PA-254094.06-1 - GOTOWE PODŁOŻA HODOWLANE NA PŁYTKACH INSTRUKCJE STOSOWANIA PA-254094.06 wer.: July 2014 PRZEZNACZENIE Podłoże jest częściowo selektywnym, różnicującym podłożem przeznaczonym do izolowania Gardnerella vaginalis z próbek pochodzenia klinicznego. ZASADY I OBJAŚNIENIE PROCEDURY Metoda mikrobiologiczna. Uważa się, że Gardnerella vaginalis jest jednym z drobnoustrojów powodujących zapalenie pochwy. 1-4 Choć bakteria ta może występować u dużego odsetka zdrowych kobiet we florze fizjologicznej, nigdy nie kwestionowano jej znaczenia jako czynnika etiologicznego niespecyficznego zapalenia pochwy (określanej także jako waginoza bakteryjna). U kobiet z objawami tej choroby G. vaginalis często występuje razem z bakteriami beztlenowymi, takimi jak Prevotella bivia, P. disiens, Mobiluncus, Peptostreptococcus i (lub) inne drobnoustroje stanowiące elementy flory fizjologicznej cewki moczowej lub jelit, lecz nie pochwy. W niespecyficznym zapaleniu pochwy prawidłowa flora Lactobacillus występuje w mniejszej ilości lub nie występuje wcale. Uważa się, że Gardnerella vaginalis jest jednym z organizmów wskaźnikowych w niespecyficznym zapaleniu pochwy, która w rzeczywistości jest zakażeniem spowodowanym przez wiele drobnoustrojów. 3,4 Wprawdzie w ostatnich latach do próbek materiałów pochodzących z dróg rodnych zalecane były metody badawcze nie wymagające posiewów, takie jak bezpośrednie barwienie metodą Grama, jednak wiele pracowni nadal preferuje hodowle. 1,5 G. vaginalis może być także odpowiedzialna za różne inne stany patologiczne, takie jak poród przedwczesny, zapalenie błon płodowych, zakażenie układu moczowego, zakażenia noworodków oraz posocznica. 6 Wykrywanie tych drobnoustrojów na rutynowo używanych podłożach jest trudne, gdyż Gardnerella i inne bakterie, takie jak pałeczki mlekowe i paciorkowce, mogą wykazywać hemolizę na podłożach zawierających krew owczą. Jednak na podłożach zawierających krew ludzką Gardnerella vaginalis tworzy charakterystyczną hemolizę typu beta. 1,7-9 Dzięki temu, że Gardnerella vaginalis choć często jest uważana za bakterię Gram-ujemną jest drobnoustrojem Gram-dodatnim, można wykonywać jej hodowle na podłożach zawierających kolistynę i kwas nalidyksowy. 1,10,11 Podłoże jest oparte na bazie Columbia CNA Agar, która zawiera składniki odżywcze oraz inhibitory kolistynę i kwas nalidyksowy, powodujące zahamowanie wzrostu bakterii Gram-ujemnych, nie hamując wzrostu bakterii Gram-dodatnich. Podłoże to jest wzbogacone peptonem Proteose, który promuje wzrost Gardnerella. Dodawana jest także amfoterycyna B, która redukuje wzrost drożdży (np. Candida), które także występują często w próbkach pobranych z pochwy. Krew ludzka jest dodawana jako składnik odżywczy, a ponadto pozwala wykryć charakterystyczną, rozsianą hemolizę typu beta danego drobnoustroju. ODCZYNNIKI Skład* w przeliczeniu na jeden litr wody oczyszczonej Trzustkowy hydrolizat kazeiny 12,0 g Chlorek sodu 5,0 g Hydrolizat pepsynowy tkanki zwierzęcej 5,0 Agar 13,5 Pepton Proteose 10,0 Kolistyna 0,01 Wyciąg drożdżowy 3,0 Kwas nalidyksowy 0,01 Wyciąg wołowy 3,0 Amfoterycyna B 0,004 Skrobia kukurydziana 1,0 Krew ludzka pozbawiona włóknika 5%
ph 7,3 ± 0,2 *Skorygowany i (lub) uzupełniony zgodnie z wymaganiami mającymi na celu spełnienie kryteriów wydajności. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI. Wyłącznie do zastosowań profesjonalnych. Nie należy używać płytek, jeżeli są na nich widoczne oznaki skażenia mikrobiologicznego, odbarwienia, wyschnięcia, pęknięcia lub inne zjawiska wskazujące na pogorszenie jakości. Procedury aseptycznej techniki pracy z produktem, zagrożenia biologiczne oraz usuwanie zużytego produktu opisano w dokumencie OGÓLNE INSTRUKCJE DOTYCZĄCE STOSOWANIA. UWAGA: Produkt zawiera materiał potencjalnie zakaźny. Krew ludzka wykorzystana przy produkcji tego podłoża została zbadana w kierunku HIV, HBsAg i innych typów wirusów zapalenia wątroby przy użyciu kryteriów i metod obecnie stosowanych w bankach krwi do badania krwi ludzkiej przeznaczonej do przetaczania. Wszystkie wyniki były ujemne. Ze względu na to, że żadna z dostępnych obecnie metod nie jest w stanie zagwarantować z całą pewnością, że krew nie zawiera wirusa HIV, wirusów zapalenia wątroby oraz innych czynników zakaźnych, próbki oraz opisywane podłoże należy traktować jako materiały, które potencjalnie mogą przenosić choroby zakaźne. W związku z tym zaleca się, aby podczas pracy z opisywanym podłożem przestrzegać zasad bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (Biosafety Level 2). PRZECHOWYWANIE I DOPUSZCZALNY OKRES PRZECHOWYWANIA Po otrzymaniu, płytki należy przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze od 2 do 8 C, w ich oryginalnym opakowaniu izolującym do chwili użycia. Unikać zamrażania i przegrzewania. Posiewu na płytki można dokonywać aż do daty ważności (patrz etykieta na opakowaniu) i inkubować w zalecanych czasach inkubacji. Płytek z otwartych stosów zawierających po 10 płytek można używać przez okres jednego tygodnia, przechowując w czystym miejscu w temperaturze od 2 do 8 C. KONTROLA JAKOŚCI PRZEZ UŻYTKOWNIKA Na płytki posiewa się próbki reprezentatywne niżej wymienionych szczepów (szczegółowe informacje zobacz dokument OGÓLNE INSTRUKCJE DOTYCZĄCE STOSOWANIA). Inkubować w atmosferze wzbogaconej dwutlenkiem węgla przez 48 72 godziny, w temperaturze 35 37 C. Alternatywnie, podłoże można inkubować w atmosferze mikroaerobowej, tzn. przy użyciu systemu BD CampyPak. Szczepy bakteryjne Gardnerella vaginalis ATCC 14018 Escherichia coli ATCC 25922 Proteus mirabilis ATCC 14153 Candida albicans ATCC 10231 Bez posiewu Wyniki posiewu Wzrost dobry lub bardzo dobry; kolonie małe, szarobiałe, otoczone rozsianą hemolizą typu beta Całkowite zahamowanie wzrostu Częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu; brak stopniowego wzrostu kolonii Częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu Czerwone (kolor krwi) PA-254094.06-2 -
PROCEDURA Dostarczane materiały Podłoże (płytki Stacker 90 mm). Sprawdzane pod kątem obecności mikroorganizmów. Materiały niedostarczane Pomocnicze pożywki hodowlane, odczynniki i wyposażenie laboratoryjne zgodnie z wymaganiami. Typy próbek Wymazy z pochwy lub inne próbki podejrzewane o to, że zawierają G. vaginalis. Najlepiej pobrać dwa wymazy jeden na posiew, a drugi do bezpośredniego barwienia metodą Grama. Jeśli próbki nie są od razu przetwarzane, należy stosować podłoże transportowe (np. BD Port- A-Cul). (zobacz także CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCI I OGRANICZENIA PROCEDURY). Procedura testowa Wykonać posiew próbek na podłożu, stosując przyjętą technikę rozcieńczenia. Należy także wykonać posiew na podłoże BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood. Inkubować płytki w atmosferze tlenowej wzbogaconej CO 2, w temperaturze 36 ± 2 C, przez 48 72 godziny. Na każdej próbce materiału z pochwy należy wykonać także bezpośrednie barwienie metodą Grama. 1,2,5 Wyniki Po inkubacji należy zbadać podłoże pod kątem obecności małych lub średnich kolonii, otoczonych rozsianą hemolizą typu beta. Wynik ten należy porównać z wzrostem uzyskanym na płytce z podłożem BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood. Jeśli kolonie z hemolizą typu beta występują tylko na podłożu selektywnym dla Gardnerella, obecność G. vaginalis jest bardzo prawdopodobna. Jeśli kolonie z hemolizą typu beta występują na obu podłożach, należy upewnić się za pomocą barwienia metodą Grama, czy drobnoustrój obecny na podłożu selektywnym dla Gardnerella jest małą, podobną do maczugowca błonicy pałeczką wykazującą zmienną reakcję w barwieniu metodą Grama. Obecność ziarenkowców w barwieniu metodą Grama materiału z kolonii z hemolizą typu beta na podłożu wskazuje na to, że izolowanymi drobnoustrojami są beta-hemolizujące paciorkowce lub gronkowce, lecz nie G. vaginalis. Kolonie z hemolizą typu alfa i bez hemolizy można pominąć. Na podłożach zawierających krew owczą Gardnerella tworzy małe kolonie z hemolizą alfa lub bez hemolizy. W przypadku hodowli mieszanych z innymi drobnoustrojami beta-hemolizującymi należy ponownie wykonać na obu podłożach hodowle pochodne z kolonii izolowanych na podłożu BD Gardnerella Selective Agar with 5% Human Blood i prowadzić inkubację zgodnie z powyższym opisem. Ostateczna identyfikacja izolowanych szczepów wymaga wykonania dalszych testów biochemicznych. Należy zapoznać się z piśmiennictwem. 1,7,9 Jeśli pacjent choruje na waginozę bakteryjną, w bezpośrednim barwieniu Grama próbek z pochwy widoczne będą komórki typu clue cells (= komórki nabłonka pochwy obładowane dużą ilością krótkich pałeczek Gram-zmiennych). 1,5 Interpretacja wyników Jeśli z próbek materiału z pochwy wyizolowano G. vaginalis, rozpoznanie należy uważnie porównać z subiektywnymi i obiektywnymi objawami klinicznymi. Zazwyczaj, jeśli Gardnerella stanowi przyczynę waginozy bakteryjnej, pacjentka uskarża się na zwiększoną ilość wydzieliny o nieprzyjemnym zapachu. ph wydzieliny wynosi >4,5, a w barwieniu metodą Grama obecne są komórki typu clue. Szczegółowe informacje przedstawiono w piśmiennictwie. 1-3,5 CHARAKTERYSTYKA WYNIKÓW I OGRANICZENIA DOTYCZĄCE PROCEDURY Podłoże jest częściowo selektywnym podłożem przeznaczonym do izolowania Gardnerella vaginalis. 4,11 G. vaginalis tworzy kolonie z PA-254094.06-3 -
hemolizą typu beta na podłożach z krwią ludzką, a kolonie z hemolizą typu alfa na podłożach zawierających krew owczą. Podłoże nie hamuje wzrostu innych drobnoustrojów Gram-dodatnich, takich jak paciorkowce, gronkowce lub Listeria, które mogą, lecz nie muszą, powodować hemolizę beta na podłożach zawierających krew ludzką i mogą także występować w próbkach materiałów pochodzących z pochwy. W związku z tym, do potwierdzenia identyfikacji izolowanych bakterii jako G. vaginalis konieczne jest wykonanie badań mikroskopowych i biochemicznych. Obecność G. vaginalis w próbce materiału z pochwy niekoniecznie musi oznaczać, że drobnoustrój ten jest przyczyną infekcji. Nie należy używać podłoża do określania właściwości hemolizujących organizmów innych niż Gardnerella vaginalis. PIŚMIENNICTWO 1. Clarridge, J.E., and C.A. Spiegel. 1995. Corynebacterium and miscellaneous irregular gram-positive rods, Erysipelothrix, and Gardnerella. In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 2. Spiegel, C.A. 1991. Bacterial vaginosis. Clin. Microbiol. Rev. 4: 485-502. 3. Hammann, R., Lang, N., and H. Werner. 1984. Die Rolle von Gardnerella vaginalis und Anaerobiern Ätiologie der unspezifischen Kolpitis. Fortschr. Med. 102: 255-258. 4. Hammann, R., A. Kronibus, N. Lang, and H. Werner. 1987. Quantitative studies on the vaginal flora of asymptomatic women and patients with vaginitis and vaginosis. Zbl. Bakt. A 265: 451-461. 5. Spiegel, C.A., Amsel, R., and K.K. Holmes. 1983. Diagnosis of bacterial vaginosis by direct Gram stain of vaginal fluid. J. Clin. Microbiol. 18: 170-177. 6. Martius, J., and D.A. Eschenbach. 1990. The role of bacterial vaginosis as a cause of amniotic fluid infection, chorioamnionitis and prematurity a review. Arch. Gynecol. Obstet. 247: 1-13. 7. Greenwood, J.R. et al. 1977. Haemophilus vaginalis (Corynebacterium vaginale) method for isolation and rapid biochemical identification. Health Lab. Sci. 14: 102 8. Kretzschmar, U.M., R. Hammann, H.J. Kutzner. 1991. Purification and characterization of Gardnerella vaginalis hemolysin. Curr. Microbiol. 23: 7-13. 9. Piot, P., et al. 1982. Identification of Gardnerella (Haemophilus) vaginalis. J. Clin. Microbiol. 15: 19-24. 10. Harper, J.J, and G.H.G. Davis. 1982. Cell wall analysis of Gardnerella vaginalis (Haemophilus vaginalis). Int. J. Syst. Bacteriol. 32: 48-50. 11. Goldberg, R.L. and J.A. Washington II. 1976. Comparison of isolation of Haemophilus vaginalis (Corynebacterium vaginale) from Peptone-Starch-Dextrose Agar and Columbia Colistin-Nalidixic Acid Agar. J. Clin. Microbiol. 4: 245. PAKOWANIE / DOSTĘPNOŚĆ Nr katalogowy 254094 Gotowe podłoża na płytkach hodowlanych, cpu 20 Nr katalogowy 257664 Gotowe podłoża na płytkach hodowlanych, cpu 120 DODATKOWE INFORMACJE W celu uzyskania dodatkowych informacji należy się skontaktować z lokalnym przedstawicielem firmy BD. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ PA-254094.06-4 -
ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. 2014 BD PA-254094.06-5 -