ROCZN. PZH, 2003, 54, NR 4, 393 398 ADAM KROGULSKI, TOMASZ PODSIADŁY OZNACZANIE OGÓLNEJ LICZBY GRZYBÓW W POWIETRZU ATMOSFERYCZNYM I WEWNĄTRZ POMIESZCZEŃ TOTAL CONCENTRATION OF FUNGI IN ATMOSPHERIC AND INDOOR AIR Zakład Higieny Komunalnej Państwowy Zakład Higieny 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24 Kierownik: dr J. Świątczak Polskie normy z 1989 r. dotyczące badania skażenia mikrobiologicznego powietrza atmosferycznego w dużym stopniu uległy dezaktualizacji. Polskich norm (PN) dotyczących badania zanieczyszczeń biologicznych w pomieszczeniach wewnętrznych brak. Utrudnia to lub uniemożliwia porównanie uzyskiwanych wyników między sobą i z normami zagranicznymi. WSTĘP W Polsce nie stosuje się ujednoliconych metod oceny mikrobiologicznego zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego i powietrza pomieszczeń. W efekcie w badaniach stosuje się różne pożywki i w różny sposób osadza się mikroorganizmy na/lub w pożywce (metoda płytek lanych). W praktyce utrudnia to lub wręcz uniemożliwia porównywanie uzyskiwanych wyników. Polskie Normy [3 6] dotyczące badania zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza atmosferycznego określają metodykę poboru próbek powietrza, skład podłóż, sposób odczytu wyników i ich interpretację z uwzględnieniem podziału na trzy klasy czystości. Brak jest Polskiej Normy dotyczącej powietrza wewnątrz pomieszczeń. Istnieją jedynie propozycje wymagań dla wybranych pomieszczeń opracowane przez Krzysztofika [cyt. za 1] oraz klasy czystości mikrobiologicznej powietrza wg polskich wytycznych projektowych [7], które odnoszą się do obiektów służby zdrowia. Mimo, że są one z reguły bardziej tolerancyjne niż normy państw zachodnich i USA, większość szpitali w kraju nie ma możliwości technicznych ich dotrzymania (badania własne niepublikowane). Wspomniane Polskie Normy, propozycje i wytyczne projektowe, pochodzą z okresu, gdy na polskim rynku nie było dostępnych aparatów zasysających powietrze (aspiratorów) i osadzających mikroorganizmy na podłożach metodą zderzeniową. Nie było również możliwości powszechnego stosowania gotowych podłóż stosowanych szeroko w krajach Europy Zachodniej i Ameryki Północnej. W efekcie większość wyników publikowanych w ostatnich latach w Polsce trudno porównać między sobą, lub z publikacjami zagranicznymi.
394 Nr 4 Zdarza się, że zmiana metodyki pobierania próbek, lub używanych podłóż uniemożliwia porównanie wyników kolejnych ekspertyz dotyczących tego samego źródła zanieczyszczeń mikrobiologicznych powietrza, lub potraktowanie ich jako badań wzajemnie się uzupełniających. W efekcie badania trzeba w całości wykonać od nowa. W niniejszej pracy uznano za celowe zbadanie jak duże różnice można uzyskać, w wyniku stosowania różnych metod poboru próbek i użycia różnych podłóż. MATERIAŁ I METODY Podłoża: 1) Sabouraud dextrose agar firmy Oxoid, o ph 5,6 ± 0,2 bez dodatku antybiotyków zalecane do izolacji grzybów w tym drożdży. 2) Malt extract agar firmy Oxoid o ph 5,4 ± 0,2 zalecane do wykrywania, izolacji i liczenia drożdży i pleśni. 3) Schaufus Pollinger (krążki bibułowe z suchym podłożem pady ) firmy Sartorius, zalecane dla drożdży i pleśni. Podłoże o wolniejszym w porównaniu do dwóch pierwszych powiększaniu się powierzchni rosnących koloni. Aparat do kontroli mikrobiologicznej powietrza Micro Bio (Air sampler MB 1 plus) firmy De Ville. Mikrobiologiczny próbnik powietrza MAS 100 (nowa wersja 2001 r.). Oba te aparaty pracują metodą zderzeniową. MB 1 osadza materiał na płytkach typu Rodac Ø 55 mm. MAS 100 na powszechnie używanych w mikrobiologii płytkach 90 mm. Oba aparaty posiadają głowice z otworami (dyszami). Powietrze przechodzące przez jeden otwór trafia w jeden osobny punkt na pożywce. Do korekcji wyniku zaniżonego w wyniku trafienia dwóch lub więcej cfu (jednostek tworzących kolonie) w jeden punkt wprowadza się poprawkę według wzoru Fellera. Płytki z osadzonymi grzybami i ich zarodnikami umieszczano w temperaturze 25 o C (płytki z podłożami agarowymi odwrócone przykrywką do dołu). Codziennie począwszy od 48 godz. płytki przeglądano i liczono rosnące kolonie. Liczenie przerywano wówczas, gdy w kolejnym dniu nie obserwowano przyrostu liczby kolonii. Badania porównawcze metodą zderzeniową i sedymentacyjną prowadzono w pokoju o wymiarach 3,7 5,0 i wysokości 4,1 m. Na godzinę przed rozpoczęciem pomiaru zamykano okno i drzwi (przewody wentylacji grawitacyjnej były zaklejone). W dwunastu punktach na wysokości ok. 1,3 m umieszczano obok siebie płytki z podłożami (Saboraud i Malt extract agar) Jednoczesna ekspozycja wszystkich płytek trwała 30 min. Bezpośrednio po jej zakończeniu na taką samą liczbę płytek pobierano zanieczyszczenia powietrza metodą zderzeniową (na zmianę na płytkę z jednym a następnie z drugim podłożem). Objętość powietrza dobrano w taki sposób, aby liczba wyrosłych na płytkach kolonii grzybów była podobna w metodzie sedymentacyjnej i zderzeniowej. W metodzie sedymentacyjnej liczbę cfu (jednostek tworzących kolonie) w 1 m 3 powietrza liczono korzystając z wzoru zamieszczonego w PN Z-4111/03 [5]. Oznaczana na różnych podłożach ogólna liczba grzybów może się znacznie różnić (Ryc. 1). Dla określenia różnicy w uzyskiwanych wynikach przy użyciu różnych aspiratorów zasysano nimi równocześnie tę samą objętość powietrza na to samo podłoże. Wyniki przedstawiono w tabeli II. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Uzyskane wyniki z zastosowaniem metod sedymentacyjnej i aspiracyjnej oraz podłóż Sabouraud i Malt extract agar przedstawiono w tabeli I. Liczba kolonii wyrosłych na podłożu Sabouraud przy użyciu metody sedymentacyjnej jest prawie dwukrotnie wyższa niż na podłożu Malt extract agar. Przy użyciu metody zderzeniowej wzrost liczby kolonii wyniósł 20%. Różnica wyników uzyskanych metodą sedymentacyjną na obu używanych podłożach jest istotna statystycznie. W zamkniętym pomieszczeniu cząsteczki pyłu w tym i zarodniki grzybów oraz ich komórki opadają. Powietrze staje się coraz czystsze. Mimo to w badaniu przeprowadzonym metodą aspi-
Nr 4 395 Oznaczanie ogólnej liczby grzybów w powietrzu Tabela I. Ogólna liczba grzybów. Porównanie wyników otrzymanych metodą sedymentacyjną (S) i zderzeniową (A) Total number of fungi. Comparison of results obtained with sedimentation (S) and respiratory (A) methods Sabouraud Cfu/m 3 Grzyby Malt extract agar S A S A 102,7 263,7 56,2 213,9 Objaśnienia: Każda wartość stanowi średnią z 12 pomiarów. Różnice między metodami są istotne statystycznie, między podłożami jedynie w metodzie sedymentacyjnej. racyjną, bezpośrednio po 30 minutowym badaniu metodą sedymentacyjną liczba koloni grzybów/m 3 była wielokrotnie wyższa. W sytuacji, gdy intensywnego ruchu powietrza nie można wyeliminować (wentylacja grawitacyjna o różnym natężeniu, wentylacja mechaniczna, lub pomiary w powietrzu zewnętrznym) badania metodą sedymentacyjną będą obarczone jeszcze większym błędem. W przypadku intensywnego ruchu powietrza wyniki obarczone najmniejszym błędem można uzyskać przy użyciu aspiratora z wbudowanym miernikiem objętości rzeczywiście przepływającego przez aparat powietrza (np. MAS 100). Biorąc pod uwagę uzyskane wyniki, równorzędne traktowanie danych uzyskiwanych obiema omawianymi metodami wydaje się reliktem z okresu, kiedy aspiratory były w kraju praktycznie niedostępne. W większości badań metoda sedymentacyjna musi być traktowana jako jakościowa. Pomimo, że do oznaczania ogólnej liczby grzybów stosuje się podłoża, na których rośnie wiele różnych ich gatunków nie można stworzyć podłoża na którym rosłyby wszystkie grzyby i na dodatek miałyby one podobny czas wzrostu. W efekcie stosując różne podłoża uzyskujemy różną liczbę kolonii. Na ryc. 1 przedstawiono ogólną liczbę grzybów w powietrzu atmosferycznym oznaczoną metodą zderzeniową. W poszczególnych pomiarach pobierano tą samą objętość powietrza na różne podłoża. Przedstawione wyniki są fragmentem serii pomiarów prowadzonych przez ponad rok. Zjawisko to nasila się w okresie od kwietnia do początku lipca (z pewnymi zmianami zależnymi od warunków meteorologicznych) kiedy obserwujemy gwałtowny wzrost liczebności grzybów i ich zarodników przy jednoczesnej bardzo wyraźnej dominacji jednej grupy taksonomicznej. Na przełomie kwietna i maja obserwujemy często bardzo szybki wzrost dominujących w tym czasie szczepów. W efekcie często zarastają one całą powierzchnię płytki nim zauważymy wzrost innych koloni. W badaniach własnych, nie publikowanych, stwierdzano w okresie wiosennym krótkotrwałe wzrosty ogólnej liczby grzybów w powietrzu atmosferycznym do wartości przekraczających co najmniej trzykrotnie maksymalne wartości z ryc. 1. Podobne krótkotrwałe zmiany stężeń w powietrzu zarodników pojedynczych gatunków grzybów zależne od warunków meteorologicznych były wielokrotnie obserwowane [2, 7]. Porównując przedstawione w tabeli II wyniki, uzyskane przy użyciu różnych aspiratorów: MAS 100 z płytkami o powierzchni ok. 63,5 cm 2 i MB 1 z płytkami o powierzchni
396 Nr 4 Ryc. 1. Ogólna liczba grzybów w powietrzu oznaczana metodą zderzeniową na trzech podłożach Total number of fungi in the air detected with respiratory method on three media ok. 23,4 cm 2 stwierdzamy, że przy zachowaniu pewnych warunków są one bardzo zbliżone. Chodzi tu przede wszystkim o utrzymanie liczby koloni na jednej szalce w zakresie 15 40. Górna granica w zależności od oddziaływań między koloniami może ulegać zmianom. W okresie dominacji jednego szczepu, gdy prawie wszystkie kolonie rosną z tą samą szybkością jej wartość może być znacznie wyższa. Oczywiście tak duża zbieżność jak w trzech pierwszych badaniach jest w dużej mierze kwestią przypadku. Jednak przy pomiarach w pomieszczeniach zamkniętych lub przy słabym wietrze w przypadku powietrza atmosferycznego wyniki nie będą się istotnie różnić. Zbyt duża liczba kolonii na płytce zawsze powoduje zaniżenie wyników. Zarówno Tabela II. Ogólna liczba grzybów Total number of fungi Numer badania Objętość (w litrach) MAS-100 Płytki 90 mm MB 1 Płytki 55 mm l. koloni cfu/m 3 l. koloni cfu/m 3 1 200 25,7 128,3 25,7 128,6 2 500 43,0 86,0 43,0 86,0 3 100 37,5 375,0 37,9 379,0 4 50 88,5 1770,0 31,6 631,3 5 100 136,9 1369,0 59,0 590,0 Objaśnienia: Każde badanie było wykonywane w tym samym pomieszczeniu równocześnie dwoma aspiratorami (MAS 100 i MB 1) na tym samym podłożu (Malt extract agar). Każda wartość podana w tabeli stanowi średnią z co najmniej siedmiu powtórzeń.
Nr 4 397 Oznaczanie ogólnej liczby grzybów w powietrzu w wyniku antagonistycznego działania między koloniami (zanikiem części z nich nim będą widoczne) jak i przez zrastanie się koloni, lub zasłanianie wolniej rosnących. Szalki zarastają jednolitą murawą nim niektóre z gatunków utworzą widoczne makroskopowo kolonie. Potwierdzeniem zaniżania wyników w przypadku zbyt gęstego wzrostu kolonii na płytce są wyniki badań 4 i 5. Na płytkach o ok. trzykrotnie większej powierzchni wyrasta ponad dwa razy więcej kolonii. W przypadku zbyt dużej liczby kolonii na szalce należy zdawać sobie sprawę z tego, że uzyskane wyniki mogą być zaniżone. Dlatego w przypadku równoległych badań z poborem różnych objętości powietrza do ostatecznej oceny trzeba wybrać płytki z liczbą koloni nie przekraczającą 40 przy średnicy 55 mm. Zaletą aparatu MB 1 jest niższa cena i niższe koszty eksploatacji. Natomiast wadą węższy zakres objętości powietrza, z którego można pobrać materiał do badań i uzyskać wiarygodne wyniki. WNIOSKI 1. Do badań ogólnej liczby grzybów w powietrzu należy używać metody zderzeniowej oraz równolegle dwu lub więcej podłóż powszechnie stosowanych na świecie. 2. W badaniach dotyczących jednego obiektu należy używać tych samych metod i podłóż, a najlepiej ujednolicić podstawowe wymagania dla danego typu badań. 3. Stosowanie aparatów wykorzystujących płytki o mniejszej średnicy (poniżej 90 mm) jest uzasadnione przy w badaniach rutynowych, gdy znany jest spodziewany poziom zanieczyszczeń mikrobiologicznych powietrza. TOTAL CONCENTRATION OF FUNGI IN ATMOSPHERIC AND INDOOR AIR Summary Methods of evaluation of microbiological air pollution are not standardized in Poland. As a result of this status miscellaneous media and various methods of sedimentation of microorganisms on/or these media are applied in the studies. Additionally plates of various diameters are used. In practice it makes difficult (or even impossible) comparison of results published studies and expert s reports. To illustrate the range of the problem in the presented paper are shown results of measurements of total number of fungi performed paralelly with: sedimentation and respiratory methods plates 55 mm and 90 mm diameter three various media Practical instructions concerned selection of measurements methods and interpretation of results are presented. PIŚMIENNICTWO 1. Charkowska A.: Czystość powietrza w pomieszczeniach szpitalnych wymagania i kontrola. Wyd. Instytutu Ogrzewnictwa i wentylacji PW, Warszawa 1996. 2. Katial R., Zhang Y., Jones R., Dyer.: Atmospheric mold spore counts in relation to meteorological parameters. Int J. Biometeorol. 1997. 44: 17 22. 3. PN-89/Z-04111/01. Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Postanowienia ogólne i zakres normy.
398 Nr 4 4. PN-89/Z-04111/02. Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby bakterii w powietrzu atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną. 5. PN-89/Z-04111/03. Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby grzybów mikroskopowych w powietrzu atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną. 6. PN-89/Z-04111/08, Ochrona czystości powietrza. Pobieranie próbek. Pobieranie próbek powietrza atmosferycznego (imisja) do badań mikrobiologicznych metodą aspiracyjną i sedymentacyjną. 7. Sabariego S., Guardia C., Alba F.: The effect of meteorological factors on the daily variation of airborne fungal spores in Granada (southern Spain). Int. J. Biometeorol. 2000, 44, 1 5. 8. Wytyczne projektowania szpitali ogólnych. Biuro Projektów Służby Zdrowia, Waszawa 1984. Otrzymano: 2002.12.17