UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Katedry Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 1 Oznaczanie azotanów (III) i azotanów (V) w próbkach wody MONITORING ŚRODOWISKA Gdańsk, 2010 1
1. Wprowadzenie Woda - życiodajna substancja - bezbarwna, bezwonna, pozbawiona smaku i kalorii jest niezbędna do życia wszystkim organizmom na ziemi. Każdy człowiek z przeszło pięciu miliardów musi codziennie przyjąć w posiłkach i napojach około dwóch i pół litra wody. Nie każda woda nadaje się jednak do spożycia. Przed dopuszczeniem jej do użytku należy przeprowadzić szereg badań kontrolnych. W praktyce sanitarnej zakres badania wody ustala się w zależności od jej przeznaczenia. Dla rutynowej kontroli jakości wody do picia i potrzeb gospodarstwa domowego wykonuje się badania skrócone, obejmujące takie oznaczania jak: temperatura, mętność, barwa, zapach, ph, chlorki, azotany(v) i azotany(iii). 2. Aparaty przenośne do badania jakości wód Istotną w badaniach kontrolnych wody jest jakość uzyskiwanych wyników analitycznych, która często związana jest z reprezentatywnością pobranej próbki wody. Dlatego też w monitoringu jakości wody istnieje potrzeba stosowania polowych (przenośnych) przyrządów kontrolno-pomiarowych, za pomocą których można w prosty i szybki sposób ocenić jakość wody w miejscu pobrania próbki. Unika się w ten sposób konieczności przewożenia próbek wody i ich przechowywania, kiedy to bardzo często zachodzą procesy zmieniające skład wody (w efekcie analizy nie są wiarygodne). Wykorzystanie instrumentów przenośnych stanowi jeden z trendów rozwojowych analityki zanieczyszczeń środowiska. Są one uzupełnieniem przyrządów laboratoryjnych. Cechują się: odpowiednim zakresem stężeń oznaczanych substancji zgodnym z normami dla danych analitów; określoną dokładnością i precyzją pomiarów; jasno określonym wpływem substancji przeszkadzających na wskazania przyrządu, co ma szczególne znaczenie w przypadku analizy ścieków, gdzie substancje przeszkadzające występują w dużych stężeniach i mogą istotnie zmienić wynik oznaczenia; prostym i szybkim sposobem wykonania pomiaru (metody bezpośrednie gdy np. sondę zanurza się w toni wodnej i odczytuje wynik pomiaru oraz metody pośrednie gdy do pobranej próbki dodaje się odczynniki i po pewnym czasie dokonuje się odczytu wskazań przyrządu). 2
1. Zastosowanie szybkich testów kuwetowych i pasków testowych w monitoringu jakości wód Składniki obecne w wodzie są często z natury bezbarwne lub też występują w tak małym stężeniu, że do ich wykrycia konieczne jest przeprowadzenie reakcji badanego składnika z dodatkowym odczynnikiem, dzięki czemu powstaje związek barwny. Koszty jak i czas tak przeprowadzanej analizy można zredukować poprzez zastosowanie gotowych odczynników, tzw. testów kuwetowych lub pasków testowych. Paski testowe stosowane są do analiz próbek o rożnych zakresach stężeń (mg/l i g/l) jako narzędzie do szybkiego sprawdzenia składu próbki, bez konieczności korzystania z czasochłonnych i drogich procedur analitycznych. Paski testowe nasycone są substancją, która reaguje z analitem, dając barwny produkt. Pasek zanurza się na określony czas do próbki badanej a następnie porównuje barwę paska ze skalą barw, odpowiadającą określonym stężeniom analitu. Testy kuwetowe stosowane są również do przeprowadzania barwnych reakcji, a charakteryzują się tym, że kuweta może być jednocześnie naczyniem pomiarowym i reakcyjnym. Po wprowadzeniu do kuwety odpowiedniej ilości próbki i odczynnika, dochodzi w niej do reakcji barwnej. Intensywność barwy mierzona jest fotometrycznie. Krzywe wzorcowe, czyli zależność absorbancji mieszaniny reakcyjnej od stężenia analitu, mierzone fotometrycznie, są kodowane w mikroprocesorach przyrządów. Po wstawieniu kuwety z mieszaniną reakcyjną do spektrofotometru następuje pomiar a wskazania wyświetlane są najczęściej bezpośrednio w jednostkach stężenia. Testy kuwetowe dostępne są dla niemal wszystkich parametrów analityki wody pitnej i ścieków. Do zalet tych testów w porównaniu z konwencjonalnymi metodami fotometrycznymi należy zaliczyć: używanie gotowych odczynników, niewielkie zużycie odczynników (co wpisuje się w zasady Zielonej Chemii), długi okres trwałości gotowych odczynników do testów, wyeliminowanie konieczności wyznaczania krzywej wzorcowej, brak konieczności posiadania innego wyposażenia jak np. wagi analitycznej, duża szybkość przeprowadzania pomiarów. 1. Zapewnienie jakości wyników analitycznych Wszelkie wyniki analityczne uzyskiwane w każdym laboratorium muszą być 3
traktowane jako pewne i powtarzalne, dlatego też istnieje konieczność prowadzenia wewnętrznej kontroli jakości pomiarów. Podczas wykonywania testów kuwetowych ważne jest, by po każdym zastosowaniu odczynników przeprowadzić kontrolę krzywej wzorcowej za pomocą jednego lub kilku roztworów standardowych. Obecnie firmy zajmujące się produkcją wysoko wyspecjalizowanych szybkich testów kuwetowych oferują kompletne zestawy stabilnych, wieloparametrowych roztworów odniesienia do zapewnienia dobrej jakości przeprowadzanych pomiarów. Są one optymalnym rozwiązaniem do sprawdzenia całego systemu: od pojedynczych zestawów testowych, poprzez urządzenia pomiarowe, na indywidualnych procedurach pomiarowych kończąc. Przy pomocy dwóch gotowych do użycia roztworów wieloskładnikowych, o ścisłe określonej zawartości porównuje się wartości zmierzone z oczekiwanymi. Umożliwia to określenie błędów systematycznych i losowych, a także błędów zależnych od próbki. Błędy systematyczne i losowe określa się używając gotowego roztworu wzorcowego. Możliwy wpływ na wynik wywierany przez inne substancje zawarte w próbce (wpływ matrycy) rozpoznaje się mierząc próbkę po domieszkowaniu jej roztworem dodatkowym. 2. Spektrofotometryczne metody oznaczania substancji Podstawą spektrofotometrycznego oznaczania ilościowego substancji jest prawo Lamberta- Beera. Pomiary wykonuje się za pomocą spektrofotometrów (patrz: Chemia analityczna, Podręcznik dla studentów pod redakcja R. Kocjana, t. 2, Analiza instrumentalna, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2000). Pomiary absorbancji wykonuje się napełniając kuwetę pomiarową roztworem próbki badanej, a kuwetę odniesienia - odnośnikiem, którym jest najczęściej rozpuszczalnik na ogół w metodach bezpośrednich lub ślepa próba (w metodach pośrednich). Bezpośrednie metody spektrofotometryczne są to metody, których podstawą jest selektywna absorpcja oznaczanego składnika. Metody pośrednie to te, w których pomiary absorpcji prowadzi się dopiero po przeprowadzeniu analizowanej substancji, w wyniku odpowiedniej reakcji,w związek barwny. Wartość absorbancji takiej barwnej pochodnej jest proporcjonalna do stężenia oznaczanego składnika. Przygotowując robocze roztwory wzorcowe przez rozcieńczenie wzorcowego roztworu podstawowego, najkorzystniej jest tak dobrać stężenia, aby otrzymać optymalny dla danego spektrofotometru zakres wartości mierzonej absorbancji. Najczęściej używany zakres wartości pomiarowych dla aparatów punktowych wynosi 0,2-0,8 wartości absorbancji. Czułość metody spektrofotometrycznej definiuje się jako najmniejsze oznaczalne 4
stężenie substancji lub najmniejsza różnica w stężeniach substancji, którą można oznaczyć za pomocą danej metody. Dla metod spektrofotometrycznych obiektywnym, liczbowym wyrażeniem czułości jest molowy współczynnik absorpcji (ε). Metody spektrofotometryczne mogą być stosowane do oznaczania zawartości śladowych oraz do oznaczania czystości głównego składnika. Oznaczanie azotanów(iii) metodą spektofotometryczną Podstawą metody są następujące reakcje: a) jonów azotanowych(iii) z kwasem sulfanilowym w środowisku kwaśnym (reakcja diazowania), Ө 2NO 2 + 2H 2HNO2 O=N O N=O + H 2 O O=N O N=O O=N + Ө O N=O HSO 3 Ar NH 2 + O=N HSO 3 Ar NH N=O + H HSO 3 Ar NH N=O HSO 3 Ar N=N OH HSO 3 Ar N=N OH + H HSO 3 Ar N N + H 2 O w wyniku której powstaje sól diazoniowa; b) soli diazoniowej z dichlorkiem N (1 naftylo)etylenodiaminy (reakcja sprzęgania), w wyniku której powstaje barwnik azowy o kolorze czerwonofioletowym. Reakcja ta jest bardzo czuła i specyficzna dla jonów azotanowych(iii). Zawartość powstałego barwnika oznacza się fotometrycznie i jest ono proporcjonalne do stężenia jonów azotanowych(iii). Metodę tę można zastosować do badania próbek wód podziemnych, wody pitnej, wód powierzchniowych, wód morskich, ścieków, żywności - po odpowiednim przygotowaniu i również gleby - po odpowiednim przygotowaniu. 5
Stosowany w tej metodzie test kuwetowy dla kuwet 10 mm jest przeznaczony dla próbek o stężeniu NO 2 od 0,07 do 3,28 mg/l (od 0,02 do 1,00 mg/l w przeliczeniu na azot z jonu azotanowego(iii), NO 2 -N). Próbki o większym stężeniu jonów azotanowych(iii) muszą być rozcieńczone wodą dejonizowaną. W oznaczaniu azotanów(iii) w wodzie przeszkadzają jony azotanowe(v), należy je wyeliminować! Poza tym zakłócać przebieg oznaczenia mogą inne substancje, z których wymienić należy te, których już niewielkie ilości są przyczyną nieprawidłowych wyników. Są to związki chemiczne zawierające w roztworze: - Ag + w stężeniu powyżej 1 mg/l, 2 - Cr 2 O 7 w stężeniu powyżej 1 mg/l, - Fe 3+ w stężeniu powyżej 1 mg/l, - S 2 w stężeniu powyżej 10 mg/l. Do substancji, które są przyczyną nieprawidłowych wyników należą również związki o właściwościach redukujących w stężeniu powyżej 10 mg/l. Próbki, jeśli to możliwe, powinny być analizowane zaraz po pobraniu. Maksymalny czas przechowywania wynosi 48 godz. w temperaturze 4 C. Część doświadczalna 1. Przygotować spektrofotometr do pomiarów Po włączeniu aparatu odczekać 15 min, aż nagrzeje się lampa. Następnie wprowadzić autoselektor NO 2 albo wprowadzić symbol metody "036", w celu wybrania odpowiednich warunków pomiaru (patrz: Instrukcja obsługi fotometru Spectroquant ) 1. Przeprowadzić kontrolę procesu pomiarowego z zastosowaniem roztworu wzorcowego azotanów(iii). Kontrolę procesu pomiarowego przeprowadza się wykonując pomiar absorbancji mieszaniny reakcyjnej przygotowanej z roztworu wzorcowego o określonym stężeniu jonów NO 2. Wykonanie: Z roztworu wzorcowego azotanów(iii) o stężeniu jonów NO 2 c = 1 g/l sporządzić w kolbie miarowej na 1000 ml roztwór wzorcowy azotanów(iii) o stężeniu jonów NO 2 c = 1 mg/l. Następnie wprowadzić 1 płaską łyżeczkę odczynnika NO - 2 1 (łyżeczka znajduje się wewnątrz pojemnika odczynnika NO 2-1) do szklanej probówki oraz 5,0 ml świeżo 6
przygotowanego roztworu wzorcowego azotanów(iii) o stężeniu jonów NO 2 c = 1 mg/l. Zawartość intensywnie wymieszać aż do całkowitego rozpuszczenia odczynnika. Mieszaninę pozostawić na 10 minut (czas reakcji). Przelać próbkę do kuwety 10 mm i dokonać pomiaru w fotometrze przy długości fali λ = 540 nm. 2. Przeprowadzić analizę dla świeżo pobranej próbki wody wodociągowej. Mętne próbki wody przesączyć przez sączek. Sprawdzić ph wody przy pomocy pasków uniwersalnych. Wartość ph musi być zawarta w przedziale 2 10; jeśli jest inaczej, dla zachowania właściwej wartości ph, należy użyć roztworów kwasu siarkowego(vi) lub wodorotlenku sodu. Za pomocą testu paskowego Nitrat-Test Mercoquant dokonać wstępnej oceny zawartości jonów NO 2 w badanej próbce wody. W tym celu pasek testowy zanurzyć w badanej próbce wody (wg instrukcji na opakowaniu) i przez porównanie barw odczytać stężenie. W razie potrzeby próbkę rozcieńczyć wodą dejonizowaną. Rozcieńczenie uwzględnić przy obliczaniu wyników. Wykonać pomiar wody badanej: - wprowadzić do szklanej probówki 1 płaską łyżeczkę odczynnika NO - 2 1, - następnie przy pomocy pipety wprowadzić 5,0 ml próbki wody, - wymieszać intensywnie do momentu całkowitego rozpuszczenia odczynnika, - odstawić na 10 minut (czas reakcji), - przelać próbkę do kuwety 10 mm, - wykonać pomiar w fotometrze przy długości fali λ = 540 nm. Wymagania odnośnie pomiaru: - podane proporcje wody badanej i odczynników są odpowiednie do kuwet 10 mm, - kuwety używane do pomiaru muszą być bezwzględnie czyste, - pomiar należy wykonywać w temperaturze 15 25 C, pomiar w temperaturze niższej niż 15 C daje zaniżone wyniki, natomiast w temperaturze powyżej 25 C zawyżone, - ph mierzonego roztworu musi mieć wartość w zakresie 2 2,5, - mętne roztwory dają zawyżone wyniki, - barwa roztworu po reakcji utrzymuje się przez 60 min, ale wskazane jest wykonywać pomiar zawsze tak samo po 10 min., - pojemniki z odczynnikami zamykać bezpośrednio po użyciu, przechowywać w 7
wymaganych warunkach. 4. Przeprowadzić analizę wody środowiskowej według procedury opisanej w punkcie 3. 5. Odczynniki: - Roztwór wzorcowy azotanów(iii) o stężeniu jonów NO 2 c = 1 g/l, 250 ml. - Odczynnik NO - 2 1 (zawiera mieszaninę azotanu(iii) sodu, kwasu sulfanilowego i soli dichlorku amoniowego N (1 naftylo)etylenodiaminy. - Roztwór kwasu siarkowego o c = 0,005 mol/l, 250 ml. - Roztwór wodorotlenku sodu o c = 0,01 mol/l, 250 ml. - Papierki uniwersalne - Test paskowy Nitro-Test Mercoquant 5. Szkło i sprzęt laboratoryjny: Fotometr SPECTROQUANT, Vortex, Gruszka do pipet, Sączki twarde, Kolba miarowa o poj. 1 dm 3 2 szt., Kolby stożkowe o poj. 50 cm 3 2 szt., Lejki szklane średnie 2 szt., Kolbki miarowe o poj. 50 cm 3 Probówki szklane 6 szt. + zapas, Tryskawki z wodą destylowaną 1 szt., Pipety o poj. 1 cm 3 5 szt., Pipety o poj. 5 cm 3 6 szt., Pipety o poj. 10 cm 3 Pipety o poj. 25 cm 3 statyw do probówek, statyw do pipet, statyw do sączenia, marker do szkła. 8
Oznaczanie azotanów(v) metodą fotometryczną Azotany(V) w roztworze zakwaszonym kwasem siarkowym(vi) i fosforowym(v) reagują z 2,6 dimetylofenolem, tworząc roztwór 4 nitro-2,6-dimetylofenolu, który jest oznaczany fotometrycznie. Azotany(V) w obecności stężonego kwasu siarkowego(vi) przechodzą w kwas azotowy(v), który reaguje z kwasem siarkowym w myśl równania reakcji: HNO 3 + 2H 2 SO 4 NO 2 + Następnie zachodzi reakcja nitrowania 2,6-dimetylofenolu: + H 3 O + + 2HSO 4 Powstały 4 nitro-2,6-dimetylofenol absorbuje promieniowanie elektromagnetyczne o długości fali 320 nm. W oznaczaniu azotanów(v) w wodzie przeszkadzają jony chlorkowe o stężeniu większym niż 1000 mg/l oraz jony azotanowe(iii) o stężeniu większym niż 50 mg/l. Jony chlorkowe i azotanowe(iii) należy przed pomiarem usunąć. Fotometryczne oznaczanie azotanów(iii) z 2,6-dimetylofenolem może być stosowane do próbek o zawartości jonów NO 3 od 1 do 110 mg/l. Część doświadczalna 1. Przygotować spektrofotometr do pomiarów Po włączeniu aparatu odczekać 15 min, aż nagrzeje się lampa, następnie wprowadzić autoselektor NO 3 dla wybrania odpowiednich warunków pomiaru (patrz: Instrukcja obsługi fotometru Spectroquant ). 2. Przeprowadzić kontrolę procesu pomiarowego z zastosowaniem roztworu 9
wzorcowego azotanów(v) Kontrolę procesu pomiarowego przeprowadza się wykonując pomiar absorbancji mieszaniny reakcyjnej przygotowanej z roztworu wzorcowego o określonym stężeniu jonów NO. 3 Wykonanie: Z roztworu wzorcowego azotanów(v) o stężeniu NO 3 c = 1 g/l sporządzić w kolbie miarowej na 100 ml roztwór wzorcowy azotanów(v) o stężeniu jonów NO 3 c = 20 mg/l. Wprowadzić pipetą do szklanej probówki z korkiem 4,0 ml odczynnika NO - 3 1. Dodać do probówki za pomocą pipety 0,5 ml świeżo przyrządzonego roztworu wzorcowego azotanów(v) o stężeniu jonów NO 3 c = 20 mg/l. Nie mieszać! Dodać do probówki za pomocą pipety 0,5 ml odczynnika NO - 3 2. Uwaga!!! Po wprowadzeniu odczynnika NO 3-2 probówka zrobi się gorąca. Zamknąć probówkę korkiem i wymieszać. Mieszaninę pozostawić na 10 minut (czas reakcji). Przelać próbkę do kuwety 10 mm i dokonać pomiaru w fotometrze przy długości fali λ = 320 nm. 3. Przeprowadzić analizę dla świeżo pobranej próbki wody wodociągowej. Mętne próbki wody przesączyć przez sączek, Za pomocą testu paskowego zawartości chlorków Merckoquant sprawdzić zawartość chlorków w badanej wodzie. Próbki zawierające jony Cl w stężeniu większym niż 1000 mg/l muszą zostać rozcieńczone wodą destylowaną. Za pomocą testu paskowego zawartości azotanów(iii) i azotanów(v) Merckoquant sprawdzić zawartość jonów NO 2 i NO 3 w badanej wodzie. W tym celu pasek testowy zanurzyć w badanej próbce wody (wg instrukcji na opakowaniu) i przez porównanie barw odczytać stężenie. Jeśli zawartość azotanów(iii) przekracza wartość 50 mg/l, należy je usunąć z próbki. W tym celu w 10 ml próbki rozpuścić około 50 mg kwasu amidosulfonowego. Wartość ph powstałego roztworu musi mieścić się w granicach od 1 do 3. Jeśli zawartość azotanów(v) w badanej próbce wody przekracza 110 mg jonów NO 3 /l, próbkę należy rozcieńczyć wodą destylowaną. Wykonać oznaczenie: - przy pomocy pipety wprowadzić do szklanej probówki z korkiem 4,0 ml odczynnika NO - 3 1, 10
- dodać za pomocą pipety 0,5 ml analizowanej próbki wody (Nie mieszać!), - dodać do probówki za pomocą pipety 0,5 ml odczynnika NO - 3 2, (Uwaga!!! Po wprowadzeniu odczynnika NO 3-2 probówka zrobi się gorąca) - zamknąć probówkę korkiem i wymieszać, - mieszaninę pozostawić na 10 minut (czas reakcji), - przelać próbkę do kuwety 10 mm i dokonać pomiaru w fotometrze przy długości fali λ = 320 nm. 4. Przeprowadzić analizę dla wody środowiskowej według procedury opisanej w punkcie 3. 5. Odczynniki: - Roztwór wzorcowy azotanów(v) o stężeniu jonów NO 3 c = 1 g/l, 250 ml - Odczynnik NO - 3 1 (zawiera mieszaninę kwasu siarkowego(vi) i fosforowego(v)) - Odczynnik NO - 3 2 (zawiera roztwór 2,6-dimetylofenolu) - Kwas amidosulfonowy - Test paskowy azotanów(v) Merckoquant - Test paskowy chlorków Merckoquant - Papierki uniwersalne 6. Szkło i sprzęt laboratoryjny: Fotometr SPECTROQUANT, Rękawiczki lateksowe, Okulary ochronne, Gruszka do pipet, Sączki twarde, Folia aluminiowa, Łopatka dentystyczna Kolba miarowa o poj. 100 cm 3 Kolby stożkowe o poj. 50 cm 3 Lejki szklane średnie Kolbki miarowe o poj. 50 cm 3 Probówki szklane 1 szt., 2zt., 8 szt. + zapas, 11
Pipety o poj. 1 cm 3 Pipety o poj. 5 cm 3 Pipety o poj. 10 cm 3 Pipety o poj. 25 cm 3 Tryskawka do wody Statyw do probówek, Statyw do pipet, Statyw do sączenia, Marker do szkła. 9 szt., 3 szt., 1 szt., 7. Sporządzić sprawozdanie: - podać, jaka była zawartość azotanów(iii) w badanych próbkach wody, - podać,jaka była zawartość azotanów(v) w badanych próbkach wody, - porównać otrzymane wyniki z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 29 marca 2007 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi oraz odpowiednim do próbki środowiskowej rozporządzeniem Ministra Ochrony Środowiska, - przeprowadzić dyskusję dotyczącą jakości otrzymanych wyników. 8. Wymagania 12