warstwę organiczną odparować, oczyścić na kolumienkach SPE C 18 Kolumna ODS 5 µm faza ruchoma ACN/THF/0,01 M (ph 3) (15:3:82 v/v/v). Przepływ 1ml/min, standard wewnętrzny: tetracyklina UV 365 nm OTC: 93,6 98,1% (16) OTC, TC, CTC, epimery Pasza dla zwierząt Ekstrakcja: bufor bursztynianowy (ph 4), oczyszczanie: kolumienki C 18 Kolumna: LiChrospher RP- C 18, 5 µm. Faza ruchoma: 0,01M kwas szczawiowy ACN (50:50). Szybkość przepływu 0,9 ml/min UV-DAD 360 nm OTC, TC: 65%; CTC: 50% (16) OTC, TC, CTC, DC, MNC, epimery Pasza dla zwierząt Ekstrakcja: 1:1 ACN:H2O (ph 3 skorygowane za pomocą 0,01M kwasu cytrynowego; filtracja Kolumna: Hypersil ODS 5 um, 22ºC. faza ruchoma: 0,05M siarczan dodecylusodu/5% butanol (ph 3). Przepływ 1 ml/min DAD 364 nm OTC: 52-80%; TC: 64-88%; CTC: 66-89%; MNC: 84-95%; DC: 74-89% (65) (2) OTC, TC, CTC Pasza dla zwierząt Ekstrakcja: bufor McIlvain a ph 2; reekstrakcja: bufor Mcilvaine a ph 4.5, wirowanie, filtracja Kolumna: Nova-Pak RP- C 18 Faza ruchoma: MeOH:ACN:0,01M kwas szczawiowy (1+1.5+6.5). Przepływ 0,75 ml/min UV 370 nm OTC: 55,8 75,5% TC: 71,6 100,0% CTC: 22,4 60,6% (22)
CTC, 4-epi-CTC Pasza dla zwierząt Ekstrakcja: bufor McIlvaine a ph 2; wirowanie, filtracja Kolumna: Nova-Pak RP- C 18 Faza ruchoma: MeOH:ACN:0,01M kwas szczawiowy (1+1.5+6.5). Przepływ 0,75 ml/min UV 370 nm Brak danych (23) DC, epi-dc, MTC Premiks do sporządzania paszy leczniczej Ekstrakcja: 80:20 woda: acetonitrtyl+1,5 ml 0,1N HCL, podgrzać do 45µC i mieszać 30 min, przefiltrować. Kolumna: Phenomenex Luna C 18. Faza ruchoma: 0,02M kwas szczawiowy:acn :MeOH (75:17:8 v/v/v), przepływ 0,3 ml/min Kolumna: Synergi Polar-RP. Faza ruchoma: 0,02M kwas szczawiowy: ACN (82:18 v/v) DAD 346 nm Brak danych (6) TC, CTC, OTC Pasza dla ryb Ekstrakcja: Mech:H2O (70:30 v/v) + 0,1 M EDTA, odwirować Kolumna: Mediterranean sea18. Faza ruchoma: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie (A) : ACN (B); elucja gradientowa: 0 10 min 5% B, 10 35 min 90% B, 35 45 min 5% B, przepływ 0,3 ml/min ESI-MS/MS OTC: 104% TC: 90% CTC: 108% (3) CTC, OXT, TC, DC DC, epi-dc, MTC Pasza dla trzody chlewnej/ drobiu Premiks do sporządzania paszy leczniczej Ekstrakcja: bufor McIlvaine a ph 4, odwirować, przesączyć przez filtr bibułowy Whatman No. 2, reekstrakcja buforem McIlvainea, oczyszczanie: kolumienki Oasis HLB Ekstrakcja: 80:20 woda: acetonitrtyl+1,5 ml 0,1N HCL, podgrzać do 45 C i mieszać 30 min, przefiltrować. Kolumna: Xbridge C 18. Faza ruchoma: 0,3% kwas mrówkowy w wodzie (A): 0,3% kwas mrówkowy w ACN (B), elucja gradientowa: 0 5 min 10% B, 5 10 min 40% B, 10 15 min 10% B (A) Kolumna: Luna C 18. Faza ruchoma: 0,02 M bufor octanowy z trietyloaminą (ph 8): MeOH (70:30 v/v). przepływ 0,3 ml/min (B)Kolumna: Phenomenex Luna C 18. faza ruchoma: 0,01% kwas octowy (ph 3): ACN: MeOH (75:10:15 v/v/v) (C)Kolumna: Phenomenex Synergi Polar-RP. Faza ruchoma: 0,1% TFA/NH 3 w wodzie (ph 2,5) : ACN (87:13 v/v). Przepływ 0,3 ml/min MS/MS CTC trzoda/drób: 88,5/90,9% OTC trzoda/drób: 106,4/115,5% TC trzoda/drób: 96,2/96,6% DC trzoda/drób: 98,5/100,9% (Liang Guo) ESI -MS DC: 99,67 101,20% (9) (6)
CTC, DC Pasza lecznicza Ekstrakcja: bufor McIlvaine a ph 2,5; wirowanie, reekstrakcja: bufor McIlvaine a ph 4, wirowanie, oczyszczanie: kolumienki C 18, filtracjia Kolumna: Phenomenex Luna C 18. Faza ruchoma: (A)MeOH: (B) ACN: (C 0,05 M kwas szczawiowy, elucja gradientowa : 0-5 min 13 % A, 12% B, 75% C, 5-20 min 35% A, 20% B, 45% C, 20 25 min 13 % A, 12% B, 75% C Przepływ: 1ml/min Standard wewnętrzny: tetracyklina DAD 390 nm DC 85,1 98,4% CTC: 91,4 95,5% (29)
Podsumowanie Tetracykliny są najczęściej wykorzystywanymi antybiotykami w terapii chorób zakaźnych w medycynie ludzkiej i weterynarii. W weterynarii ich zużycie w 2010 r. w Polsce wyniosło aż 171, 589 ton, co stanowiło ok. 59% całkowitego zużycia przeciwbakteryjnych leków weterynaryjnych w Polsce. Zapobieganie występowania objawów chorobowych w stadach zwierząt wiąże się z ich częstym stosowaniem, co może skutkować pozostałością tych związków przeciwbakteryjnych w żywności pochodzenia zwierzęcego. W przypadku żywności pochodzenia zwierzęcego, takiej jak jaja, mleko, mięso i miód UE reguluje odpowiednimi przepisami poziomy maksymalnych zawartości substancji przeciwbakteryjnych oraz metody ich analizy. W przypadku pasz leczniczych nie ma regulacji prawnych dotyczących analizy zawartości i pozostałości antybiotyków z grupy tetracyklin. Dlatego ważne jest opracowywanie nowych, czułych, specyficznych i wiarygodnych metod analitycznych, celem zapewnienia poprzez pasze ochrony zdrowia ludzi i zwierząt.
Piśmiennictwo 1. Babak, V., Schlegelova, J., and Vlkova, H.: Interpretation of the results of antimicrobial susceptibility analysis of Escherichia coli isolates from bovine milk, meat and associated foodstuffs. Food Microbiol. 2005, 22, 353 358. 2. Caballero, R.D., Torre-Lapasio, R., Garcia-Alvarez-Coque, M.C., and Ramis-Ramos, G.: Rapid liquid determination of tetracyclines in animal feeds using a surfactant solution as mobile phase. Anal. Lett. 2002, 35, 687 705. 3. Caher-Pericas C., Maquieira A., Puchades R., Miralles J., Moreno A.: Multiresidue determination of antibiotics in feed and fish samples for food safety evaluation. Comparision of immunoassay vs LC-MS/MS. Food Control. 2011, 22, 993 999. 4. Choma, I., Grenda, D., Malinowska, I., and Suprynowicz, Z.: Determination of flumequine and doxycycline in milk by a simple thin-layer chromatographic method. J. Chromatogr. B. 1999, 734, 7 14. 5. Chopra I., Roberts M.: Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacteria Resistance. American Socjety for Microbiology. 2001, 65, 232 260. 6. Fiori J., Grassigli G., Filippi P., Gotti R., Cavirni V.: HPLC-DAD and LC-ESI-MS analysis of doxycycline and related impurities in doxipan mix, a medicated premix for incorporation in medicated feedsuffs. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005, 37, 979 985. 7. Gafner J.L.: Identification and Semiquantitative Estimation of Antibiotics Addend to Complete Feed, Premixes, and Concentrates. J. AOAC Inter., 1999, 82, 1 8. 8. Goldstein F.W., Kitzis M.D., Acar J.F.: N,N-dimethyloglycyl-aminoderivative of minocycline and 6-demethyl-6-desoxytetracycline, two New glycylcyclines, highly effective against tetracycline-resistans grampositive cocci. Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38, 2218 2220. 9. Guo L., Cen Y., Zhang L., Yang W., He P.: Development and validation of a liquid chromatographic/tandem mass spectrometric method for determination of chlorotetracycline, oxytetracycline, tetracycline, and doxycycline in animal feeds. J. AOAC Inter. 2012, 95, 1010 1015. 10. Hansen, L.H., Aarestrup, F., and Sorensen, S.J.: Quantification of bioavailable chlortetracycline in pig feces using a bacterial whole cell-biosensor. Vet. Microbiol. 2002, 87, 51 57. 11. Hansen, L.H. and Sorensen, S.J.: Detection and quantitation of tetracyclines by whole cell biosensors. FEMS Microbiol. Lett. 2000, 190, 273 278. 12. Holland, D.C., Faul, K.C., Roybal, J.E., Munns, R.K., and Shimoda, W.: Liquid chromatographic determination of chlortetracycline hydrochloride in ruminant and poultry/swine tissues. J. AOAC Int. 1991, 74, 780 784. 13. Huang, T.S., Du, W.X., Marshall, M.R., and Wie, C.I.: Determination of oxytetracycline in raw and cooked channel catfish by capillary electrophoresis. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 2602 2605. 14. http://www.moleculofthemonth.com 15. http://www.sitemaker.unich.edu.com 16. Kawata, S., Sato, K., Nishikawa, Y., Iwama, K.: Liquid chromatographic determination of oxytetracycline in swine tissues. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1996, 79, 1463 1465.