ZWIĄZKI AKTYWNE BIOLOGICZNIE W ŚRODOWISKU Problemy i wyzwania Jacek Namieśnik Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej ul. G. Narutowicza 11/12, 80-952 Gdańsk tel: 058 347 1010, e-mail: chemanal@pg.gda.pl 12-14.05.2008, Ślesin 1
Cele i zadania analityki i monitoringu środowiska Identyfikacja źródeł i oszacowanie wielkości i zasięgu oddziaływania emisji, Oszacowanie poziomu imisji, i Badania losu środowiskowego ksenobiotyków, Ocena skuteczności zabiegów sozotechnicznych, Ocena toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń, Badania procesów bioakumulacji zanieczyszczeń przez organizmy żywe. 12-14.05.2008, Ślesin 2
Oddziaływanie zanieczyszczeń na część ę nieożywioną i ożywioną środowiska Zanieczyszczenia (ksenobiotyki) układu ożoność) Pod dstawowe wła aściwości kse enobiotyku Właściwości (zmienność, zło emisja Środowisko nieożywione rozmieszczenia Woda powierzchniowa przemiany powietrze gleba woda gruntowa Osady denne pobieranie Biota metabolizm rozmieszczenie Los środowiskowy Biodostępność Toksykokinetyka i dynamika Los chemicz zny Ekspozycja Ekspozycja wewnętrzna Skutki 12-14.05.2008, Ślesin 3
Związki podlegające uregulowaniom prawnym Zanieczyszczenia środowiska Związki nie podlegające uregulowaniom prawnym Klasyfikacja zanieczyszczeń środowiska............ Dioksyny (PCDD+PCDF) Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne Polichlorowane bifenyle Pestycydy chloroorganiczne Kompleksy metali Estrogeny Fitoestrogeny Bisfenol A Bromowane opóźniacze zapłonu Surfuktanty niejonowe i produkty ich rozkładu i metabolizmu Alkilofenole Pozostałości farmaceutyków Związki wywołujące zakłócenia równowagi hormonalnej w organizmach żywych (związki endokrynne) Pochodne ftalanów Syntetyczne związki zapachowe Środki higieny osobistej 12-14.05.2008, Ślesin 4
Ekotoksykologia Ocena ryzyka ekologicznego Zakłócenia lub zanik sygnałów chemicznych Rakotwórczość Mutagenność Ocena ryzyka środowiskowego Bioakumulacja Podział międzyfazowy Degradacja Toksyczność ostra/chroniczna Informacja analityczna Transport Interferencje pomiędzy indywiduami chemicznymi 10-15 g/l Specjacja chemiczna Parametry grupowe Parametry sumaryczne Specyficzność ANALIZA ŚRODOWISKOWA 10-12 g/l 10-9 g/l 10-6 g/l Czułość 12-14.05.2008, Ślesin 5
Związki ą endokrynne (Endocrine Disrupting Compounds EDC s) An exogenous agent that interfaces with synthesis, secretion, transport, binding, action or elimination of natural hormones in the body that is responsible for the maintenance of homeostasis, reproduction or behavior. U.S. EPA Special Report on Environmental Endocrine Disruption: An effect assessment and analysis. EPA/630/R-96/012 (1997) Czynnik zewnętrzny (pozaustrojowy), który wpływa na: Syntezę, Wydzielanie, Transport, Wiązanie, Działanie, ł i Eliminacje naturalnych hormonów w organizmie, które są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy, zachowanie organizmu i jego reprodukcję. 12-14.05.2008, Ślesin 6
Efekty biologiczne działania dioksyn (PCDD+PCDF) Efekty hormonalne (działanie endokrynne), Indukcja enzymu (cytochrom P4501A), Działanie rakotwórcze, Zakłócenia w reprodukcji. 12-14.05.2008, Ślesin 7
Potencjał endokrynny Potencjał ł endokrynny różnych hksenobiotyków kó może ż być ć porównywany poprzez określenie stężenia równoważnikowego endokrynności (ang. Estrogen equivalent concetration -EEQ) EEQi = Ci EEFi EEQt = Σ EEQi gdzie: Ci stężenie danego ksenobiotyku EEF współczynnik endokrynności Wartości liczbowe współczynnika EEF wyrażają wzgledną endokrynność danego ksenobiotyku w stosunku do endokrynności estradiolu lub 17 ß-estradiolu. Właściwości endokrynne są określane za pomocą różnych biotestów (ER-CALUX, YES, E-screen transgenic zebrafish). 12-14.05.2008, Ślesin 8
Los środowiskowy y związków ą endokrynnych Uzdatnianie wody do picia Ścieki komunalne i przemysłowe Depozycja atmosferyczna Odparowywanie Obszarowe źródła wód spływnych Sorpcja Pobieranie przez organizmy żywe i biowzbogacanie Sedymentacja Pobieranie przez rośliny Rozkład Frakcja rozpuszczalna Remobilizacja i depozycja Rozkład (mineralizacja) Frakcja osadu Ch. G. Campbell, S. E. Borglin, F. B. Green, A. Grayson, E. Wozei, W. T. Stringfellow, Chemosphere, 65, 1265-1280 (2006) Transport do wód gruntowych 12-14.05.2008, Ślesin 9
Budowa strukturalna naturalnych i syntetycznych związków endokrynnych Naturalne 17β-estradiol (E2) MM 272.37 17α-estradiol (α-e2) MM 272.37 Estron (E1) MM 270.36 Estriol (E3) MM 288.37 Testosteron (Test) MM 288.4 Syntetyczne Progesteron (Pg) MM 314.45 Kortyzon (Cor) MM 360.5 Dehydroepiandrosteron (DHEA) MM 288.42 Noretyndron (Nore) MM 298.41 Lewonorgestrol 17α-etynyloestradiol (LNor) (EE2) Prednizon (Pd) E. Vulliet, J. B. Baugros, M. M. MM 312.44 MM 296.39 MM 358.43 Flament-Waton, M. F. Grenier- Loustalot, Anal. Bioanal. Chem., 387, 2143-2151 (2007) 12-14.05.2008, Ślesin 10
Przykłady związków endokrynnych ZWIĄZEK SKRÓT /AKRONIM UWAGI 17β-estradiol i 17 α-estradiol Β-E2 i α-e2 Estrogeny naturalne Estron E1 Estrogen, metabolit E2 Estriol E3 Estrogen naturalny 17 α-etynyloestradiol EE2 Syntetyczny estrogen ogólnie stosowany w łączonej profilaktyce antykoncepcyjnej Testosteron Test Naturalny androgen Progesteron Pg Naturalny androgen Dehydroepiandrosteron DHEA Androgen, precursor hormonów płciowych Lewonorgestrol LNor Syntetyczny progestagen powszechnie stosowany w antykoncepcji z zastosowaniem wyłącznie progestagenów Noretyndron Nore Syntetyczny progestagen powszechnie stosowany w antykoncepcji z zastosowaniem wyłącznie progestagenów Kortyzon Cor Glukokortykoid syntetyczny homolog kortyzonu Prednizon Pd Glukokortykoid syntetyczny homolog kortyzonu 12-14.05.2008, Ślesin 11
Przykłady organizmów wykorzystywanych jako wskaźniki ekspozycji na związki endokrynne GATUNEK NAZWA ZMIANY WYWOŁYWANE PRZEZ ZWIĄZKI ZWYCZAJOWA Rana pipiens Żaba lamparcia Anomalie gonad Chrysemys picta Żółw malowany Indukcja witellogeniny Oncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowy Zakłócenia w rozrodzie, indukcja witellogeniny Primephales promelas Ciernik promienisty Anomalie gonad, zakłócenia w rozrodzie, indukcja witellogeniny Cyprinodon variegates Karpieniec zwyczajny Indukcja witellogeniny Danio rerio Brachydanio rerio Danio pręgowany Anomalie gonad, zakłócenia w rozwoju fizjologicznym, indukcja witellogeniny i lucyferyny Oryzias latipes Ryżówka japońska Anomalie gonad, Zakłócenia w reprodukcji Platichthys flesus Stornia (flądra) Anomalie gonad, zakłócenia w rozwoju fizjologicznym, indukcja witellogeniny Salmo salar Łosoś atlantycki Zmiany białek warstwy promienistej, indukcja witellogeniny Haliaeetus leucocephala Bielik amerykański Skutki teratogenne i zakłócenia w reprodukcji Coturnix japonica Colinus virginianus Przepiórka japońska Przepiórka błękitna Zmiany zachowań seksualnych, zakłócenia w rozwoju embrionu, zmiany w grubości skorupek jaj Gallus domesticus Kura domowa Zakłócenia w rozwoju embrionu, zmiany w grubości skorupek jaj Daphnia magna Rozwielitka Zakłócenia fizjologiczne i biochemiczne Tisbe battagliai Skorupiak morski Zmiany w płodności i zakłócenia w szybkości rozwoju 12-14.05.2008, Ślesin 12
Przykłady niekomórkowych biotestów i bioczujników wykorzystywanych do wykrywania związków endokrynnych NAZWA BIOTESTU MIERZONY SYGNAŁ DETEKTOR ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assays) ELRA (Enzyme-linked receptor assay) Endotect TM RIANA (River analysis) Biacore TM Bioczujniki (elektrochemiczne) SCCoR (Single cell coactivator recruitment) RBA (Microarray relative binding assay) Natężenie promieniowania świetlnegog Natężenie promieniowania świetlnego Fluorescencja Fluorescencja Rezonans powierzchni i plazmonu Wskaźnik fluorescencyjny Wskaźnik fluorescencyjny Spektrofotometr Spektrofotometr Fluorometr Fluorometr Detekcja promieniowania i i laserowego Multimetr Fluorometr Fluorometr 12-14.05.2008, Ślesin 13
Przykłady testów komórkowych przeznaczonych do wykrywania związków endokrynnych Nazwa zwyczajowa (handlowa) Rodzaj komórki Efekt wywoływany przez związki endokrynne E-SCREEN MCF-7 komórki raka piersi proliferacja Yeast Estrogen Screen (YES) - łącznie z wariantami LYES i BLYES Analiza ER-lucyferazy z komórkami k HEK 293 Różnorakie (Sachcaromyces spp., Cryptococcus spp., Candida spp.) Ludzka nerka embrionalna (HEK) luminescencja kolorymetria luminescencja NA E. coli luminescencja Ekspresja czułej na estrogen T47D Komórka raka luminescencja lucyferazy chemicznie aktywowanej (ER- CALUS ) gruczołu piersiowego IR-bio-amplifikacja Komórki ssaków Funkcja komórkowa 12-14.05.2008, Ślesin 14
Granice wykrywalności y technik bioanalitycznych [pg/ml] CALUX Micro-EROD CEH-EROD 0.04 0.06 0.16 EIA-2 EIA-DF1 050 0.50 3.0 GRAB 0.04 AhR Ah-l 0.80 1.0 12-14.05.2008, Ślesin 15
Występowanie wybranych steroidowych hormonów płciowych w strumieniu ścieków oczyszczonych w dwóch różnych oczyszczalniach Odnośnik literaturowy Data pobierania próbek Analit Pieree-Benite 18.04.20 24.04.20 02.05.20 15.05.20 16.05.20 30.05.20 06 06 06 06 06 06 St. Fons 05.06.2006 E1 E2 12,4 14,8 196,7 n.w. 20,8 9,4 18,7 6,1 28,1 28,1 9,9 <LOD 66,4 42,6 α- E2 EE2 E3 DHEA Test 12,6 n.w. n.w. 4,8 10,0 <LOD <LOD n.w. n.w. 30,3 <LOD n.w. n.w. n.w. 11,8 6,4 n.w. n.w. 4,6 8,4 n.w. 5,6 n.w. 7,8 3,0 9,7 <LOD n.w. n.w. 1,3 9,1 Zanieczyszczenia <LOD 4,5 7,6 Pg Nore LNor Pd Cor 16,9 13,0 17,6 n.w. <LOD 9,7 41,0 12,5 n.w. nw n.w 12,0 28,7 17,9 n.w. nw n.w. 9,2 20,9 10,8 <LOD nw n.w. 8,6 5,2 11,4 10,00 95,4 8,0 5,9 0,9 n.w. 13,7 8,6 23,1 17,2 n.w. 88,5 n.w. nie wykryto < LOD poniżej granicy oznaczalności 12-14.05.2008, Ślesin 16
Parametry walidacyjne metodyki oznaczania związków endokrynnych w próbkach wody Analit Parametr walidacyjny Granica wykrywalności (S/N =3) Estron 17 ß-estradiol Estriol Etynyloestradiol 0,03 pg 0,02 pg 0,05 pg 0,24 pg Granica 004 0,04 ng/l 004 0,04 ng/l 008 0,08 ng/l 032 0,32 ng/l oznaczalności ------------ ------------ ------------ ------------ (S/N =10) 40 ppq 40 ppq 80 ppq 320 ppq ETAPY PROCEDURY ANALITYCZNEJ FILTRACJA EKSTRACJA (SPE) ELUCJA ODPAROWANIE NADMIARU ROZPUSZCALNIKA DERYWATYZACJA (PFPA) GC-MS A. Mounatassim-Souali, S. L. Tamisier-Karolak, D. Perdiz, M. Cargouet, Y. Levi, J. Sep. Sci, 26, 105 (2003) 12-14.05.2008, Ślesin 17
Tendencje zmian stężenia związków cynoorganicznych w środowisku i wzrost świadomości o ich wpływie na organizmy żywe Wzrost czułości i selektywność INFORMACJE ANALITYCZNE GFAAS CT / QFAAS CGC / FPD AED CGC / ICP-MS ązków ch żnych ne) stężenia zwi oorganiczny ch przybrzeż ostki umow Zmiana s cyno w woda (jedn Zakaz stosowania TBT w farbach służących do malowania statków o długości poniżej 25 m Zatrucia ostryg i wpływ na życie biologiczne w środowisku Występowanie związków cynoorganicznych w wodach morskich i akumulacja w tkankach Oddz ssaków morskich iaływ anie zwią zków Występowanie związków cynoorganicznych w systemach wody wodociągowej i produktach używanych w gospodarstwach domowych Zjawisko maskulinizacji/feminizacji j (ang. imposex) u organizmów żyjących w wodach przybrzeżnych i otwartym oceanie cyno orga nicz nych na orga nizm y żywey 1970 1980 1990 2000 CZAS 12-14.05.2008, Ślesin 18
Pozostałości farmaceutyków w środowisku Pharmaceutical Products PP s Pharmaceutical and Personal Care Products Endocrine Disrupting Compounds Non steroidal Anti-inflammatory Drugs PPCP s EDC s NSAID s Active Pharmaceutical Ingredients API s 12-14.05.2008, Ślesin 19
Myśl przewodnia Pollution from pharmaceuticals in surface and groundwater is becoming recognized as an environmental concern in many countries leading to the area of study labelled PIE PHARMACEUTICALS IN THE ENVIRONMENT S.K. Khetan, T.J. Collins, Chem. Rev., 107, 2319-2364 (2007) 12-14.05.2008, Ślesin 20
Pozostałości farmaceutyków w środowisku kamienie milowe 1981 Stwierdzenie obecności oraz ilościowe oznaczenie kwasu klofibrowego w próbkach środowiskowych (USA) 1997 Oznaczanie pozostałości farmaceutyków w ściekach szpitalnych (Niemcy Niemcy) 1997 Badania dotyczące toksyczności antybiotyków w środowisku wodnym (Dania) 1998 Monitorowanie wód rzecznych i ścieków w Niemczech na obecność pozostałości farmaceutyków (Niemcy Niemcy) 1998 Oznaczanie związków z grupy antybiotyków w różnych próbkach wody (Niemcy) 1999 Opracowanie metodyki analitycznej umożliwiającej stwierdzenie obecności estrogenów w wodach powierzchniowych (USA USA) 2002 Pierwsza metodyka jednoczesnego oznaczania pozostałości wielu farmaceutyków w próbkach środowiskowych (Dania) 2001 2002 Oznaczanie pozostałości farmaceutyków wwodach wodach pitnych (Niemcy Niemcy) 2003 Opracowanie odpowiednich modeli matematycznych do przewidywania stężenia i losu poszczególnych farmaceutyków w środowisku (Belgia) 2005 Oznaczanie pozostałości farmaceutyków próbkach stałych (Hiszpania Hiszpania) ) 12-14.05.2008, Ślesin 21
Liczba opakowań leków rocznie kupowanych przez statystycznego mieszkańca 32 29 22 20 7 1 2 3 4 5 1. France, 2. Poland, 3. Germany, 4. USA, 5. Japan 12-14.05.2008, Ślesin 22
Klasyfikacja farmaceutyków Parametr klasyfikujący Grupy związków Charakter chemiczny Powinowactwo Przeznaczenie Kwasowe Zasadowe Neutralne Hydrofilowe Lipofilowe Antybiotyki Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) Regulatory tłuszczów Hormony (estrogeny) Leki przeciwdrgawkowe Beta-blokery Środki cieniujące (kontrastujące) Leki uspakające 12-14.05.2008, Ślesin 23
Antybiotyki Erytromicyn Ofloxacin Chlortetracycline Oxytetracycline Streptomycin Flumequine Ciprofloxacin Trimetoprim Sulfamethoxazole Lincomycin Penicillin Lincomycin Amoxicillin Spiramycin Sterydy i hormony pokrewne 17-β-estradiol β Estrone 17 α-ethinyl estradiol Dietylstilbestrol Dietylstilbestrol aceton Leki przeciwzapalne Kwas acetylosalicylowy (Aspiryna) Diklofenak Ibuprofen Acetaminofen Metamizol Codeina Indometacina Naproxen Fenazon Najpopularniejsze farmaceutyki występujące w środowisku Leki przeciwrakowe Cyclofosfamid Ifosfamid Środki moczopędne Furosemid Leki przeciwpadaczkowe Carbamazepin Leki antydepresyjne Mianserin Typowe przykłady związków biologicznie aktywnych środowisku Leki hipolipemizujące Bezafibrat Gemfibrozil Kwas klofibrowy Fenofibrat Beta-blokery Metoprolol Propranolol Nadolol Atenolol Sotalol Betaxolol Leki uspakajające A. Nikolaou, S. Meric, D. Fatta, Anal. Bioanal. Chem., Diazepam 387, 1225 (2007) 12-14.05.2008, Ślesin 24
Przykłady substancji farmaceutycznych wykrywanych w ściekach Zastosowanie Antybiotyki Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) Regulatory tłuszczu Estrogeny Leki przeciwdrgawkowe Beta-blokery Środki cieniujące Leki uspakajające Przykładowe substancje Sulfametoksazol, trimetoprim, klarytromycyna Roksyromycyna, erytromycyna Diklofenak, ibuprofen, naproksen, ketoprofen Bezafibrat, gemfibrozil, kwas klofibrowy Estron, 17b-estradiol, 17a-etynyloestradiol Carbmazepina, primidon Metaprolol, propranolol Lopromid, lopamidol, diatrizoat Diazepam 12-14.05.2008, Ślesin 25
Główne przyczyny pojawiania się w środowisku różnorodnych związków leczniczych: Produkcja odpowiednich preparatów i oddziaływanie na środowisko zakładów przemysłu farmaceutycznego i weterynaryjnego, Zrzucanie do środowiska dużej ilości przeterminowanych środków (bez ich utylizacji) zarówno z gospodarstw domowych (na małą skalę), jak i ściekami i odpadami szpitalnymi (na znacznie większą skalę) Wydalanie pozostałości leków i ich metabolitów przez ludzi zwierzęta. 12-14.05.2008, Ślesin 26
Drogi przedostawania się farmaceutyków do środowiska i do wody pitnej PRZEMYSŁ FARMACEUTYCZNY PODCZYSZCZANIE MEDYCYNA APLIKACJA OCZYSZCZALNIA ŚCIEKÓW ODPADY GLEBA WODY POWIERZCHNIOWE WODA PITNA WODY GRUNTOWE 12-14.05.2008, Ślesin 27
Źródła emisji i los środowiskowy związków o znaczeniu farmaceutycznym STOSOWANIE SKŁADOWANIE Wykorzystanie przez człowieka APTEKI ODPADY Z GOSPODARSTW DOMOWYCH TOALETA metabolizm Pojemniki/ Toalety Składowiska odpadów FARMY HODOWLANE GOSPODARSTWA WIEJSKIE metabolizm Ścieki/ i gromadzenie i rozprowadzanie nawozu i gnojowicy GLEBA OCZYSZCZALNIA ŚCIEKOW Degradacja chemiczna i biologiczna WODY POWIERZCHNIOWE Wody powierzchniowe Oczyszczalnia odcieków Degradacja chemiczna i biologiczna A. Nikolaou, S. Meric, D. Fatta, Anal. Bioanal. Chem., 387, 1225 (2007) 12-14.05.2008, Ślesin 28
Skuteczność usuwania farmaceutyków w procesach oczyszczania ścieków Farmaceutki Technologie oczyszczania ścieków Osad czynny Zaawansowane procesy utleniania Konwencj jonale oczyszcz zanie ściekó ów SBR MBR Ozonowan nie UV/ O 3 O 3 / (lub H 2 O 2 ) H 2 O 2 Odczyn nnik Fenton na TiO 2 / H 2 O 2 Antybiotyki ** *** ** *** *** *** *** *** NLPZ* ** ** ** ** NPX, IBP ** ** ** ** *** *** *** *** DCL * * * *** Regulatory tłuszczu ** ** *** *** *** *** *** *** Estrogeny *** ** ** *** *** *** *** *** Leki przeciwdrgawkowe * * bu ** *** *** *** *** Beta-blokery ** bd ** *** *** *** *** *** Środki cieniujące ** ** ** ** ** *** *** *** Środki uspakajające * * * ** *** *** *** *** Stopień usuwania ze ścieków: * <39% ** < 40-79% *** >80% bu nie stwierdzono usunięcia ze ścieków bd brak danych SBR Reaktor Sekwencyjny (Sequencing Batch Reactor) MBR 12-14.05.2008, Membranowy ŚlesinReaktor Biologiczny (Membrane Biological Reactor) 29
Wybrane związki ą włączone ą do listy substancji priorytetowych (Holandia) Związki Obecność w wodach odpływowych z oczyszczalni ścieków i (WWTP) Stężenie Max [µg l-1 ] Min [µg l-1 ] Związki endokrynnie czynne 17 α-ethinyl estradiol Bisfenol A Estron + ++ ++ n.d 0.04 0.0000 < 0.01 4.09 001 0.01 Substancje medyczne Ibuprofen Anhydroerytromecyna Sulfometoksazol Karbamazepina Sotalol +++ +++ +++ +++ +++ 0.12 0.15 0.06 0.33 0.97 0.76 0.52 0.13 1.00 1.6 n.d nie wykryto + wykryto od 5% do 50% w badanych próbek z oczyszczalni ścieków ++ wykryto od 50% do 95% w badanych próbek z oczyszczalni ścieków +++ wykryto więcej niż 95% badanych próbek z oczyszczalni ścieków P. De Jong, J. F. Kramer, W. F. Slotema, K. A. Third, STOWA REPORT 2005-34, ISBN 90.5773.316.1 12-14.05.2008, Ślesin 30
Wybrane grupy farmaceutyków i ich wskaźniki ryzyka środowiskowego Lek Leki przeciwbólowe Antybiotyki Beta blokery i leki przeciwpadaczkowe Leki hipolipemizujące Leki przeciwdepresyjne Hormony Leki przeciwhistaminowe Przykłady Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSLPZ np.. Ibuprofen): inne leki przeciwbólowe (np.. Acetaminofen) Penicylina, sulfametoksazol Propanolol, metoprolol Karbamazepina, fenobarbital Statyny (np.. Atorvastin, Klofibrat) Fluoksetyna, Risperidon Tabletki antykoncepcyjne 17 -etinyloestradiol Loratadyna, Cymetydyna Wskaźnik ź k ryzyka Bardzo często stosowane : wykrywane w środowisku Duże ilości Wykrywane w środowisku Dotyczy toksyczności i oporu antybakteryjnego Duże ilości: wykrywane w środowisku Duże ilości Długoterminowe stosowanie Trwałe Długoterminowe stosowanie Często wykrywane Przedmiot testów toksyczności Zakrojone na szeroką skalę badania Właściwości toksyczne Często wykrywane Często stosowany lek bez recepty S. K. Kethan, T. J. Collins, Chem. Rev., 107, 2319-2364 (2007) 12-14.05.2008, Ślesin 31
Granice wykrywalności y związków ą z grupy związków endokrynnych E-Screen ER-CALUX YES ELISA LC-MS/MS GC-MS GC-MS/MS SPME-HPLC HPLC/ESI MS/MS MEKC Technika Granica wykrywalności (ng/l) 0.27 0.14 0.3-30 20-40 0.08-33 0.2-2 0.05-2.4 0.064-1.2 021 0.2-1 44-89 ER-CALUX: estrogen responsive chemically activated luciferase expression YES: yeast estrogen screen ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay LC-MS/MS: liquid chromatography tandem mass spectrometer GC-MS: gas chromatography mass spectrometer GC-MS/MS: gas chromatography tandem mass spectrometer SPME-HPLC: solid-phase microextraction high performance liquid chromatography HPLC/ESi-MS/MS: high-performance liquid chromatography with positive electrospray ionization and tandem mass spectrometry MEKC: micellar electrokinetic chromatography Sources: Wozei (2004), Fan et al. (2005), Huang and Sedlak (2001), heisterkamp et al. (2004), Zhang et al. (2004), Voulvoulis (2003, Table 3.5) Note: See Petrovic and Barcelo (2004, Table 1) for analytical methods and detection limits for sediment and sludge. Ch. G. Campbell, Nowoczesne S. E. Borglin, przyrządy F. B. Green, pomiarowe A. Grayson, jako narzędzia E. Wozei, W. w pozyskiwaniu T. Stringfellow, informacji Chemosphere, naukowych 65, 1265-1280 (2006) 12-14.05.2008, Ślesin 32
Zastosowanie technik chromatograficznych Inte ensywno ość sygna ału t ri t ri+ i+1 t ri+2 i+2 Czas Identyfikacja odbywa się na podstawie czasu retencji. ALE TO JUŻ DZISIAJ NIE WYSTARCZY! 12-14.05.2008, Ślesin 33
Analiza dwuwymiarowa Problem 1 - nakładanie się pików Rozwiązanie Powtórzyć analizę przy użyciu kolumny z innym typem wypełnienia. Charakter oddziaływań pomiędzy analitem a fazą stacjonarną musi być inny niż w przypadku pierwszej kolumny. Zalety: - łatwość wykonania - niski koszt Wady: -czasochłonność!! 12-14.05.2008, Ślesin 34
Analiza dwuwymiarowa Problem 2 - identyfikacja nieznanych substancji Rozwiązanie Zastosować detektor umożliwiający uzyskanie informacji o strukturze analitu. techniki ł Innymi słowy zastosować łączone. Zalety: -możliwość identyfikacji nieznanych związków - informacja o ich masie cząsteczkowej i/lub strukturze - szybsze uzyskanie wyniku końcowego - łatwe wykrywanie faktu nakładania się pików Wady: - wysokie koszty inwestycyjne -wysokie wymagania co do kwalifikacji personelu 12-14.05.2008, Ślesin 35
intensywność sygnału Techniki łączone Dzięki wykorzystaniu technik łączonych informacja analityczna zyskuje dodatkowy wymiar (struktura). 8000 6000 4000 2000 16 15.5 0 800 700 14 14.5 15 600 13.5 500 13 m/z 400 12.5 czas 300 12 200 12-14.05.2008, Ślesin 36 11.5
Zakres zastosowań różnych typów technik łączonych (GC-MS i LC-MS) Masa cz ząsteczk kowa an nalitu 100000 10000 1000 APCI GC/MS ESI (elektrojonizacja) TERMOROZPYLANIE FAB PBI niepolarne Polarność analitu bardzo polarne 12-14.05.2008, Ślesin 37
Niesteroidowe leki przeciwzapalne p (NSLPZ) HOOC H N Cl F F COOH OH Cl Diklofenak O H 3 C CH 3 COOH Diflunisal NSLPZ Naproxen O CH 3 COOH HO CH 3 N O Fenoprofen CH 3 H C O 3 CH COOH 3 H 3 C Tolmetin Ibuprofen 12-14.05.2008, Ślesin 38
Problemy analityczne w zależności od matrycy Drinking Natural Waste water waters waters pg/l -ng/l levell ng/l- g/l levell relatively simple but different matrix g/l-mg/l level complex matrices! 12-14.05.2008, Ślesin 39
Czy możliwe jest wprowadzenie próbek wody o dużej objętości bezpośrednio do układu chromatograficznego? Objętość dozowanej próbki w przypadku techniki RPLC to ~20μl. Wprowadzano próbki wodne o objętości 500, 1000 i 2000 μll 12-14.05.2008, Ślesin 40
Porównanie podstawowych parametrów chromatograficznych uzyskanych podczas analizy próbek modelowych zawierających anality dozowane do kolumny chromatograficznej za pomocą pętli dozowniczej o objętości 20µl i 500µl. Analit 1 Analit 2 Analit 3 20 μl 500 μl 20 μl 500 μl 20 μl 500 μl H 21 11 28 13 47 22 w 4 5 5 5 6 5 N 1 10620 10590 10720 12380 44250 48720 N 2 9010 9360 11070 11980 36770 45660 Parametry chromatograficzne nie uległy pogorszeniu! Co więcej, ę stwierdzono, iż sprawność układu chromatograficznego g nieznacznie wzrosła. Nastąpiło bowiem zawężenie pasma, którego przyczyną było chwilowe zatrzymanie dużej ilości wody na czole kolumny. Wpłynęło to jednocześnie na zwiększenie czasów retencji. 12-14.05.2008, Ślesin 41
Udowodniono możliwość zastosowania techniki dozowania próbek o dużej objętości do oznaczania zawartości polarnych analitów w próbkach rzeczywistych (woda d wodociągowa, morska i rzeczna). Analit 1 Analit 2 Analit 3 Woda wodociągowa Woda rzeczna Woda wodociągowa Woda rzeczna Woda wodociągowa Woda rzeczna LOD [μg/ml] 0,003 0,011 0,003 0,009 0,0015 0,006 LOQ [μg/ml] 0,006 0,021 0,006 0,018 0,003 0,012 12-14.05.2008, Ślesin 42
Procedury analityczne dla różnych matryc 12-14.05.2008, Ślesin 43
Procedury analityczne dla różnych matryc off-line SPE passive SPE SPE on-line n SPE 12-14.05.2008, Ślesin 44
SPE w układzie off-line MeOH H 2 O Próbka H 2 O MeOH naniesienie próbki (sorpcja) przemycie złoża ł ż sorbentu odparowanie rozpuszczalnika do sucha w strumieniu azotu elucja analitów (desorpcja) rozpuszczenie suchej pozostałości w fazie ruchomej oznaczenie końcowe za pomocą techniki HPLC/DAD/MS 12-14.05.2008, Ślesin 45
Wpływu objętości próbki wody na odzysk analitów Przeprowadzono badania procesu ekstrakcji analitów z modelowych próbek wody o różnej objętości (100 ml, 200ml, 300 ml, 500 ml, 700 ml, 1000 ml i 2000 ml) Analit objętość próbek wody [ml] 100 200 300 500 700 1000 2000 R[%] R[%] R[%] R[%] R[%] R[%] R[%] tolmetin 50 60 55 70 60 60 45 naproksen 77 88 87 80 87 73 81 fenoprofen 87 90 88 90 90 78 90 diflunisal 40 39 52 75 53 56 31 diklofenak 74 85 82 86 86 69 78 ibuprofen 102 100 115 103 117 106 99 NIE MA PRZEBICIA ZŁOŻA! 12-14.05.2008, Ślesin 46
SPE w układzie on-line Kolumna analityczna Detektory Kolumna SPE Pompa 2 DAD MS PRÓBKA Ściek ETAP 1- izolacja i wzbogacanie analitów z próbek wody 12-14.05.2008, Ślesin 47
Porównanie etapu ekstrakcji (SPE) w układzie off-line i on-line Objętość próbki 1000 ml Objętość próbki 100 ml SPE (w układzie off-line) Wstępne przygotowanie próbki t= 2 min Przygotowanie kolumienek t= 18 min Wstępne przygotowanie próbki t= 2 min Przygotowanie kolumienek t= 8 min SPE (w układzie online) EKSTRAKCJA SPE t= 70 min EKSTRAKCJA SPE t= 35 min Suszenie złoża kolumienki SPE t= 5 min Przełączenie zaworu Elucja analitów t= 20 min Odparowanie rozpuszczalnika t= 200 min ANALIZA HPLC-DAD-MS t= 25 min Czas całkowity 70 minut Rozpuszczenie pozostałości t= 30 min Czas całkowity 370 minut 12-14.05.2008, Ślesin 48
5 O Signal inte ensity (DAD) C H 3 MeO O N CH 3 F COOH F OH CH 3 O COOH CH 3 OH CH 2 COOH 1 2 3 4 HO 6 H 3 C 3 H 3 C H N Cl Cl CH 3 O OH 1 = tolmetin 2 = naproksen 3 = fenoprofen 4 = diflunisal 5 = diklofenak 6 = ibuprofen 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time min Signal intens sity (ESI-MS) 1 2 3 4 5 6 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min Time 12-14.05.2008, Ślesin 49
PORÓWNANIE TECHNIKI SPE- HPLC-DAD DAD-MS W UKŁADZIE ON- LINE WZGLĘDEM UKŁADU OFF- LINE: PORÓWNANIE TECHNIKI SPE- HPLC-DAD-MS W UKŁADZIE OFF-LINE WZGLĘDEM Ę UKŁADU ON-LINE : Bardzo dobra odtwarzalność wyników Mała objętość próbek do analizy Krótszy czas analizy Możliwość automatyzacji procesu Wysoki koszt wyposażenia efekty pamięci złoża, brak możliwości powtórzenia danej analizy, brak możliwości wzbogacania analitów z kilku próbek równocześnie (w przypadku układu of-line jest możliwe prowadzenie kilku operacji ekstrakcji równocześnie) 12-14.05.2008, Ślesin 50
Technika SPE-HPLC-DAD-MS umożliwia wykrywanie śladowych d h ilości ś i( (na poziomie i ppt) rożnych ż farmaceutyków w próbkach wody Off-line On-line RSD % <11 <7 Odtwarzalność % 30-100 89-105 Granica wykrywalności ng/l 20-950 0,7-50 12-14.05.2008, Ślesin 51
Średnie stężenia analitów w próbkach wody rzecznej, ścieków surowych i oczyszczonych oraz oszacowany stopień ń usuwania poszczególnych analitów w oczyszczalni ścieków (Launceston, UK) Analit Ścieki surowe (ng/l) Ścieki oczyszczone (ng/l) Stopień usuwania farmaceutyków podczas oczyszczania ścieków [%] Metformin 151967 8552 94 Cymetydyna 894 90 90 Atenolol 8087 768 90 Ranitydyna y <5 33 -- Metoprolol 50 15,1 70 Propranolol 335 97 71 Norfluksetyna <20 <5 -- Paroksetyna 30 0,8 97 Fluoksetyna 57 11,4 80 Diklofenak 471 490 0 Felodypina 38,4 1,2 97 Naproksen 2613 150 94 Triklosan ~7500 ~90 ~99 12-14.05.2008, Ślesin 52
Procedury analityczne dla różnych matryc off-line SPE passive SPE SPE on-line n SPE 12-14.05.2008, Ślesin 53
Techniki pasywne pobierania próbek analitów SPMD paski LDPE MESCO POCIS Pobieranie analitów następuje na drodze swobodnego transportu masy przez membranę do medium zatrzymującego, na skutek różnicy potencjałów chemicznych h związków w medium zatrzymującym i środowiskiem wodnym, w którym umieszczany jest próbnik. 12-14.05.2008, Ślesin 54
Konstrukcja próbnika typu CHEMCATCHER 12-14.05.2008, Ślesin 55
Konstrukcja próbnika typu CHEMCATCHER Budowa próbnika: - obudowa - membrana - medium zatrzymujące Próbnik typu Chemcatcher został zaprojektowany na University of Portsmouth, UK. STAMPS = Standardised Aquatic Monitoring of Priority Pollutants by Passive Sampling 12-14.05.2008, Ślesin 56
Konfiguracja próbnika typu CHEMCATCHER użyte w badaniach Typ próbnika Chemcatcher typ 1 Chemcatcher typ 2 Chemcatcher typ 3 Chemcatcher typ 4 Medium zatrzymujące krążek ekstrakcyjny C18 krążek ekstrakcyjny C18 krążek ekstrakcyjny SDB-RPS krążek ekstrakcyjny SDB-XC Membrana polieterosulfo- nowa - - - Analiza LC-DAD-MS LC-DAD-MS LC-DAD-MS LC-DAD -MS 12-14.05.2008, Ślesin 57
Kalibracja próbnika typu CHEMCATCHER wzorce Zużyta woda mies szadło Próbniki woda pompa 100 μl/min Komora ekspozycyjna pompa 30 ml/min 12-14.05.2008, Ślesin 58
Warunki rozdzielania i analizy z wykorzystaniem techniki HPLC-DAD-MS Elementy układu pomiarowego chromatograf cieczowy HPLC 1100, Agilent Parametry pracy układu kolumna Altima HPLC - 18 EPS 250mm x 4.6 mm x 5µm faza ruchoma A: H2O + 1% HCOOH B: MeOH/ACN (1:1, v:v) + 1% HCOOH natężenie przepływu 0.9 ml/min strumienia fazy ruchomej gradient czas %A %B 0 60 40 7.5 45 55 10 45 55 20 0 100 czas trwania analizy 20 min 12-14.05.2008, Ślesin 59
Monitorowane jony MS (SCAN 20-280) sposób jonizacji: elektrorozpylanie SIM tolmetin 212 naproxen 229 fenoprofen 241 ibuprofen 205 diklofenak 294 diflunisal 249 DAD 275nm 12-14.05.2008, Ślesin 60
WNIOSKI złożona i różnorodna matryca SPE niski poziom zawartości oznaczanych związków 12-14.05.2008, Ślesin 61
Analityka i monitoring środowiska Problemy i wyzwania Niskie i bardzo niskie poziomy stężeń analitów w próbkach charakteryzujących się złożonym składem matrycy Możliwość fluktuacji czasowych i przestrzennych stężeń ksenobiotyków Niebezpieczeństwo b i ń t interferencji związanych z występowaniem składników o zbliżonych właściwościach fizykochemicznych Nieznajomość szlaków przemian poszczególnych ksenobiotyków Konieczność oznaczania nie tylko zanieczyszczeń pierwotnych ale także i produktów przemian i metabolizmu Brak odpowiednich wzorców i materiałów odniesienia 12-14.05.2008, Ślesin 62
Produkty farmaceutyczne (PP s) w środowisku (podejście zintegrowane) Cykl życia produktów farmaceutycznych Wytwórcy Dystrybutorzy Konsumenci Wody odpływowe z oczyszczalni ścieków (WWTP) Receptory środowiskowe Narażenie organizmów Typ dostępnych danych Farmakologiczne Fizyko-chemiczne Konsumpcja Odpowiednie PPs i ich metabolity Skuteczność terapii Emisja stężeń PPs i produktów ich przemian MECs (naturalna i pitna woda, osady i gleba) Los środowiskowy (biodostępność, trwałość) Toksyczność Bioakumulacja Inne efekty Podejście zintegrowan e Działania W celu zmniejszenia występowania i wpływu PPs (zapobieganie, nowe sposoby oczyszczania scieków ) 12-14.05.2008, Ślesin 63
Bank próbek środowiskowych (Environmental Specimen Bank ESB) Banki takie służą do systematycznego archiwizowania często pobieranych reprezentatywnych próbek środowiskowych i próbek organizmów i narządów ludzkich. Próbki są przechowywane w bardzo niskich temperaturach (T< 150 C) co gwarantuje, że składniki próbek nie podlegają zmianom w czasie długotrwałego przechowywania. Materiał ł przechowywany w ten sposób nie tylko służy ł ż do weryfikacji retrospektywnej obecności i poziomu stężeń poszczególnych zanieczyszczeń, ale może również posłużyć do sprawdzenia ich źródeł pochodzenia (emisji). 12-14.05.2008, Ślesin 64
Bank próbek środowiskowych (zasady wyboru próbek do zasobów banku) rozpowszechniony typ próbki duże znaczenie ekologiczne łatwość zbierania próbek pełnienie funkcji wskaźnika dla typowych procesów i zależności występujących w ekosystemach znaczenie i typowy przykład dla danego obszaru i ekosystemu wysoki poziom informacji analitycznej uzyskiwany w wyniku analizy próbek wystarczający wysoki poziom ekspozycji na zanieczyszczenia łatwość identyfikacji 12-14.05.2008, Ślesin 65
Cele zadania banku próbek środowiskowych ciągły monitoring ksenobiotyków w próbkach środowiskowych uzyskanie informacji co do tendencji zmian w poziomie zanieczyszczenia środowiska zapewnienie dostępu do prawdziwych próbek w celu przeprowadzenia retrospektywnych badań poziomu zanieczyszczenia środowiska a w szczególności: oznaczania składników, które były nie znane w momencie zbierania próbek oznaczania poziomu zawartości konkretnych ksenobiotyków z wykorzystaniem nowych (ulepszonych) procedur analitycznych skutecznej kontroli przestrzegania odpowiednich uregulowań prawnych w zakresie kontroli jakości powietrza, wody i gleby ciągłego monitoringu poziomu zanieczyszczenia w miejscach, w których zebrane zostały próbki do zasobów banku opracowania nowych procedur analitycznych standaryzacji (walidacji) procedur analitycznych oraz technik pomiarowych 12-14.05.2008, Ślesin 66
Problemy z wykorzystaniem y informacji o środowisku DYLEMAT Z DANYMI (Data dilemma) WYTWARZANIE INFORMACJI ZAPOTRZEBOWANIE NA INFORMACJE Wytwarzane informacje są tak poszatkowane (fragmentacyjne) i niespójne, że różne a czasem nawet i przeciwstawne wnioski mogą być wyciągnięte w oparciu o dostępne zbiory danych. PROBLEM ORIENTACJI (wykorzystania dostępnych danych) Mogą stanowić podstawę do udzielenia różnych odpowiedzi na następujące cztery pytania: 1 Jakie są luki w dostępnych informacjach i jaki typ danych jest potrzebny? 2 Jaka jest możliwość wykorzystania uzyskanych wyników? 3 Jaki jest konkretny cel podjętych badań? 4 Jakie są właściwe metody do przeprowadzenia badań określonego obiektu w celu uzyskania zamierzonego celu. Brak jest naukowych informacji, które mogłyby ułatwić ocenę istniejących zagrożeń środowiskowych i alternatywnych rozwiązań danego problemu 12-14.05.2008, Ślesin 67
PUBLIKACJE poświęcone problematyce pozostałości farmaceutyków w środowisku Kot-Wasik A., Dębska J., Namieśnik J., Analytical techniques in studies of the environmental fate of pharmaceuticals and person-care products, Trends in Analytical Chemistry, 26, 557-568 (2007) Wilga J., Kot-Wasik A., Namieśnik ś ik J., Comparison of extraction ti techniques of robenidine from poultry feed samples, Talanta, 73, 812-819 (2007) Kot-Wasik A., Dębska J., Wasik A., Namieśnik J., Determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs in natural waters using off-line and on-line SPE followed by LC coupled with DAD-MS, Chromatographia, 64, 13-21(2006) Dąbrowska ą D., Kot-Wasik A., Namieśnik J. Pathways and analytical tools in degradation studies of organic pollutants. Crit. Rev. Anal. Chem., (2005) 35, s. 117-133. Dębska J., Kot-Wasik A., Namieśnik J., Determination of nonsteroidal antiinflammatory a ato drug in water samples using liquid chromatography ap coupled with diode-array detector and mass sepctromentry, J. Sep. Sci, (2005),28 s. 2419-2426 12-14.05.2008, Ślesin 68
Katedra Chemii Analitycznej http://www.pg.gda.pl/chem/katedry/analityczna /analit.html Lista publikacji Wykłady yprezentowane w czasie konferencji Kursy i szkolenia 12-14.05.2008, Ślesin 69
Kursy i szkolenia Kursy indywidualne "Na zamówienie" Wysokosprawna chromatografia cieczowa Wysokosprawna Chromatografia Cieczowa - poziom podstawowy Wysokosprawna Chromatografia Cieczowa - poziom zaawansowany Chromatografia Gazowa - poziom podstawowy Aspekty praktyczne wykorzystania Chromatografii Gazowej Przygotowanie próbek do analizy ABC techniki SPE Technika HPLC w analizie żywności Techniki łączone Kurs Kontrola i jakość wyników pomiarów analitycznych Biotesty w ocenie zanieczyszczenia środowiska 12-14.05.2008, Ślesin 70
Ocena i kontrola jakości wyników pomiarów analitycznych Praca zbiorowa pod. red. P. Konieczki i J. Namieśnika ISBN: 978-83-204-3255-8 12-14.05.2008, Ślesin 71
ISEAC 08 12-14.05.2008, Ślesin 72
Katedra Chemii Analitycznej 12-14.05.2008, Ślesin 73
Dziękuję za uwagę! 12-14.05.2008, Ślesin 74