Wykorzystanie bakterii kwasu mlekowego w technologiach fermentacyjnych

Wykorzystanie bakterii kwasu mlekowego w technologiach fermentacyjnych Charakterystyka bakterii kwasu mlekowego Bakterie kwasu mlekowego, zwane także bakteriami fermentacji mlekowej lub bakteriami mlekowymi (LAB lactic acid bateria), są zbiorczą grupą życiową wyróżnioną nie z uwagi na podobieństwo systematyczne, lecz fizjologiczno-biochemiczne. Systematyka bakterii kwasu mlekowego jest niejednorodna. Ogólnie przyjmuje się, że do grupy tej zaliczane są bakterie sekcji 12 ziarniaki gramdodatnie (Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus), bakterie sekcji 14 gramdodatnie pałeczki z rodzaju Lactobacillus oraz rodzaj Bifidobacterium należący do sekcji 15. Są względnymi beztlenowcami, chociaż rodzaj Bifidobacterium wykazuje wrażliwość na obecność tlenu w środowisku (są to bakterie katalazoujemne). Bakterie te nie wytwarzają przetrwalników, nie są urzęsione (brak zdolności do ruchu), nie występują w glebie, lecz na szczątkach roślin, w mleku oraz na błonach śluzowych przewodu pokarmowego zwierząt, a także w jamie ustnej, drogach oddechowych, moczowych i na skórze tworząc mikroflorę naturalną. Ich wspólną cechą biochemiczną jest zdolność do wytwarzania kwasu mlekowego w stężeniu do 3%. Najmniej spokrewnioną filogenetycznie z innymi grupą bakterii mlekowych są bifidobakterie wyizolowane po raz pierwszy już w 1899 roku z mikroflory jelitowej niemowląt. Początkowo zaliczono je do rodzaju Bacillus sp. (B. bifidus), aż po licznych zmianach uznane zostały w końcu jako oddzielny rodzaj Bifidobacterium sp. obejmujący 31 gatunków i kilka podgatunków. W przewodzie pokarmowym człowieka zidentyfikowano około 12 gatunków bifidobakterii (m.in. B. adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. longum). Bakterie te izolowane są także z jelit zwierząt, w tym także owadów (np. pszczół). Co ciekawe, ze względu na zdolność do przyswajania składników pokarmowych mleka matki, bifidobakterie stanowią jeden z pierwszych i najważniejszych rodzajów bakterii kolonizujących przewód pokarmowy niemowląt, stanowiąc do 95% całej mikroflory jelitowej. Z czasem ich udział ilościowy maleje i u osób dorosłych spada do około 5%. Bakterie mlekowe mają postać ziarniaków występujących często w charakterystycznych skupiskach o wyglądzie łańcuszków (Streptococcus, Lactococcus, Lecuonostoc, Oenococcus) lub tetrad (Pediococcus). Rodzaj Lactobacillus tworzą pałeczki o dość regularnym wyglądzie i wielkości 0,6-1 x 2-6 µm, natomiast Bifidobacterium mają wygląd walcowaty, często nieregularny i rozgałęziony w kształcie litery V lub Y w zależności od warunków środowiskowych i fazy wzrostu. Różnice pomiędzy poszczególnymi rodzajami i gatunkami wynikają najczęściej z różnej tolerancji na niskie ph, optimum temperaturowym (gatunki mezo- i termofilne), typem fermentacji cukrów oraz naturalnym środowiskiem bytowania. Gatunki mezofilne najlepiej wzrastają w temperaturach 20-28 C i produkują kwas mlekowy w stężeniu do 1,5%. Typowymi gatunkami mezofilnymi są Lactococcus lactis, 1

Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc sp. Do gatunków termofilnych (optimum wzrostu w granicach 40-45 C) zaliczane są np. Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii. Bakterie mlekowe nie są zdolne do wzrostu na podłożach minimalnych. Ich wymagania troficzne obejmują dodatek większości witamin i aminokwasów. Stąd typowymi składnikami pożywek są duże ilości wyciągu drożdżowego, sok pomidorowy, jak również odtłuszczone mleko w proszku. W odróżnieniu od większości bakterii potrafią natomiast wykorzystywać obecność laktozy w środowisku dzięki wytwarzaniu enzymu β galaktozydazy (podobnie jak bakterie z grupy Enterobacteriaceae). Ze względu na wytwarzanie dużych ilości kwasu mlekowego dodatkiem zapewniającym buforowanie kwaśnego odczynu środowiska jest zazwyczaj węglan wapnia. Typowe podłoża uniwersalne do hodowli tych bakterii to podłoże MRS oraz AOAC o podanym poniżej składzie: Podłoże MRS (De Man, Rogosa & Sharpe, 1960 r): Pepton kazeinowy Wyciąg mięsny Wyciąg drożdżowy Dekstroza K 2HPO 4 Tween 80 Cytrynian di-amonu Octan sodu MgSO 4 MnSO 4 Agar Woda 10 g 8 g 4 g 20 g 2 g 1 g 2 g 5 g 0,2 g 0,04 g 20,0 g do 1 litra Podłoże AOAC (American Association of Applied Chemistry): Peptonizowane mleko Wyciąg drożdżowy Dekstroza Sok pomidorowy KH 2PO 4 Tween 80 Agar Woda 15 g 5 g 10 g 100 ml 2 g 1 g 20 g do 1 litra Fermentacja mlekowa Wspólną cechą tych bakterii jest przeprowadzanie fermentacji mlekowej typu homo- lub heterofermentatywnego. W obu przypadkach bakterie mlekowe wytwarzają kwas mlekowy w wyniku przekształcania glukozy w szlaku glikolitycznym. W homofermentacji, przebiegającej wg szlaku EMP, z jednego mola glukozy powstają dwa mole pirogronianu ulegającego redukcji do kwasu mlekowego (pod wpływem dehydrogenazy mleczanowej). Kwas mlekowy jest więc głównym produktem 2

końcowym homofermentacji stanowi ponad 85%-90% metabolitów przy niewielkim udziale kwasu octowego i CO 2. Do gatunków homofermentatywnych zaliczamy np. Lactococcus lactis (ssp. lactis, ssp. cremoris), Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus plantarum (gatunek względnie heterofermentatywny). W przypadku heterofermentacji glukoza ulega glikolizie częściowo w szlaku HMP, a częściowo w szlaku EMP, w wyniku czego na każdy mol kwasu mlekowego powstaje dodatkowo 1 mol etanolu lub kwasu octowego oraz 1 mol dwutlenku węgla. Końcowym produktem heterofermentacji jest więc tylko w około 50% kwas mlekowy. Pozostałe metabolity stanowią głównie kwas octowy, etanol i CO 2. Ponadto, w trakcie fermentacji mlekowej u obu typów bakterii powstają śladowe ilości dodatkowych produktów ubocznych nadających charakterystyczne cechy organoleptyczne powstającym produktom fermentacji: diacetyl, acetoina, aldehyd octowy. Na przykład Streptococcus diacetilactis, pałeczka heterofermentatywna, wytwarza niewielkie ilości kwasu octowego, etanolu oraz diacetylu związek ten odpowiada za powstawanie świeżego zapachu masła. Specyficzny rodzaj heterofermentacji mlekowej przeprowadzają bifidobakterie jest to tak zwany szlak fosfoketolazowy. Ten odrębny szlak jest wynikiem obecności u bifidobakterii specyficznych enzymów zastępujących kluczowe enzymy odpowiedzialne za przeprowadzanie typowej fermentacji mlekowej. Sumaryczny schemat heterofermentacji typu Bifidobacterium przedstawia się następująco: 2 C 6H 12O 6 2 CH 3-CHOH-COOH + 3 CH 3COOH glukoza kwas mlekowy kwas octowy Otrzymywanie i zastosowanie kwasu mlekowego Do celów spożywczych i farmaceutycznych kwas mlekowy pozyskiwany jest na drodze biologicznej z hodowli czystych kultur bakterii fermentacji mlekowej przeprowadzających homofermentację. Maksymalne stężenia kwasu mlekowego powstającego w pożywce hodowlanej sięgają 0,6-3,0%. Stosowane podłoża zawierają dodatek węglanu wapnia, dzięki czemu powstający kwas mlekowy jest neutralizowany, a po zakończeniu fermentacji odzyskiwany z mleczanu wapnia za pomocą kwasu siarkowego. Roztwór kwasu mlekowego po oddzieleniu od gipsu poddawany jest oczyszczaniu i zagęszczeniu do 50% - jest to gotowa postać trafiająca na rynek. Wydajność praktyczna tego bioprocesu wynosi 80-90% wydajności teoretycznej. Podłoża przemysłowe zawierają jako główny składnik cukier spożywczy (sacharozę) lub melasę buraczaną oraz skiełkowany jęczmień (słód) będący stymulatorem wzrostu. W wyniku naturalnej fermentacji sacharozy powstaje właśnie kwas mlekowy. Skład typowych pożywek stosowanych do produkcji kwasu mlekowego przedstawiono poniżej: 3

Podłoże z sacharozą: Sacharoza 80 g Kiełki słodowe 20 g CaCO 3 100 g Woda drożdżowa 100 ml Bulion wzbogacony 1,5 g Woda do 1000 ml, ph=6,0-6,5 Podłoże z melasą: Melasa 16 Blg 800 ml Kiełki słodowe 20 g CaCO 3 100 g Woda drożdżowa 100 ml Bulion wzbogacony 1,5 g Woda destylowana do 1000 ml, ph=6,0-6,5 Naturalny kwas mlekowy służy jako środek zakwaszający, konserwujący (właściwości bakteriostatyczne i bakteriobójcze) oraz poprawiający walory smakowe. Właściwości bakteriostatyczne (przy ph=5,0-6,8) i bakteriobójcze (ph<5,0) kwasu mlekowego wykazano wobec takich patogenów, jak E. coli, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa i in. W przemyśle spożywczym stosowany jest do następujących celów: produkcja przetworów owocowych i warzywnych (ogórki konserwowe, dodatek do ogórków kiszonych, papryka konserwowa, pieczarki i warzywa marynowane, mizerie, sałatki warzywne, dżemy, marmolady); produkcja przetworów rybnych; produkcja napojów (poprawa smaku, uwydatnienie naturalnego aromatu owocowego, właściwości konserwujące stosowany jako zamiennik kwasu benzoesowego i askorbowego), piwowarstwo, winiarstwo; piekarnictwo (do korygowania kwasowości ciasta); mleczarstwo (do korygowania kwasowości mleka przy wyrobie serów, do zakwaszania śmietany); produkcja przetworów mięsnych. Ponadto, w rolnictwie kwas mlekowy używany jest w żywieniu trzody chlewnej, drobiu, w przygotowaniu kiszonek paszowych oraz w lecznictwie zwierząt (preparaty przeciwko biegunce prosiąt). Zastosowanie kwasu mlekowego do produkcji kiszonek paszowych powoduje szybkie obniżenie ph środowiska, a dzięki temu hamuje rozwój pleśni i innych szkodliwych mikroorganizmów gnilnych. Ogranicza to istotnie straty w produkcji kiszonek. Zalecane jest stosowanie co najmniej 2 kg 50% kwasu mlekowego na 10 ton zakiszanej masy. 4

Produkcja kiszonek spożywczych i paszowych Kiszenie warzyw i pasz służy do zakonserwowania produktu roślinnego. Polega to na pobudzeniu fermentacji mlekowej w kiszonej masie roślinnej. W procesie kiszenia powinna dominować fermentacja mlekowa. Powstający w jej wyniku kwas mlekowy w odpowiedniej ilości (stężeniu) staje się podstawowym czynnikiem konserwującym kiszonkę. Zwykle w procesie kiszenia wykorzystuje się naturalną mikroflorę roślinną zdominowaną przez bakterie mlekowe. Prawidłowe kiszenie ma więc za zadanie stworzenie optymalnych warunków do rozwoju tych bakterii. Uzyskuje się to poprzez odpowiednie przygotowanie materiału roślinnego rozdrobnienie (uzyskanie homogennej pod względem składu chemicznego masy roślinnej), dokładne ubicie masy (indukowanie warunków beztlenowych) oraz dostarczenie odpowiedniej ilości substratów do fermentacji mlekowej zwykle odpowiednia ilość cukru, ewentualnie także dodatek stymulatorów wzrostu bakterii (substancje azotowe rośliny o dużej zawartości białka lub serwatka). Konieczne jest zwłaszcza zapewnienie tzw. minimum cukrowego, które stanowi ilość cukru pozwalająca na szybkie wytworzenie kwasu mlekowego zapewniającego spadek ph środowiska do wartości około 4,2. Jest to odczyn skutecznie hamujący rozwój większości mikroorganizmów szkodliwych w procesie kiszenia żywności. W przypadku produktów trudno poddających się kiszeniu (np. ogórki) stosuje się dodatkowo solenie, które zabezpiecza materiał przed rozwojem szkodliwych drobnoustrojów, natomiast nie hamuje istotnie rozwoju bakterii mlekowych tolerujących dość wysokie zasolenie. Do mikroorganizmów szkodliwych mogących się pojawiać w nieprawidłowo przygotowywanych kiszonkach należą głównie: bakterie gnilne zarówno tlenowe, jak i beztlenowe (Pseudomonas, Bacillus, Serratia bakterie te powodują psucie się żywności dzięki właściwościom proteolitycznym), bakterie fermentacji masłowej (różne gatunki Clostridium), bakterie celulolityczne i pektynolityczne (wywołują mazistość poprzez naruszenie struktury tkanek rośłinnych), bakterie rzekomej fermentacji mlekowej (gł. E. coli i Aerobacter aerogenes produkują dwutlenek węgla oraz niepożądane produkty o charakterze kwasów organicznych). Ponadto mogą się rozwijać drożdże i pleśnie. Rozwój pleśni jest zawsze szkodliwy dla produktów kiszenia produkują substancje toksyczne, rozkładają tkanki roślinne (dzięki wytwarzaniu proteaz, pektynaz i celulaz), mogą wykorzystywać jako substraty pokarmowe kwasy organiczne powodując w ten sposób wtórny spadek kwasowości środowiska mogący prowadzić do rozwoju bakterii gnilnych. Natomiast obecność niewielkich ilości drożdży jest czynnikiem stabilizującym mikroflorę kiszonki, ponieważ produkują alkohol zaostrzający smak i działający jako dodatkowy konserwant oraz wytwarzają wiele witamin i substancji wzrostowych dla bakterii mlekowych. Problemem staje się nadmierny rozwój drożdży w kiszonce; wtedy drożdże stają się dominującym składnikiem mikroflory skutecznie konkurującym z bakteriami fermentacji mlekowej. 5

Do fermentowanych produktów roślinnych zaliczamy także zakwas buraczany (otrzymywany przez spontaniczną fermentację rozdrobnionych buraków czerwonych), sosy sojowe, herbaty czarne i czerwone, fermentowane liście winogron, fermentowane oliwki i inne. Fermentowane produkty mięsne Fermentacja jest również metodą konserwacji surowego mięsa stanowiącą alternatywę dla utrwalania mięsa za pomocą solenia, suszenia, bądź wędzenia. Naturalny proces fermentacji mięs rozwinął się w starożytnym Cesarstwie Rzymskim, jednak produkty takie otrzymywano także w Azji Wschodniej (Chiny), a także w Afryce Północnej. Obecnie fermentację wykorzystuje się do produkcji wędlin dojrzewających np. salami (produkowana od 250 lat), metka. W mięsie występuje zbyt mała ilość cukrów, aby efektywnie przebiegała fermentacja mlekowa. Z tego względu do rozpoczęcia procesu fermentacji konieczny jest dodatek cukrów prostych w ilości 0,4-0,8%. W wyniku fermentacji mlekowej następuje szybkie obniżenie ph w mięsie zapobiegające rozwojowi szkodliwych bakterii gnilnych rozkładających aminokwasy. Jako zaszczepy stosowane są obecnie czyste kultury bakterii mlekowych z rodzaju Lactobacillus sp. (głównie L. sakei, L. curvatus, L. plantarum), a także Pediococcus sp. (P. acidilactici, P. pentosaceus). Dodatkowo, na etapie dojrzewania, stosuje się zaszczepy zawierające czyste kultury drożdży (Debaromyces hansenii, Candida famata) i pleśni (głównie Penicillium sp.). Temperatura fermentacji jest dość niska - mieści się zazwyczaj w zakresie 15-26 C. W wyższych temperaturach oraz przy wysokiej wilgotności zachodzi niebezpieczeństwo rozwoju drobnoustrojów chorobotwórczych. Cały proces dojrzewania wędlin trwa od kilku dni do 8 tygodni. Właściwości organoleptyczne gotowych produktów fermentowanych są unikatowe i bardzo cenione. Ogólnie produkcja fermentowanych przetworów mięsnych jest dużo trudniejsza od innych technologii wykorzystujących bakterie mlekowe. Główną przeszkodą w ich rozwoju jest podatność mięsa na gnicie pomimo stosowanych zabezpieczeń, a także utrudniona penetracja bakterii mlekowych do wnętrza surowca. Naturalna mikroflora mleka i procesy metabiozy Głównymi mikroorganizmami tworzącymi naturalną mikroflorę mleka są bakterie fermentacji mlekowej i pseudomlekowej, bakterie gnilne oraz bakterie fermentacji masłowej. W trakcie przechowywania mleka zachodzi jego naturalne kwaśnienie oparte na fermentacji mlekowej. Zmiany jakościowe i ilościowe drobnoustrojów z poszczególnych grup w trakcie kwaszenia mleka mają charakter metabiozy, czyli typowej sukcesji ekologicznej. Polega ona na następczym rozwoju danych gatunków mikroflory po zakończeniu rozwoju innych mikroorganizmów. W pierwszym etapie kwaszenia zachodzi rozwój bakterii tzw. niewłaściwej fermentacji mlekowej. Powodują one 6

zakwaszenie środowiska, co ułatwia rozwój bakterii z gatunków przeprowadzających właściwą fermentację mlekową. Jako pierwsze rozwijają się bakterie z grupy paciorkowców (tolerujących stężenie kwasu mlekowego na poziomie nie przekraczającym 1% przede wszystkim Streptococcus lactis), a następnie pałeczki kwasu mlekowego bardziej oporne na wyższe stężenia kwasu mlekowego - typu Lactobacillus lactis. W końcu zaczynają się pojawiać bakterie fermentacji propionowej z rodzaju Propionibacterium, a wreszcie w szerokim zakresie temperatur Oidium lactis, a na samym końcu zaczynają dominować bakterie proteolityczne. Bakterie kwasu propionowego produkują w wyniku fermentacji laktozy i innych cukrów głównie kwas propionowy, a także inne składniki (np. kwas octowy) nadające charakterystyczny zapach i smak dojrzewającym serom oraz sprzyjają powstawaniu oczek. Po zakończeniu fermentacji mlekowej należy odciąć fermentowany produkt od dostępu powietrza z uwagi na możliwość rozwoju nadmiernych ilości drożdżaków oraz grzybów pleśniowych. Działalność tych drobnoustrojów prowadzi do spadku kwasowości środowiska, a konsekwencji ułatwia rozwój bakterii gnilnych. Jednym z końcowych etapów sukcesji w kwaśniejącym mleku są tzw. białe pleśnie z gatunku Oidium lactis (syn. Oospora lactis) należące do grzybów niedoskonałych. Grzyby te wykorzystują laktozę, jak i kwas mlekowy jako źródło węgla i energii, przez co stwarzają bezpośrednio warunki dla wzrostu bakterii proteolitycznych bezpośrednio prowadzących do psucia się mleka. Konserwacja i obróbka mleka Do produkcji mlecznych napojów fermentowanych oraz innych przetworów mlecznych (serów) stosowane jest obecnie wyłącznie mleko o odpowiednich parametrach fizykochemicznych oraz konserwowane dzięki procesowi pasteryzacji lub krótkotrwałej sterylizacji. Mleko służące do produkcji przetworów jest także zwykle poddawane homogenizacji lub zagęszczaniu. Stosowane są następujące typy mleka: 1. mleko pasteryzowane: jest to surowe mleko poddane działaniu wysokiej temperatury rzędu 100 C. Taka obróbka jest wystarczająca do wyeliminowania większości bakterii chorobotwórczych, a pozostawienia mikroflory ciepłoopornej przetrwalnikującej stanowiącej naturalną mikroflorę mleka. Są 3 rodzaje takiej obróbki: a. niska długotrwała: 20-40 min. w temp. 62-65 C (klasyczna pasteryzacja) stosowana do przygotowania mleka w produkcji serów. b. wysoka krótkotrwała: 15-45 s w temp. 70-75 C. c. wysoka momentalna: 2-5 s w temp. 85-90 C stosowana do produkcji mleka w proszku. 2. Mleko sterylizowane: jest to mleko poddawane działaniu temperatury 115-130 C przez kilka sekund. Tzw. mleko UHT to odmiana poddawana działaniu temp. 132 C przez 1-2 s. Mleko sterylizowane ma długi termin przydatności do spożycia, jest jałowe w znaczeniu 7

mikrobiologicznym, jednak zawartość witamin jest zmieniona w porównaniu z mlekiem pasteryzowanym. 3. Mleko homogenizowane: mleko powstające przez rozbicie kropelek tłuszczu do małych rozmiarów. Jest dzięki temu procesowi łatwiej trawione i przyswajane. 4. Mleko zagęszczone: powstaje z mleka pełnotłustego, poddawanego homogenizacji. Następnie wyznacza się dokładną zawartość tłuszczu i poddaje sterylizacji. Stanowi bogate źródło wapnia i fosforu. Produkowana jest także odmiana słodzona zawierająca 45% glukozy w tym przypadku nie jest konieczna sterylizacja ani pasteryzacja. 5. Śmietanka: jest to produkt wzbogacony w tłuszcz (9-36%) otrzymywany przez wirowanie. Zawiera dużo witaminy A oraz wapnia i fosforu. Produkcja fermentowanych napojów mlecznych Na świecie znanych jest około 400 napojów otrzymywanych na bazie fermentowanego mleka. Najpopularniejszymi fermentowanymi napojami mlecznymi są zsiadłe mleko, maślanka, jogurty oraz kefiry. Proces produkcji wszystkich tych napojów polega na przeprowadzeniu fermentacji mlekowej, czyli ukwaszeniu mleka za pomocą odpowiednich zaszczepów mleczarskich. W przypadku produkcji kefiru prowadzona jest fermentacja mlekowo-alkoholowa. Najprostszą technologię stanowi produkcja zsiadłego mleka i maślanki. Proces prowadzony jest w temperaturze ok. 25 C. W skład zaszczepów wchodzą głównie ziarniaki Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris oraz rzadziej Lactococcus lactis ssp. diacetilactis. Tradycyjne jogurty przygotowywane są natomiast z zaszczepów dwóch gatunków: Streptococcus thermophilus i Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (syn. L. bulgaricus). Oba szczepy tworzą w procesie otrzymywania jogurtu układ symbiotyczny ziarniaki wytwarzają niewielkie ilości kwasu mrówkowego i CO 2 (z obecnego w mleku mocznika) będące stymulatorami wzrostu pałeczek Lactobacillus; pałeczki z kolei dostarczają ziarniakom aminokwasy i peptydy powstałe w wyniku ich wysokiej aktywności proteolitycznej, której ziarniaki są pozbawione. Kwaszenie mleka w produkcji jogurtu trwa bardzo krótko 4-5 h z uwagi na wysoką temperaturę procesu (43 C). Do zagęszczania jogurtu stosuje się dodatek odtłuszczonego mleka w proszku lub białek mleka. Najnowsze tendencje w produkcji jogurtów to tzw. biojogurty czyli jogurty łagodne. Produkuje się w sposób tradycyjny, jednak szczepionki mają zmieniony skład mikroflory (zawierają dodatkowo m.in. Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium sp.). W efekcie uzyskuje się jogurty o delikatniejszym smaku, prawie pozbawione kwaskowości i charakterystycznego zapachu pochodzących od aldehydu octowego. W produkcji kefiru stosuje się najbardziej skomplikowane struktury zaszczepowe zwane grzybkami kefirowymi lub ziarnami kefirowymi. Grzybki kefirowe są strukturami symbiotycznymi, 8

w których skład wchodzi wiele gatunków bakterii (85% mikroflory) oraz grzybów z grupy drożdżaków (15% mikroflory). Najliczniejsze gatunki tworzące grzybki kefirowe stanowią: pałeczki: L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. delbrueckii, L. helveticus, L. kefiri, L. kefiranofaciens, L. plantarum. paciorkowce: Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides. drożdże: Candida kefyr, C. crusei, C. lambica, Cryptococcus humicolus, Debaromyces hansenii, Geotrichum candidum, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces unisporus, S. cerevisiae, S. exiguus, Zygosaccharomyces sp. Charakterystyczne walory smakowo-zapachowe kefiru są wynikiem mieszanej fermentacji mlekowo-alkoholowa zachodzącej w trakcie jego kiszenia. Kefir młody (słabo kwaśny) otrzymuje się w czasie 5-24 h fermentacji, kefir średni po 48 h, a kefir mocny, o największej kwasowości i lekko alkoholowym posmaku (do 0,8% alkoholu), po 72 h fermentacji. Produkcja prowadzona jest w temperaturze 20-23 C. Technologia produkcji kefiru pochodzi prawdopodobnie z krajów Środkowego Wschodu (tereny Iranu). Według tradycji arabskiej grzybki kefirowe to dar proroka Mahometa (ziarna Mahometa). Do grupy napojów o podobnej technologii produkcji opartej na mieszanej fermentacji mlekowoetanolowej zaliczane są także liczne produkty regionalne np. kumys (z krajów Kaukazu np. Azerbejdżanu), felisówka (Polska), huślanka (wschodnie Karpaty), skyr (Islandia). Produkcja twarogów Do twarogów zaliczane są twarogi i twarożki tradycyjne oraz twarożki homogenizowane i ziarniste. Twaróg jest ogólnie odwodnionym skrzepem (ziarnem) z pełnego lub odtłuszczonego mleka, powstającym poprzez koagulację kwasową, ewentualnie z niewielkim dodatkiem podpuszczki. Twarożki otrzymywane są poprzez zmielenie twarogów i odpowiednie doprawienie ich solą i innymi przyprawami. Twarogi i twarożki tradycyjne otrzymuje się wyłącznie poprzez ukwaszenie mleka, natomiast twarożki ziarniste i homogenizowane w wyniku koagulacji kwasowo-podpuszczkowej. W zaszczepach do produkcji twarogów stosowane są następujące gatunki: Lactococcus lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. diacetilactis. Produkcja serów i przemiany biochemiczne towarzyszące ich dojrzewaniu Pierwszym etapem produkcji sera jest wytworzenie w mleku skrzepu. Skrzep jest otrzymywany poprzez dodanie enzymu koagulującego główne białko mleka (kazeinę) podpuszczki. Kazeina mleka jest związana z tłuszczem, stąd w produkcji sera większość tłuszczu przechodzi do skrzepu, z którego 9

powstaje ser. Powstawanie skrzepu jest ułatwione w warunkach kwasowych. W celu obniżenia ph mleka przed dodaniem podpuszczki mleko zaszczepia się odpowiednią mieszaniną bakterii kwasu mlekowego. Łączne działanie podpuszczki i powstającego w wyniku fermentacji kwasu mlekowego powoduje destabilizację układu koloidalnego mleka micele kazeinowe zaczynają tworzyć strukturę żelu. W powstającym skrzepie (żelu) uwięziona zostaje większość tłuszczu oraz znaczna część soli mineralnych. Kultury zaszczepów serowarskich składają się zwykle z Lactococcus lactis ssp. lactis lub L. lactis ssp. cremoris. W przypadku serów wysokodogrzewanych stosowane są także mieszaniny Lactococcus i Lactobacillus (Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus casei). Do produkcji serów typu szwajcarskiego stosuje się także bakterie Streptococcus thermophilus oraz Propionibacterium shermanii. W produkcji serów maziowych dodawane są bakterie tlenowe Brevibacterium linens prowadzące proteolizę. Dalsze etapy produkcji sera polegają na obróbce skrzepu. Najpierw następuje jego oddzielenie od serwatki, czyli płynnej części powstającego produktu. Skrzep jest następnie podgrzewany w odpowiednich pojemnikach do temperatury ok. 38 C. Proces ten wpływa stabilizująco na powstałą strukturę żelową skrzepu. Powoduje także oddzielenie resztek serwatki. Kolejnym etapem jest dojrzewanie sera. Trwa ono od kilku tygodni do 6 miesięcy (krócej dojrzewają sery miękkie, dłużej sery twarde). Dojrzewanie odbywa się w specjalnych pomieszczeniach o wysokim nasyceniu powietrza parą wodną i umiarkowanej temperaturze. Etap dojrzewania decyduje o właściwościach organoleptycznych serów. W trakcie jego prowadzenia zachodzą następujące procesy biochemiczne: - fermentacja laktozy i mleczanów; - enzymatyczna degradacja białek mleka; - przemiany tłuszczów. Fermentacja mlekowa jest zasadniczym procesem przebiegającym od momentu zaszczepienia mleka kulturami starterowymi. Trwa również w czasie dojrzewania gęstwy serowej oraz w czasie formowania i prasowania sera. Już we wczesnym etapie fermentacji mlekowej mogą rozwijać się bakterie z grupy Coli-aerogenes (głównie Enterobacter aerogenes) przeprowadzające rzekomą fermentację mlekową, której wynikiem są niewielkie ilości dwutlenku węgla i wodoru (z rozkładu enzymatycznego kwasu mrówkowego) powodujące powstanie pierwszych oczek serowych. Ponadto powstają niewielkie ilości etanolu i butanodiolu. Naturalna konkurencja z bakteriami mlekowymi oraz solenie sera zapobiega nadmiernemu rozwojowi tych szkodliwych bakterii i niekorzystnym zmianom w masie serowej ( wzdęcie sera). Oczka powstają też w wyniku działalności bakterii mlekowych o charakterze heterofermentatywnym (np. Lactococcus lactis, syn. Streptococcus lactis) wytwarzających dwutlenek węgla i kwas octowy. W serach poddawanym silnemu gotowaniu (~55 C) mogą rozwijać się pałeczki termofilne Thermobacterium helveticum produkujące racemiczny 10

kwas mlekowy (w typowej fermentacji mlekowej powstaje enancjomer L). Powstający kwas mlekowy i jego sole stymulują rozwój bakterii propionowych (Propionibacterium sp.) wykorzystujących mleczany jako substrat w fermentacji prowadzącej do powstawania kwasu propionowego, octowego oraz dwutlenku węgla. Proces ten przebiega w niskiej temperaturze w czasie dojrzewania sera i jest zasadniczym procesem odpowiedzialnym za powstawanie oczek serowych. Powstawanie mocniejszych kwasów organicznych jest również przyczyną dalszego spadku ph masy serowej. W dojrzałych serach twardych utrzymują się niewielkie ilości kwasu mlekowego, natomiast w serach miękkich i pleśniowych kwas mlekowy jest niemal całkowicie metabolizowany (grzyby pleśniowe rozkładają kwas mlekowy do dwutlenku węgla i wody). Bakterie propionowe są także źródłem witaminy B12, stąd do produkcji serów często używa się wyselekcjonowanych szczepów tych bakterii (np. Propionibacterium shermanii). W serach typu cheddar brak oczek spowodowany jest intensywnym soleniem, które uniemożliwia prawidłowy rozwój bakterii propionowych. Własności organoleptyczne serów są wynikiem przede wszystkim zachodzących procesów metabolizowania białek sera. Zachodzi hydroliza białek powodująca powstawanie peptydów i dalej aminokwasów, ewentualnie także deaminacja aminokwasów. Procesy te nie są jednak typowymi procesami gnilnymi, gdyż zachodzą w środowisku kwaśnym, w odróżnieniu proteolizy gnilnej przebiegającej w środowiskach obojętnych lub alkalicznych. Pierwotnie rozkład białek, głównie kazeiny, zachodzi pod wpływem dodawanego w pierwszym etapie enzymu o aktywności podpuszczkowej. Obecnie zamiast podpuszczki tradycyjnie otrzymywanej z żołądków cieląt stosuje się enzymy uzyskiwane metodami mikrobiologicznymi (np. z grzybów Mucor miehei). Peptydy powstające w wyniku działania podpuszczki są substratami dla enzymów bakteryjnych. Początkowo proteoliza ma charakter umiarkowanie intensywny, ponieważ proteazy są wydzielane przez bakterie w celach typowo troficznych (pobieranie ze środowiska łatwo przyswajalnych peptydów). Po wyczerpaniu laktozy następuje obumieranie bakterii mlekowych prowadzące do uwolnienia z ich komórek znacznych ilości proteaz i lipaz powoduje to nasilenie procesów proteolitycznych i lipolitycznych. Gromadzenie się aminokwasów w masie serowej aktywuje dekarboksylazy rozkładające aminokwasy do amin, a rzadziej także deaminazy aminokwasów. Markerami procesów typowo gnilnych są aminy o bardzo ostrym, odrażającym zapachu putrescyna (produkt dekarboksylacji ornityny) i kadaweryna (powstająca z lizyny). Ich obecność dyskwalifikuje produkt. Często obecne w serach są natomiast inne aminy o charakterystycznych właściwościach organoleptycznych: tyramina (z tyrozyny), tryptamina (z tryptofanu), histamina (z histydyny). W następstwie deaminacji aminokwasów powstaje z kolei amoniak obecny w postaci soli amoniowych kwasów organicznych. Powstawanie amoniaku oraz siarkowodoru (z metabolizmu aminokwasów siarkowych) niekorzystnie wpływa na właściwości serów. W przypadku serów pleśniowych oraz miękkich typu maziowego w przemianach aminokwasów biorą także udział grzyby z grupy pleśni (gł. 11

Penicillium sp.) oraz drożdży. W serach typu roquefort dokonuje się nakłuwania zarodnikami Penicillium roqueforti równomiernie całej masy serowej. Przemiany tłuszczów w czasie dojrzewania serów mają na ogół bardzo ograniczony charakter w serach typu twardego. Natomiast w serach pleśniowych tłuszcze podlegają dość intensywnym przemianom zwłaszcza o charakterze hydrolitycznym i oksydacyjnym. Pierwszym etapem jest hydroliza tłuszczów pod wpływem lipaz pochodzenia pleśniowego prowadząca do uwolnienia kwasów tłuszczowych. W serach pleśniowych obecne są znaczne ilości kwasu octowego, propionowego, a także masłowego, kapronowego i kaprylowego. Kwasy tłuszczowe ulegają utlenieniu w szlaku β oksydacji prowadzącej do powstawania acetylo-coa wchodzącego w cykl Krebsa. Fermentacja propionowa Niektóre bakterie są zdolne do beztlenowego utleniania cukrów prostych w szlaku prowadzącym ostatecznie do kwasu propionowego oraz kwasu octowego i dwutlenku węgla. Bakterie te nazwano bakteriami propionowymi; niemal wszystkie dotychczas opisane gatunki zalicza się do rodzaju Propionibacterium sp. Najczęściej występujące gatunki to: P. freudenreichii (ssp. freudenreichii, ssp. shermanii oraz ssp.globosum), P. acidipropionici. Ich naturalnym siedliskiem jest układ pokarmowy bydła i owiec (przeżuwacze). Można je także wyizolować z mleka, natomiast nie stwierdzono ich występowania w glebie lub środowisku wodnym. Najprościej izolację bakterii propionowych można wykonać stosując jako materiał posiewowy ser typu ementaler. Bakterie propionowe są pałeczkami gramdodatnimi, nie wytwarzają przetrwalników i posiadają zdolności ruchu. Wzrost w warunkach laboratoryjnych przebiega w warunkach względnie lub bezwzględnie beztlenowych (hodowle w anaerostacie) na pożywkach zawierających wyciąg drożdżowy oraz kwas mlekowy. Temperatura optymalna mieście się w zakresie 30-37 C. Czyste szczepy bakterii propionowych wykorzystuje się do zaszczepiania serów dojrzewających typu szwajcarskiego zapewniając specyficzne oczkowanie oraz walory smakowo-zapachowe. Kwas mlekowy jest jednym z głównych substratów fermentacji propionowej. Duże ilości kwas mlekowego powstają w żwaczu bydła, stąd główna rola bakterii propionowych polega na jego metabolizowaniu, dzięki czemu nie dochodzi do nadmiernego zakwaszenia środowiska w tej części układu pokarmowego (w pierwszym etapie kwas mlekowy jest przekształcany ponownie do pirogronianu, który następnie podlega przekształceniom prowadzącym ostatecznie do produktów fermentacji propionowej). Ogólne równanie oraz szlak biochemiczny opisujące fermentację propionową (tzw. szlak metylomalonylo-coa) przedstawiono poniżej: 3 CH 3CH(OH)COOH 3 CH 3CH(O)COOH 2 CH 3CH 2COOH + CH 3COOH + CO 2 + H 2O 12

Fermentacja masłowo-butanolowa Beztlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Clostridum sp. przeprowadzają fermentację cukrów prowadzącą do powstania kwasu masłowego, butanolu, acetonu, izopropanolu oraz niewielkich ilości innych kwasów organicznych, alkoholi i gazów (dwutlenek węgla i wodór). Ogólnie szlaki biochemiczne tego typu określa się jako fermentację masłowo-butanolową, a główne produkty powstają, w zależności od gatunku oraz od warunków środowiskowych, w różnych ilościach. Klostridia są blisko spokrewnione z laseczkami z rodzaju Bacillus sp., jednak różnią się od nich przede wszystkim metabolizmem, który w ich przypadku jest oparty na fermentacji. Są zatem beztlenowe, zarówno względnie (np. C. acetobutylicum), jak i obligatoryjnie (np. C. pasteurianum). Wśród przedstawicieli tej grupy występują gatunki zdolne do fermentowania bardzo szerokiej gamy substratów (np. skrobi, celulozy, pektyn, białek, aminokwasów itp.), przy czym poszczególne gatunki mogą być wyspecjalizowane w kierunku ściśle określonego substratu, inne zaś fermentują różnorodne substraty. Stąd też bakterie te dzieli się ogólnie na sacharolityczne oraz peptolityczne. Również dominujące produkty fermentacji są różne. W zależności od przewagi danego typu produktu fermentacji wyróżnia się następujące grupy klostridiów: produkujące kwas masłowy (np. C. pasteurianum, C. pectinovorum, C. butyricum, C. tyrobutyricum); wykorzystują do fermentacji różne cukry proste i wielocukry, produktami fermentacji są oprócz kwasu masłowego także kwas octowy, dwutlenek węgla oraz wodór; 13

produkujące butanol (np. C. acetobutylicum, C. butylicum); fermentują cukry proste wytwarzając butanol, kwas octowy i masłowy oraz inne produkty; produkujące kwas propionowy (np. C. propionicum); fermentują aminokwasy (alanina i treonina) do kwasu propionowego, octowego i dwutlenku węgla; produkujące kwas kapronowy (np. C. kluyveri); wytwarzają kwas kapronowy i masłowy z etanolu, kwasu octowego i dwutlenku węgla; prowadzące fermentację białek i aminokwasów (reakcja Sticklanda) fermentują aminokwasy do kwasu octowego, mlekowego, wodoru i amoniaku (np. C. histolyticum, C. sporogenes, C. sticklandii, C. botulinum); prowadzące nietypowe szlaki fermentacyjne (np. C. aceticum). Zarys przemian biochemicznych prowadzących do powstania głównych produktów fermentacji masłowo-butanolowej Znaczenie praktyczne fermentacji masłowo-butanolowej jest obecnie niewielkie. W pierwszej połowie XX wieku opracowano metody otrzymywania butanolu i acetonu jako paliwa oraz rozpuszczalników organicznych (głównie z udziałem C. acetobutylicum). Była to jedna z pierwszych biotechnologii przemysłowych, obecnie jednak straciła znaczenie z uwagi na niewielką opłacalność. Nadal wykorzystuje się klostridia do pozyskiwania niewielkich ilości etanolu z fermentacji celulozy, a w przemyśle włókienniczym gatunki pektynolityczne są stosowane do rozluźniania struktury lnu. 14

Obecność klostridiów w przetworach spożywczych jest wysoce niepożądana. Do grupy tej zalicza się między innymi laseczkę jadu kiełbasianego (C. botulinum) wytwarzającą najsilniejszą znaną toksynę biologiczną jad kiełbasiany. Jest to neurotoksyna o wartości LD 50 wynoszącej zaledwie 1 ng na kilogram masy ciała. Przyczyną zatruć pokarmowych może być także C. difficile wywołująca rzekomobłoniaste zapalenie jelit będące skrajnym powikłaniem po antybiotykoterapii. Ponadto zarodniki klostridiów mogą rozwijać się w ranach zanieczyszczoną glebą. Intensywny wzrost bakterii tlenowych w zakażonej ranie stymuluje warunki beztlenowe korzystne dla kiełkowania endospor klostridiów zgorzeli gazowej (gł. C. perfringens, C. septicum) lub tężca (C. tetani). Szybki wzrost klostridów wynika między innymi z wytwarzania przez nie enzymów proteolitycznych. 15