Komórki macierzyste tkanek zęba i możliwości odtwarzania struktur zęba przegląd piśmiennictwa

Czas. Stomatol., 2010, 63, 11, 682-692 2010 Polish Dental Society http://www.czas.stomat.net Komórki macierzyste tkanek zęba i możliwości odtwarzania struktur zęba przegląd piśmiennictwa Dental stem cells and regeneration of tooth structures review of literature Ewa Olender 1, Artur Kamiński 1, 2, Izabela Uhrynowska-Tyszkiewicz 1, Hubert Wanyura 2 Z Zakładu Transplantologii i Centralnego Banku Tkanek WUM 1 Kierownik: dr hab. med. A. Kamiński Z Kliniki Chirurgii Czaszkowo-Szczękowo-Twarzowej WUM 2 Kierownik: prof. zw. dr hab. med. H. Wanyura Summary Introduction: Stem cells and their possible application in medical treatment is a subject of intensive research. These cells are characterised by their ability to self-renew and differentiate into cells of the tissue of origin. The presence of stem cells in adult organisms (the so-called somatic stem cells) enables tissue regeneration. Stem cells are also present in dental tissues. Experiments to determine the properties of dental stem cells and potential therapeutic applications are carried out. Aim of the study: To present up to date information on heretofore identified dental stem cells, and about their potential applications in dental and periodontal tissue regeneration. Conclusions: So far, several kinds of dental stem cells have been identified in dental tissue and periodontal ligaments. It has been found that they can differentiate to odontoblasts, osteoblasts, and neuron-like cells. These dental stem cells can be used to regenerate dentine, pulp, or periodontal ligament. They can also be used to form an experimental biotooth. No adult stem cell that would be able to regenerate enamel has yet been identified. KEYWORDS: stem cells, dental tissues, dental structure regeneration Streszczenie Wstęp: komórki macierzyste oraz możliwości ich wykorzystania w leczeniu stanowią przedmiot intensywnych badań. Komórki te charakteryzuje zdolność do samoodtwarzania i przekształcania w zróżnicowane komórki danej tkanki. Obecność komórek macierzystych w dojrzałym organizmie (tzw. somatycznych komórek macierzystych) umożliwia regenerację tkanek. W tkankach zęba oraz tkankach okołozębowych również stwierdzono obecność komórek macierzystych. Prowadzone są badania nad ich właściwościami oraz możliwościami wykorzystania w terapii. Cel pracy: przedstawienie informacji na temat dotychczas zidentyfikowanych komórek macierzystych zęba i więzadła ozębnowego oraz możliwości ich zastosowania do odtwarzania tkanek zęba oraz tkanek okołozębowych. Podsumowanie: dotychczas zidentyfikowano kilka rodzajów komórek macierzystych obecnych w tkankach zęba i więzadle ozębnowym. Stwierdzono doświadczalnie, że komórki te mogą przekształcać się między innymi w: odontoblasty, osteoblasty oraz komórki podobne do neuronów. Wykazano możliwość zastosowania komórek macierzystych do odtwarzania: miazgi, zębiny i więzadła ozębnowego. Komórki te wykorzystuje się również w próbach wytworzenia biologicznego zęba zastępczego. Nie zidentyfikowano dotychczas somatycznych komórek macierzystych zdolnych do odtwarzania szkliwa. HASŁA INDEKSOWE: komórki macierzyste, tkanki zęba, odtwarzanie struktur zęba 682

2010, 63, 11 Komórki macierzyste tkanek zęba Wprowadzenie Dojrzałe tkanki zęba oraz tkanki okołozębowe wykazują zdolność do regeneracji. Odtwarzaniu może ulegać uszkodzona zębina oraz tkanki przyzębia. Naturalna odbudowa tkanek po ich uszkodzeniu jest możliwa dzięki obecności w nich puli komórek zdolnych do odtworzenia nie tylko samych komórek, lecz także macierzy zewnątrzkomórkowej. Badania nad regeneracją zębiny wykazały, że w proces odbudowy zaangażowane są nie tylko odontoblasty, lecz również inne komórki miazgi, położone pod warstwą odontoblastów. Komórki te umożliwiają regenerację odontoblastów i zębiny w przypadku głębokich uszkodzeń ze zniszczeniem warstwy odontoblastów [7], zaś w określonych warunkach mogą one ulegać asymetrycznym podziałom, w wyniku których odtwarzana jest komórka niezróżnicowana oraz powstaje komórka zróżnicowana zdolna do syntezy macierzy zewnątrzkomórkowej. Komórki o ww. charakterystyce określane są mianem komórek macierzystych. Wyróżnia się dwa podstawowe typy komórek macierzystych: embrionalne (ang. Embryonic Stem Cells) i somatyczne, obecne w tkankach dojrzałego organizmu (ang. Adult Stem Cells). Embrionalne komórki macierzyste mają charakter totipotencjalny, tzn. mogą różnicować się w każdy rodzaj komórki obecny później w ukształtowanym organizmie. W przeciwieństwie do nich, somatyczne komórki macierzyste wykazują ograniczony potencjał różnicowania. Ich rola polega na zapewnieniu możliwości ciągłego samoodtwarzania i naprawy uszkodzonych tkanek [19]. Pomiędzy stanem totipotencjalności a ostatecznym zróżnicowaniem istnieją stadia pośrednie, w których komórki zachowują zdolność różnicowania w rozmaite, ale nie wszystkie, rodzaje komórek. Cel pracy Celem pracy było podanie informacji dotyczących zidentyfikowanych dotychczas komórek macierzystych zęba i więzadła ozębnowego oraz możliwości ich wykorzystania do odtwarzania tkanek zęba. Komórki macierzyste zęba i więzadła ozębnowego Zainteresowanie terapią komórkową skłania badaczy do poszukiwania komórek macierzystych w różnych tkankach. Wśród komórek o cechach komórek macierzystych, wyizolowanych z tkanek zęba i więzadła ozębnowego wyróżniono dotychczas następujące grupy: komórki macierzyste miazgi zęba, (ang. Dental Pulp Stem Cells DPSC), komórki macierzyste z ludzkich zębów mlecznych, (ang. Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth SHED), komórki macierzyste woreczka zębowego (ang. Dental Follicle Stem Cells DFSC), komórki macierzyste wierzchołkowej części brodawki zębowej, (ang. Stem Cells of the Apical part of the Papilla SCAP), komórki macierzyste więzadła ozębnowego, (ang. Periodontal Ligament Stem Cells PDLSC). Komórki macierzyste miazgi zęba, (ang. Dental Pulp Stem Cells - DPSC) Zębina wytwarzana jest przez odontoblasty. Komórki macierzyste, które są źródłem odnowy odontoblastów, tzn. wykazują zdolność namnażania się i przekształcania w odontoblasty, zlokalizowano w miazdze zęba. Ich charakter i rola zostały wstępnie zidentyfikowane w badaniach procesów naprawczych zębiny po eksperymentalnym uszkodzeniu zębiny, obserwowano bardzo intensywne podziały komórkowe poniżej warstwy odontoblastów, w miazdze zęba [7]. Jako pierwsze spośród komórek macierzystych zęba zostały wyizolo- 683

E. Olender i in. Czas. Stomatol., wane DPSC. W warunkach hodowli in vitro komórki te wykazują szybkie tempo proliferacji (częste podziały komórkowe), zaś ich kolonie wytwarzają uwapnione struktury [11]. Wykazano również, że DPSC po wszczepieniu na rusztowaniu HA/TCP (hydroksyapatyt/fosforan triwapniowy) pod skórę myszy bezgrasiczych (usunięcie grasicy zapobiega reakcji immunologicznej i odrzuceniu przeszczepu), wytwarzają tkankę zębinopodobną zawierającą kolagen typu I. DPSC posiadają markery typowe dla komórek macierzystych STRO-1 i CD34, mogą różnicować się także w osteoblasty, komórki endotelium i komórki nerwowe. Zatem mają charakter komórek multipotencjalnych [1, 3, 10]. Dokładniejsza analiza DPSC wskazuje, że komórki te umiejscowione są w obszarach okołonaczyniowych miazgi, i być może wywodzą się z perycytów komórek przydanki naczyń [36]. Komórki macierzyste z ludzkich zębów mlecznych (ang. Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth SHED) Zęby mleczne budzą zainteresowanie jako źródło komórek macierzystych ze względu na łatwą dostępność. Wyizolowano populację komórek SHED z miazgi zębów mlecznych. Komórki te, podobnie jak DPSC, zlokalizowane są w obszarach okołonaczyniowych miazgi. Charakteryzują się wyższym potencjałem proliferacyjnym częstszymi podziałami komórkowymi niż DPSC. Wykazują także intensywniejszą ekspresję genów związanych z wytwarzaniem macierzy zewnątrzkomórkowej, np. czynnika wzrostu fibroblastów, (ang. Fibroblast Growth Factor FGF) i transformującego czynnika wzrostu beta, (ang. Transforming Growth Factor TGF β). TGF β jest wytwarzany w reakcji na uszkodzenie tkanek i prawdopodobnie stanowi sygnał mobilizujący komórki macierzyste miazgi do przekształcania się w odontoblasty [37]. Komórki SHED wysiane na rusztowania i wszczepione podskórnie myszom bezgrasiczym różnicują się do komórek sródbłonka naczyń oraz do odontoblastów [2, 34]. Komórki macierzyste woreczka zębowego, (ang. Dental Follicle Stem Cells DFSC) Woreczek zębowy jest zagęszczeniem tkanki mezenchymatycznej wokół rozwijającego się zawiązka zęba. Aktywność komórek woreczka prowadzi do powstania więzadła ozębnowego oraz cementu [21]. Uważa się, że woreczek zębowy zawiera komórki progenitorowe cementoblastów, osteoblastów oraz komórek więzadła ozębnowego. Pierwotnie uważano, że zdolność komórek woreczka do różnicowania w linie komórkowe wynika z ich multipotentnego charakteru. Wykazano jednak, że komórki woreczka nie stanowią jednorodnej grupy [25]. W warunkach hodowli in vitro, komórki woreczka zębowego są w stanie różnicować się do komórek podobnych do cementoblastów i osteoblastów [26, 46]. Po przeszczepieniu myszom bezgrasiczym komórki DFSC wytwarzają włóknistą tkankę przypominającą więzadło ozębnowe oraz zmineralizowaną tkankę podobną do cementu [12]. Komórki macierzyste wierzchołkowej części brodawki zębowej, (ang. Stem Cells of Apical part of the Papilla SCAP) Komórki macierzyste wierzchołkowej części brodawki zębowej zlokalizowane są na szczycie korzenia zęba w fazie wzrostu, przed jego wyrznięciem. Do celów badawczych SCAP izoluje się z niedojrzałych zawiązków zębów trzonowych. Komórki te mogą różnicować się do odontoblastów i wytwarzają zębinę. Po przeszczepieniu podskórnie SCAP myszom bezgrasiczym na nośniku HA/TCP obserwo- 684

2010, 63, 11 Komórki macierzyste tkanek zęba wano pokrycie nośnika warstwą zębiny i wytwarzanie tkanki łącznej właściwej [38]. SCAP w porównaniu z DPSC cechuje szybsze tempo podziałów komórkowych. Szczególne zainteresowanie budzi rola SCAP w procesie dojrzewania korzenia i możliwość ich zastosowania w konstruowaniu korzenia zęba metodami inżynierii tkankowej [15]. Komórki Macierzyste Więzadła Ozębnowego (ang. Periodontal Ligament Stem Cells - PDLSC) O obecności komórek macierzystych w więzadle ozębnowym świadczy zdolność jego regeneracji. Komórki posiadające markery komórek macierzystych Stro-1, CD146/MUC18, wyizolowano z ludzkiego więzadła ozębnowego. W warunkach hodowli in vitro różnicują się do komórek o cechach cementoblastów, komórek tłuszczowych oraz komórek syntetyzujących kolagen. PDLSC po przeszczepieniu gryzoniom bezgrasiczym wytwarzają cement oraz struktury przypominające ozębną. Przeszczepianie PDLSC może być w przyszłości wykorzystane w leczeniu chorób przyzębia [35]. Komórki odontogenne pochodzenia nabłonkowego Poszczególne części zawiązka zęba powstają z jednej z dwóch tkanek embrionalnych: tkanki nabłonkowej, pochodzącej z nabłonka pierwotnej jamy ustnej oraz mezenchymy wywodzącej się z grzebienia nerwowego [21]. W formowaniu szkliwa bierze udział tkanka nabłonkowa, zaś pozostałe struktury zęba rozwijają się z mezenchymy. Komórki macierzyste zęba, które zostały dotychczas zidentyfikowane wywodzą się z mezenchymy. Szkliwo zęba jest wytwarzane przez ameloblasty, komórki wywodzące się z odontogennej tkanki nabłonkowej. W ostatniej fazie tworzenia szkliwa, przed wyrznięciem zęba, ameloblasty zanikają. Jak dotąd nie zidentyfikowano komórek macierzystych dojrzałego zęba ludzkiego, które wykazywałyby zdolność do różnicowania się w komórki o charakterze nabłonkowym, zdolnych do indukcji odontogenezy oraz tworzenia szkliwa. Stanowi to zasadniczą trudność w uzyskaniu biologicznego substytutu szkliwa i biologicznego zęba zastępczego. Potencjalnym źródłem komórek nabłonkowych zdolnych do zróżnicowania do ameloblastów jest nabłonek zawiązków zębów, np. pozyskiwanych z trzecich zębów trzonowych przed ich wyrznięciem. W praktyce ich wykorzystanie oznaczałoby konieczność resekcji oraz przechowywania komórek w warunkach zapewniających ich przeżycie i zachowanie właściwości do czasu, gdy zaistnieje potrzeba ich wykorzystania do procedur odtwórczych. W doświadczeniach na zwierzętach stwierdzono, że komórki wyizolowane z zawiązków zęba namnażają się in vitro oraz wykazują zdolność do spontanicznej reagregacji. Z powstałych agregatów nabłonkowo-mezenchymalnych, po ich przeszczepieniu do sieci lub pod torebkę nerki, co zapewnia właściwe ukrwienie, rozwija się zawiązek zęba [28]. Źródłem komórek odontogennych mogą być komórki ludzkie inne niż zęba. Wykazano na przykład, że ludzkie keratynocyty (komórki nabłonkowe skóry) w hodowli z mysimi embrionalnymi komórkami mezenchymy zębotwórczej, w obecności czynnika wzrostu FGF8, syntetyzują białko charakterystyczne dla nabłonka zębotwórczego - PITX2. Stwierdzono także, że w ww. układzie doświadczalnym keratynocyty różnicują się do ameloblastów syntetyzujących szkliwo (dochodzi do wykształcenia tkanek korony zęba, o charakterze chimerycznym, ludzko-mysim) [40]. Jednak wykorzystanie kliniczne takich chimer budzi wątpliwości i nie jest rozwiązaniem do zaakceptowania. 685

E. Olender i in. Czas. Stomatol., Podejmuje się także próby wykorzystania w analogicznym celu nabłonka jamy ustnej. W doświadczeniach na myszach, nabłonek jamy ustnej w kontakcie z mezenchymą zawiązka zęba podejmuje czynność nabłonka zębotwórczego. Tkanki te po przeszczepieniu pod torebkę nerki rozwijały się w zawiązek zęba, w którym stwierdzano obecność odontoblastów i ameloblastów oraz szkliwa i zębiny [27]. Zastosowania terapeutyczne komórek macierzystych tkanek zęba i więzadła ozębnowego Regeneracja zębiny i miazgi Pierwsze naukowe doniesienia na temat regeneracji zębiny autorstwa Johna Huntera, brytyjskiego chirurga, pioniera anatomii patologicznej w Anglii pochodzą z XVIII wieku. Możliwość stymulowania regeneracji zębiny wodorotlenkiem wapnia zaobserwowano w latach 30-tych XX wieku. W przypadku niewielkich uszkodzeń, odontoblasty reagują zwiększoną aktywnością i syntetyzują zębinę naprawczą, zaś w przypadku uszkodzeń głębokich, ulegają martwicy i są zastępowane populacją nowych komórek, powstałych z komórek macierzystych miazgi. Funkcjonowanie odontoblastów oraz zębiny jest uzależnione od istnienia i czynności miazgi zęba. Leczenie endodontyczne prowadzi między innymi do upośledzenia cech mechanicznych zębiny. Próby indukowania regeneracji miazgi podejmowano w latach 60-tych i 70-tych XX wieku, jednak bezskutecznie. Przełom nastąpił w latach 90 dzięki rozwojowi inżynierii tkankowej i terapii komórkowych. Współczesne koncepcje odtwarzania miazgi zęba opierają się na zastosowaniu trójwymiarowych rusztowań z materiałów biodegradowalnych (np. kolagenu, kwasu poliglikolowego PGA), na które wysiewa się komórki zdolne do syntezy macierzy miazgi. Konstrukty składające się z rusztowania oraz komórek DPSC i SHED wszczepiano zwierzętom podskórnie. W przypadku zastosowania rusztowań z kwasu polimlekowego, (ang. Polylactid Acid PLA), po kilku tygodniach od implantacji obserwowano formowanie tkanki miazgi oraz obecność odontoblastów i warstwy zębiny [2]. W przypadku rusztowań z kolagenu nie stwierdzano obecności odontoblastów oraz formowania macierzy miazgi. Przyczyny tych różnic upatruje się we właściwościach mechanicznych kolagenu [14, 33]. Podejmowane są również próby wykorzystania SCAP. Uzyskano obiecujące wyniki z zastosowaniem rusztowań PLA wytworzona miazga była dobrze unaczyniona, pokryta warstwą zębiny o jednolitej grubości [14]. Częściową regenerację miazgi w obrębie zęba uzyskała grupa badawcza Nakashimy w badaniach na psach. Autologiczne DPSC hodowano w postaci sferoidu. Komórki poddano działaniu białka morfogenetycznego kości (ang. Bone Morphogenetic Protein BMP2) i wszczepiono do częściowo amputowanej komory zęba. Uzyskano regenerację zębiny przez nowo powstałe odontoblasty [17]. W innym doświadczeniu komórki miazgi wysiewano na rusztowanie kolagenowe i umieszczano w częściowo opróżnionej komorze zęba. Zaobserwowano odtworzenie miazgi wraz z naczyniami oraz zębiny [18]. Barierę w zastosowaniach klinicznych może stanowić niedostateczne zaopatrzenie w krew kanału i komory zęba, zwłaszcza w przypadku, gdy średnica otworu wierzchołka korzenia jest mniejsza niż 1 mm. Nowo wytworzona zębina okazała się tkanką o gorszej jakości, aniżeli naturalna zębina naprawcza, zaś nie obserwowano w niej wysoko zorganizowanej struktury kanalikowej. Problemem stanowi także dostępność autologicznych komórek macierzystych 686

2010, 63, 11 Komórki macierzyste tkanek zęba zęba. Rozwiązaniem może być bankowanie zębów bądź komórek macierzystych tkanek zęba [15]. Regeneracja więzadła ozębnowego Stany zapalne więzadła ozębnowego prowadzą do uszkodzenia, a nawet utraty aparatu więzadłowego zęba oraz niszczenia kości wyrostka zębodołowego. Regeneracja więzadła ozębnowego oraz kości wyrostka zębodołowego może być w przyszłości wspomagana terapią komórkową. W tym celu podejmowane próby z wykorzystaniem różnych populacji komórek macierzystych są ukierunkowane na odtworzenie procesów embrionalnych, zgodnie z ich naturalną chronologią i lokalizacją [31], a także metody inżynierii tkankowej z zastosowaniem rusztowań obsianych komórkami. Metody inżynierii tkankowej są koncepcyjnie prostsze i skupiają się na doborze właściwych materiałów i komórek. Obiecujące są wyniki doświadczeń, w których przeszczepia się film komórkowy, uzyskany z hodowli PDLSC. Komórki te izoluje się z trzecich zębów trzonowych i hoduje w specjalnych naczyniach pokrytych poli-n- -isopropylacrylo-amidem (PIPAAm). Materiał ten umożliwia samoistne oddzielenie komórek od podłoża w niskich temperaturach i uzyskanie filmu komórkowego zdatnego do przeszczepienia. Filmy takie przeszczepiano szczurom, którym uprzednio usunięto więzadło ozębnowe oraz cement. Obserwowano formowanie włókien więzadła oraz bezkomórkowej warstwy cementopodobnej. Nie dochodziło jednak do wytwarzania tkanki kostnej [8]. Według innych doniesień, przeszczepienie w okolicę wierzchołka korzenia zęba namnożonych w hodowli PDLSC skutkowało wytworzeniem struktur więzadła, kości i cementu. Równocześnie obserwowano wrastanie nerwu obwodowego i naczynia krwionośnego do kanału korzenia [32]. Regenerację kości uzyskano w doświadczeniach, w których komórki (dwie grupy mezenchymatyczne komórki macierzyste szpiku kostnego i PDLSC) przeszczepiano na rusztowaniu z HA/TCP. Osiem tygodni po przeszczepieniu stwierdzano obecność nowo wytworzonej tkanki kostnej. Formowanie kości było bardziej efektywne w przypadku użycia komórek szpiku [20]. Wypracowanie metodyki odtwarzania więzadła ozębnowego możliwej do zastosowania klinicznego wymaga dalszych badań. Wytwarzanie biologicznych zębów zastępczych Uzyskanie żywej biologicznej struktury wymaga obecności komponentu komórkowego. W wielu ośrodkach badawczych prowadzi się prace nad wytworzeniem biologicznego (żywego) zęba zastępczego. Próby ewoluowały w dwóch kierunkach: namnażania i wysiewania komórek na rusztowania polimerowe in vitro, a następnie implantacji obsianego rusztowania oraz implantacji odpowiednio dobranych i zmodyfikowanych komórek bez wysiewania na rusztowania. Przeszczepiane komórki powinny wykazywać samoistny potencjał odontogenny lub indukowany czynnikami wzrostu i transkrypcji [31]. Pod uwagę brane są komórki: zęba i jego zawiązka, struktur okołozębowych oraz macierzyste komórki mezenchymatyczne szpiku kostnego [44]. Wyniki doświadczeń na zwierzętach są obiecujące. Konglomeraty embrionalnych komórek nabłonkowych i mezenchymalnych uzyskanych z zawiązka zęba, konglomertaty embrionalnych komórek nabłonka jamy ustnej oraz mezenchymatycznych komórek macierzystych szpiku, po wszczepieniu pod torebkę nerki lub do zębodołu podejmowały proces odontogenezy i prowadziły do wytworzenia struktur zęba. 687

E. Olender i in. Czas. Stomatol., Problematyczne pozostaje wyhodowanie korzenia zęba jest ono możliwe tylko w sytuacji, gdy powstały zawiązek rozwija się w kontakcie z tkanką kostną [28, 30]. Wyniki doświadczeń z zastosowaniem rusztowań są gorsze. Wyhodowane struktury zawierały tkanki typowe dla zęba, jednak były one chaotycznie rozłożone, zaś całość nie osiągała rozmiarów i formy zastosowanego i wymodelowanego na kształt zęba rusztowania [5, 6]. Obecnie największą barierą w uzyskiwaniu biologicznych zębów zastępczych jest brak odpowiedniego źródła nieembrionalnych komórek zdolnych do podjęcia czynności nabłonkowych komórek zawiązka zęba, w tym wykształcenia szkliwa i udziału w tworzeniu korzenia. Inne potencjalne zastosowania komórek macierzystych tkanek zęba Doświadczalnie wykazano znaczną plastyczność komórek macierzystych tkanek zęba. Mogą one, w odpowiednich warunkach, różnicować się do osteoblastów, chondrocytów, komórek mięśniowych, tłuszczowych oraz nerwowych [22]. Szczególne zainteresowanie budzi uzyskiwanie tkanki kostnej z komórek macierzystych tkanek zęba oraz ich zastosowanie w chorobach neurodegeneracyjnych. Komórki pochodzące z miazgi zębów mlecznych umieszczane w hodowli przekształcają się w komórki kościotwórcze (osteoblasty), czego dowodem jest obserwowana synteza osteokalcyny, białka charakterystycznego dla osteoblastów. Po 30 dniach hodowli obserwowano formowanie tkanki kostnej splotowatej (niedojrzałej). Tkanka ta, po przeszczepieniu szczurom bezgrasiczym ulegała przebudowie do tkanki kostnej blaszkowatej (dojrzałej). Miazga zębów mlecznych może być zatem źródłem osteoblastów oraz zmineralizowanej tkanki [22]. W serii innych doświadczeń na zwierzętach, w miejsce celowo wytworzonego ubytku kostnego przeszczepiano komórki macierzyste zęba zawieszone w osoczu bogatopłytkowym, (ang. Platelet Rich Plasma PRP). Osocze pełniło rolę naturalnego nośnika oraz źródła sygnałów molekularnych. Przeszczepiano DPSC i DHED oraz komórki macierzyste szpiku (ang. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells BM- MSC). Tkanki oceniano po 2, 4 i 8 tygodniach. W przypadku przeszczepiania DPSC, SHED i BM-MSC obserwowano znacznie efektywniejszą odbudowę tkanki kostnej w stosunku do prób kontrolnych (ubytek kości wypełniony krwią, ubytek kości wypełniony PRP) [43]. Zarówno komórki DPSC jak i SHED w odpowiednich warunkach hodowli in vitro mogą różnicować do komórek morfologicznie przypominających neurony, o podobnym do neuronów profilu ekspresji genów. DPSC, nawet niezróżnicowane morfologicznie w kierunku neuronalnym, wykazują ekspresję markerów neuroektodermalnych PAX6, GBX2, białka nestyny, a także markerów neuronalnych jak: BDNF (ang. Brain-Derived Neurotrophic Factor), NGF (ang. Nerve Growth Factor) oraz GDNF (ang. Glial cell-derived Neurotrophic Factor) i wykazują wyraźną predyspozycję do różnicowania do linii neuronalnych [9, 29]. Funkcjonalne komórki neuronalne uzyskiwane z łatwo dostępnych, nie budzących zastrzeżeń natury etycznej komórek macierzystych, np. z komórek macierzystych zęba, mogłyby być wykorzystywane do leczenia chorób neurodegeneracyjnych, (np. choroba Parkinsona). Przyczyną choroby Parkinsona jest obumieranie dopaminergicznych neuronów istoty czarnej, co prowadzi do obniżenia poziomu dopaminy w prążkowiu. Komórki SHED inkubowano w medium zawierającym cytokiny oraz czynniki wzrostu pobudzające różnicowanie w kierunku komórek neuronów 688

2010, 63, 11 Komórki macierzyste tkanek zęba dopaminoergicznych, a następnie przeszczepiano szczurom chorym na ten rodzaj schorzenia. Obserwowano poprawę stanu zwierząt, którym przeszczepiono do prążkowia tak inkubowane komórki SHED w porównaniu z grupą kontrolna, której przeszczepiono traktowane standardowo komórki SHED. Wyniki badań świadczą o tym, że komórki SHED mogą stanowić źródło somatycznych komórek macierzystych do zastosowania w terapii komórkowej choroby Parkinsona [40]. Wykorzystanie komórek macierzystych izolowanych z innych tkanek do regeneracji tkanek zęba Mezenchymatyczne komórki macierzyste szpiku (BM-MSC) mogą różnicować się, między innymi, do komórek kości, chrząstki, mięśni, tkanki tłuszczowej. Podejmowano próby uzyskiwania z BM-MSC komórek tkanek zęba. Wykazano, że komórki BM-MSC hodowane razem z embrionalnymi komórkami nabłonka jamy ustnej różnicują się do komórek podobnych do odontoblastów, w których stwierdzono obecność białka markerowego odontogenzy PAX9. Po przeszczepieniu konglomeratów BM-MSC i embrionalnych komórek nabłonkowych jamy ustnej pod torebkę nerki dorosłych szczurów, obserwowano wytwarzanie struktur podobnych do zębów otoczonych tkanką miękką oraz kostną. Stwierdzano ekspresję sialoproteiny zębinowej w tkance powstałych struktur zębopodobnych [24]. Nadal poszukuje się alternatywnych, łatwiej dostępnych źródeł komórek macierzystych wykazujących potencjał odontogenny. Przykładem takiej struktury jest mieszek włosowy. Jego komórki mogą się różnicować do adipocytów, osteoblastów, a także, po indukcji przez mezenchymę zawiązka zęba, do odontoblastów [42]. Obiecujące wyniki otrzymano również w przypadku multipotentnych komórek skóry (ang. Dermal Multipotent Cells DMC). Komórki te, stymulowane czynnikami wzrostu zawartymi w nadsączu hodowli komórek zęba, różnicowały się do odontoblastów, a po przeszczepieniu podskórnym w postaci peletki, komórki te wytwarzały zmineralizowaną tkankę, podobnie jak to sie obserwuje po przeszczepieniu DPSC [16]. Możliwości bankowania komórek macierzystych zęba Krioprezerwacja tkanek i komórek stosowana jest od dziesięcioleci. Jej celem jest długotrwałe przechowywanie komórek, po którym możliwe jest przywrócenie im wszystkich funkcji biologicznych, zatrzymanych w procesie schładzania. W procesie krioprezerwacji stosuje się bardzo niskie temperatury, zwykle -70 C i niższe, oraz czynniki chemiczne o działaniu ochronnym w stosunku do komórek. Krioprezerwowane zęby wykorzystuje się z powodzeniem do autotransplantacji. W badaniach dotyczących właściwości mechanicznych i biologicznych krioprezerwowanych zębów i więzadeł ozębnowych, przeznaczonych potencjalnie do przeszczepienia stwierdzono, że właściwości mechaniczne zęba krioprezerwowanego nie odbiegają od właściwości normalnego zęba, tkanki więzadła ozębnowego zachowują satysfakcjonujące właściwości, tkanka miazgi ze względu na słabą przepuszczalność dla czynników krioprezerwujących ulega uszkodzeniu (zatem krioprezerwowany ząb jest niepełnowartościowy), jednak z miazgi nadal można izolować funkcjonalne komórki macierzyste DPSC [23]. Izolowanie DPSC jest możliwe przez co najmniej 120 godzin od ekstrakcji zęba. Komórki DPSC po izolacji można utrzymać w warunkach hodowli in vitro. Zamrożenie tej hodowli na wczesnych etapach zapewnia wysoki odsetek przeżywalności komórek. 689

E. Olender i in. Czas. Stomatol., Przechowywanie w temperaturach -85 C lub -196 C przez sześć miesięcy nie ma wpływu na czynność tych komórek [41]. Krioprezerwacja nie wpływa też negatywnie na komórki SCAP, Nie stwierdzono osłabienia potencjału różnicowania krioprezerwowanych komórek SCAP w stosunku do świeżo izolowanych [4]. Podsumowanie W tkankach dojrzałego zęba oraz więzadła ozębnowego obecne są komórki macierzyste. Komórki te biorą udział w naturalnych procesach naprawczych. Bada się możliwości ich zastosowania w leczeniu. Somatyczne komórki macierzyste tkanek zęba oraz więzadła ozębnowego mogą być wykorzystane do indukowania regeneracji więzadła ozębnowego, miazgi zęba, zębiny, a także wytwarzania biologicznych zębów zastępczych. Krioprezerwowanie i bankowanie zębów mlecznych, zdrowych trzecich zębów trzonowych lub komórek z nich pozyskanych umożliwia przechowywanie czynnościowych komórek macierzystych do czasu, gdy u danego pacjenta zajdzie potrzeba ich użycia do regenaracji tkanek. Komórki macierzyste zęba mogą stanowić źródło komórek wykorzystywanych w terapii komórkowej zmian w obrębie innych tkanek, np. w chorobach neurodegeneracyjnych. Piśmiennictwo 1. Arthur A, Rychkov G, Shi S, Koblar S A, Gronthos S: Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells 2008, 26, 7: 1787-1795. 2. Cordeiro M M, Dong Z, Kaneko T, Zhang Z, Miyazawa M, Shi S, Smith A J, Nör J E: Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J Endod 2008, 34, 8: 962-969. 3. d Aquino R, Graziano A, Sampaolesi M, Laino G, Pirozzi G, De Rosa A, Papaccio G: Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ 2007, 14, 6: 1162-1171. 4. Ding G, Wang W, Liu Y, An Y, Zhang C, Shi S, Wang S: Effect of cryopreservation on biological and immunological properties of stem cells from apical papilla. J Cell Physiol 2010, 223, 2: 415-422. 5. Duailibi M T, Duailibi S E, Young C S, Barlett J D, Vacanti I P, Yelick P C: Bioengineered teeth from cultured rat tooth bud cells. J Dent Res 2004, 83: 523-528. 6. Duailibi S E, Duailibi M T, Zhang W, Asrican R, Vacant I P, Yelick P: Bioengineered dental tissues grown in the rat jaw. J Dent Res 2008, 87: 745-750. 7. Fitzgerald M, Chiego D J Jr, Heys D R: Autoradiographic analysis of odontoblast replacement following pulp exposure in primate teeth. Arch Oral Biol 1990, 35, 9: 707-715. 8. Flores M G, Hasegawa M, Yamato M, Takagi R, Okano T, Ishikawa I: Cementumperiodontal ligament complex regeneration using the cell sheet technique. J Periodontal Res. 2008, 43, 3: 364-371. 9. Govindasamy V, Abdullah A N, Ronald V S, Musa S, Ab Aziz Z A, Zain R B, Totey S, Bhonde R R, Abu Kasim N H: Inherent differential propensity of dental pulp stem cells derived from human deciduous and permanent teeth. J Endod 2010, 36, 9: 1504-1515. 10. Graziano A, d Aquino R, Laino G, Papaccio G: Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev 2008, 4, 1: 21-26. 11. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey P G, Shi S: Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97, 25: 13625-13630. 12. Handa K, Saito M, Tsunoda A, Yamauchi M, Hattori S, Sato S, Toyoda M, Teranaka T, Narayanan A S: Progenitor cells from dental 690

2010, 63, 11 Komórki macierzyste tkanek zęba follicle are able to form cementum matrix in vivo. Connect Tissue Res 2002, 43: 406-408. 13. Hu B, Unda F, Bopp-Kuchler S, Jimenez L, Wang X J, Haïkel Y, Wang S L, Lesot H: Bone marrow cells can give rise to ameloblast-like cells. J Dent Res 2006, 85, 5: 416-421. 14. Huang G: Pulp and dentin tissue engineering and regeneration: current progress. Regen Med 2009, 4, 5: 697-707. 15. Huang G T, Sonoyama W, Liu Y, Liu H, Wang S, Shi S: The hidden treasure in apical papilla: the potential role in pulp/dentin regeneration and bioroot engineering. J Endod 2008, 34, 6: 645-651. 16. Huo N, Tang L, Yang Z, Qian H, Wang Y, Han C, Gu Z, Duan Y, Jin Y:Differentiation of dermal multipotent cells into odontogenic lineage induced by embryonic and neonatal tooth germ cell-conditioned medium. Stem Cells Dev 2010, 19, 1: 93-104. 17. Iohara K, Nakashima M, Ito M, Ishikawa M, Nakasima A, Akamine A: Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res 2004, 83: 590-595. 18. Iohara K, Zheng L, Ito M: Regeneration of dental pulp after pulpotomy by transplantation of CD31 /CD146 side population cells from a canine tooth. Regen Med 2009, 4: 377- -385. 19. Jones L: Stem cells: So what s in a niche? Current Biology 2001, 11: R484 R486. 20. Kim S H, Kim K H, Seo B M, Koo K T, Kim T I, Seol Y J, Ku Y, Rhyu I C, Chung C P, Lee Y M:Alveolar bone regeneration by transplantation of periodontal ligament stem cells and bone marrow stem cells in a canine peri-implant defect model: a pilot study. J Periodontol 2009, 80, 11: 1815-1823. 21. Kmieć Z: Histologia i cytofizjologia zęba i jamy ustnej. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2007, str. 7-34. 22. Laino G, Graziano A, d Aquino R, Pirozzi G, Lanza V, Valiante S, De Rosa A, Naro F, Vivarelli E, Papaccio G: An approachable human adult stem cell source for hard-tissue engineering. J Cell Physiol 2006, 206, 3: 693- -701. 23. Lee S Y, Chiang P C, Tsai Y H, Tsai S Y, Jeng J H, Kawata T, Huang H M: Effects of cryopreservation of intact teeth on the isolated dental pulp stem cells. J Endod 2010, 36, 8: 1336- -1340. 24. Li Z Y, Chen L, Liu L, Lin Y F, Li A W, Tian W D: Odontogenic potential of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. J Oral Maxillofac Surg 2007, 65: 494-500. 25. Luan X, Ito Y, Dangaria S, Diekwisch T G: Dental follicle progenitor cell heterogeneity in the developing mouse periodontium. Stem Cells Dev 2006, 15, 4: 595-608. 26. Morsczeck C, Gotz W, Schierholz J, Zeilhofer F, Kuhn U, Mohl C, Sippel C, Hoffmann KH: Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biol 2005, 24: 155-165. 27. Nakagawa E, Itoh T, Yoshie H, Satokata I: Odontogenic potential of post-natal oral mucosal epithelium. J Dent Res 2009, 88, 3: 219- -223. 28. Nakao K, Morita R, Saji Y, Ishida K, Tomita Y, Ogawa M, Saitoh M, Tomooka Y, Tsuji T: The development of a bioengineered organ germ method. Nat Methods, 2007, 4, 3:227-30. 29. Nesti C, Pardini C, Barachini S, D Alessandro D, Siciliano G, Murri L, Petrini M, Vaglini F: Human dental pulp stem cells protect mouse dopaminergic neurons against MPP(+) or rotenone. Brain Res 2010, 1, 7, 1367: 94-102. 30. Ohazama A, Modino S A, Miletich I, Sharpe P T: Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth. J Dent Res 2004, 837: 518-522. 31. Olender E, Kamiński A, Uhrynowska- Tyszkiewicz I, Wanyura H: Aspekty histologiczne i molekularne mechnizmy kontroli naturalnego zęba. Czas Stomat 2010, 63, 9: 543-550. 32. Park J Y, Jeon S H, Choung P H: Efficacy of periodontal stem cell transplantation in the treatment of advanced periodontitis. Cell 691

E. Olender i in. Czas. Stomatol., Transplant 2010 Aug 18 [publikacja elektroniczna, przed drukiem]. 33. Prescott R S, Alsanea R, Fayad M I: In vivo generation of dental pulp-like tissue by using dental pulp stem cells, a collagen scaffold, dentin matrix protein 1 after subcutaneous transplantation in mice. J Endod 2008, 34: 421-426. 34. Sakai V T, Zhang Z, Dong Z, Neiva K G, Machado M A, Shi S, Santos C F, Nör J E: SHED differentiate into functional odontoblasts and endothelium. J Dent Res 2010, 898: 791-796. 35. Seo B M, Miura M, Gronthos S, Bartold P M, Batouli S, Brahim J, Young M, Robey P G, Wang C Y, Shi S: Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet 2004, 364, 9429: 149-155. 36. Shi S, Gronthos S: Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J Bone Miner Res 2003, 184: 696-704. 37. Sloan A J, Perry H, Matthews J B, Smith A J: Transforming growth factor-beta isoform expression in mature human healthy and carious molar teeth. Histochem J 2000, 324: 247-252. 38. Sonoyama W, Liu Y, Fang D, Yamaza T, Seo B M, Zhang C, Liu H, Gronthos S, Wang C Y, Wang S, Shi S: Mesenchymal stem cell-mediated functional tooth regeneration in swine. PLoS One 2006, 20, 1:e79. 39. Wang B, Li L, Du S, Liu C, Lin X, Chen Y, Zhang Y:Induction of human keratinocytes into enamel-secreting ameloblasts. Dev Biol 2010, 344, 2: 795-799. 40. Wang J, Wang X, Sun Z, Wang X, Yang H, Shi S, Wang S: Stem cells from human-exfoliated deciduous teeth can differentiate into dopaminergic neuron-like cells. Stem Cells Dev 2010, 199: 1375-1383. 41. Woods E J, Perry B C, Hockema J J, Larson L, Zhou D, Goebel W S: Optimized cryopreservation method for human dental pulp-derived stem cells and their tissues of origin for banking and clinical use. Cryobiology 2009, 59, 2: 150-157. 42. Wu G, Deng Z H, Fan X J, Ma Z F, Sun Y J, Ma D D, Wu J J, Shi J N, Jin Y: Odontogenic potential of mesenchymal cells from hair follicle dermal papilla. Stem Cells Dev 2009, 18, 4: 583-589. 43. Yamada Y, Ito K, Nakamura S, Ueda M, Nagasaka T: Promising cell-based therapy for bone regeneration using stem cells from deciduous teeth, dental pulp, and bone marrow. Cell Transplant 2010 Nov 5 [publikacja elektroniczna, przed drukiem]. 44. Yen A, Sharpe P: Stem cells and tooth tissue engineering. Cell Tissue Res 2008 331: 359- -372. 45. Yu J, Shi J, Jin Y: Current approaches and challenges in making a bio-tooth. Tissue Eng Part B Rev 2008, 14, 3: 307-319. 46. Zhao M, Xiao G, Berry J E, Franceschi R T, Reddi A, Somerman M J: Bone morphogenetic protein 2 induces dental follicle cells to differentiate toward a cementoblast/osteoblast phenotype. J Bone Miner Res 2002, 17: 1441-1451. Adress: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5 Tel./Fax: 22 6217543 e-mail: ewa.olender@wum.edu.pl Paper received 5 July 2010 Accepted 12 January 2011 692