Zasady diagnostyki mikologicznej. Grzybice układowe. Chemioterapia przeciwgrzybicza. mgr Katarzyna Piskorska Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawski Uniwersytet Medyczny
Grzyby Roślinopodobne Organizmy eukariotyczne Heterotroficzne Brak chlorofilu = brak fotosyntezy Jednokomórkowe, wielokomórkowe, dimorficzne Rozprzestrzeniają się poprzez zarodniki W metodzie Grama barwią się jak bakterie G + biology.clc.uc.edu http://www.mycology.adelaide.edu.au/
Występowanie wszystkie strefy klimatyczne Ziemi gleba, woda, powietrze organizmy zwierzęce i roślinne http://tyflomapy.pl/strefy_klimatyczne.html http://wrzutka.pl/tapety/p/973/smieszne-zwierzeta http://www.noupe.com/inspiration/photography/50-beautiful-examples-of-flower-photography.html http://www.national-geographic.pl/foto/fotografia/wycieczka-nad-morskie-oko-i-czarny-staw-317718
Morfologia grzybów jednokomórkowe drożdże i drożdżopodobne: Saccharomyces sp., Candida sp., Cryptococcus sp., Geotrichum sp. rosną w postaci charakterystycznych pojedynczych komórek (blastospory). W procesie pączkowania mogą tworzyć strukturę nazywaną pseudogrzybnią wielokomórkowe pleśniowe: Mucor sp., Rhizopus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., dermatofity twory wielokomórkowe zbudowane ze strzępek rurkowatych komórek, które najczęściej są rozgałęzione. Masy strzępek tworzą grzybnię. Grzybnia może rozpościerać się na znacznej powierzchni dorastając nawet do kilkunastu metrów
Cechy grzybów istotne w chorobotwórczości Zdolność wytwarzania zarodników warunkujących dużą rozsiewalność Termotolerancja Właściwości adhezyjne Właściwości alergizujące Wytwarzanie mykotoksyn (aflatoksyna) Zdolność wytwarzanie 2 różnych antygenowo form drożdżowej i strzępkowej
Systematyka grzybów Gromada: Mycota (Fungi) Klasa: Zygomycetes (Sprzężniaki) - Mucor spp., Absidia spp., Rhizopus spp. Klasa: Ascomycetes (Workowce) - Saccharomyces cerevisiae, Blastomyces spp., Histoplazma spp., Aspergillus spp., Penicillium spp. Klasa: Deuteromycetes - Fungi Imperfecti (Grzyby niedoskonałe) - Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Geotrichum spp., Fusarium spp., Trichophyton spp., Microsporum spp., Epidermophyton spp.
Systematyka grzybów chorobotwórczych Dermatofity grzyby skóry - Microsporum spp., Epidermophyton spp., Trichophyton spp. Drożdże i drożdżopodobne - C. albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Geotrichum spp., Rhodotorula spp., Cryptococcus neoformans Pleśnie - Mucor spp., Rhizopus spp., Absidia spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp. Grzyby wywołujące grzybice tropikalne - Histoplazma spp. Blastomyces spp. i inne
ZAKAŻENIA GRZYBICZE
Czynniki etiologiczne zakażeń grzybiczych 1. Grzyby drożdżopodobne: - C. albicans - C. tropicalis - C. parapsilosis - C. glabrata - C. krusei - C. lusitaniae 2. Grzyby pleśniowe z rodzajów: -Aspergillus: A. fumigatus, A. flavus, A. niger -Rhizopus sp. -Mucor sp. 3. Dermatofity
Grzyby drożdżopodobne z rodzaju Candida są składnikiem flory fizjologicznej Bytują na błonach śluzowych: - jamy ustnej - nosogardzieli - jelita grubego - pochwy Kolonizują również: skórę - okolice wilgotne okolice okołoodbytniczą fałdy skórne
Wszystkie grzyby z rodzaju Candida należą do patogenów oportunistycznych Czynnikiem sprzyjającym zakażeniu jest niewydolność lub niedobór w układzie immunologicznym Wywoływana przez nie grzybica- kandydoza jest zakażeniem endogennym Czynnikiem etiologicznym większości (ok 50%) wszystkich zakażeń grzybami Candida jest C. albicans pozostałe przez C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei i inne
Grzyby pleśniowe z rodzaju Aspergillus są czynnikiem etiologicznym aspergillozy Głównym gatunkiem istotnym klinicznie jest Aspergillus fumigatus- ok 90% wszystkich przypadków Pozostałe często izolowane z materiałów klinicznych: A. flavus, A. niger, A. nidulans, A. terreus. Ich rezerwuar stanowi powietrze gleba i rozkładające się części roślin Wrota zakażenia to drzewo oskrzelowe oraz uszkodzona skóra i błony śluzowe
Ryzyko zakażeń grzybiczych Choroby nowotworowe Biorcy narządów Urazy Zakażenie HIV Wcześniactwo Zabieg chirurgiczny Choroby krwi Cukrzyca Oparzenia Narkomania Antybiotykoterapia, kortykoterapia, chemioterapia, immunosupresja
Ryzyko zakażeń grzybiczych (czynniki sprzyjające) antybiotykoterapia kortykoterapia chemioterapia immunosupresja drenaż: naczyń pęcherza moczowego żywienie parenteralne dializa otrzewnowa protezy: naczyniowe zastawkowe kostne krtani
Patogeneza zakażeń grzybiczych 1. Uszkodzenie błony śluzowej (np. zabieg) 2. Przerost komórek Candida 3. Aktywacja czynników zjadliwości 4. Adherencja do komórek nabłonkowych 5. Penetracja do warstwy podśluzowej 6. Zahamowanie migracji leukocytów wielojądrzastych 7. Osłabienie aktywności dopełniacza i fagocytozy Zakażenie rozsiane (mikroropnie narządów) mózg serce nerki gałka oczna
Podział zakażeń grzybiczych Pierwotne Wywołane przez typowe patogeny, które mogą zakażać i rozwijać się w tkankach ludzi zdrowych: Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces spp. Wtórne Wywołane przez grzyby oportunistyczne: Candida spp., Aspergillus spp., Mucor spp.
Klasyfikacja zakażeń grzybiczych grzybice powierzchniowe 1. śluzówki 2. skóra 3. włosy 4. paznokcie jednoukładowe grzybice głębokie (układowe, narządowe) uogólnione wieloukładowe 1. kandydoza 2. aspergiloza 3. zygomykoza 4. coccidioidomykoza
Kandydoza skóry Obejmuje każdy obszar skóry o wzmożonej wilgotności Objawy kliniczne: rumień, pękanie lub maceracja skóry Czynniki etiologiczne : C.albicans C.glabrata Cryptococcus spp. Malassezia furfur http://www.mycology.adelaide.edu.au/gallery/yeast-like_fungi/candida09.gif
Kandydoza błon śluzowych a) jamy ustnej na błonach śluzowych policzków i języka pojawiają się białe, silnie przylegające naloty, podobne do pleśniawek ostra rzekomobłoniasta - (pleśniawki) u osób chorych na HIV, na białaczkę, po leczeniu sterydami z powodu np. astmy ostra zanikowa - po antybiotykoterapii ostra zanikowa związana z noszeniem protez przewlekła rozrostowa - zajmuje wewnętrzną powierzchnię policzków b) przełyku u chorych na AIDS, po chemioterapii c) pochwy - (80% C. albicans, 50% C. glabrata) w cukrzycy, ciąży, stosowanie tamponów, dopasowana bielizna, niedobory immunologiczne
Kandydoza jamy ustnej choroba o charakterze zapalnym, powierzchniowym Podczas rozwoju zakażenia komórki grzyba C. albicans najliczniej występującej na grzbiecie języka penetrują w głąb tkanek jamy ustnej Następuje zmiana formy komórek grzyba z blastospory na pseudostrzepkową Komórki C. albicans przylegają do komórek nabłonka jamy ustnej Wydzielane przez nie enzymy, glikoproteiny i metabolity hamują fagocytozę i odpowiedź ze strony układu immunologicznego
Zakażenia narządowe (1) - kandydoza układu pokarmowego - kandydoza płuc po aspiracji grzybów z jamy ustnej (głównie u noworodków) - kandydoza CUN (noworodki z małą wagą urodzeniową) - kandydoza wsierdzia, mięśnia sercowego i osierdzia rozwijająca się około 2 miesiące po zabiegu na otwartym sercu lub w następstwie obecności Candida we krwi (kandydemii)
Zakażenia narządowe (2) - kandydoza nerek (w zakażeniu rozsianym), dróg moczowych (po cewnikowaniu) - kandydoza szpiku, stawów, mięśni w następstwie kandydemii - kandydoza wątroby i śledziony, głównie u chorych z neutropenią - kandydoza wewnątrzmaciczna - zakażenie płodu drogą wstępującą drożdżakami kolonizującymi pochwę
Diagnostyka zakażeń grzybiczych Mikrobiologiczna hodowla mikroskopia bezpośrednia Molekularna wykrywanie DNA i RNA Serologiczna wykrywanie antygenów PCR mannan galaktomannan Obecność metabolitów D - arabinitol (Candida) D - mannitol (Aspergillus)
Schemat postępowania diagnostycznego podejrzenie o zakażenie grzybicze hodowla identyfikacja morfologiczna i biochemiczna badanie mikroskopowe badanie potwierdzające serologiczne wykrywanie antygenów i przeciwciał badanie wrażliwości na antymikotyki LECZENIE obserwacja i kontrola
Rodzaje materiałów do badań mikologicznych w zależności od obrazu klinicznego Obraz kliniczny, podejrzenie o zakażenie grzybicze Materiał diagnostyczny Posocznica, zapalenie wsierdzia, zakażenie gałki ocznej Infekcja ośrodkowego układu nerwowego Zakażenia układu pokarmowego - przełyk - wątroba, śledziona - żołądek - przewody żółciowe - jama otrzewnej Infekcje układu oddechowego Infekcje układu moczowego Schorzenia laryngologiczne krew mocz wymaz z jamy ustnej płyn mózgowo-rdzeniowy krew kał bioptat bioptat sok żołądkowy żółć wysięk otrzewnowy krew plwocina popłuczyny oskrzelowe aspirat z płuc wymazy z jamy ustnej mocz ropne wydzieliny wymazy z noso-gardzieli i z ucha
DIAGNOSTYKA DROŻDŻAKÓW (1) Posiew materiału klinicznego na podstawowe podłoże do izolacji i hodowli grzybów podłoże Sabourauda w celu izolacji szczepów Posiew izolatu grzyba na podłoże Sabourauda z dodatkiem antybiotyku (np. chloramfenikolu) hamującego wzrost bakterii Posiew izolatu na podłoże specjalne- podłoże chromogenne np. ChromAgar Candida, CandiSelect W zależności od produkowanych enzymów drobnoustroje rosnące na płytkach rozkładają substraty chromogenne, rosnące kolonie wybarwiają się na odpowiednie kolory
DIAGNOSTYKA DROŻDŻAKÓW (2) Identyfikację szczepów nie barwiących się specyficznie na podłożu chromogennym można przeprowadzić za pomocą: API Candida (ID 32C) System VITEK 2 Spektometria masowa System MALDI-TOF MS System VITEK MS
Cele nowoczesnej diagnostyki Skrócenie czasu identyfikacji patogenu Identyfikacja patogenu może trwać od 2 do 15 dni (grzyby drożdżopodobne) W przypadku dermatofitów do kilku tygodni Wyeliminowanie błędów w diagnostyce rutynowej Candida glabrata- różne kolory kolonii na podłożu chromogennym Wyniki fałszywie ujemne/dodatnie
Porównanie czasu analizy różnych metod identyfikacji grzybów Metoda Czas analizy Koszt Dokładność Hodowla 24-72 godziny lub do 10 Niski Średnia drobnoustroju dni API 20 C 24-72 godziny Niski Wysoka CHROMagar Candida 24-48 godzin Niski Średnia VITEK 2 ID-YST SYSTEM 15 godzin Wysoki wysoki Metody molekularne 4-5 godzin Wysoki Wysoka MALDI- TOF MS 20 minut Niski Wysoka Na podstawie: Neppelenbroek i wsp., 2014
Metody biologii molekularnej wykorzystywane diagnostyce mykologicznej PCR ze specyficznymi starterami Multiplex PCR Nested-PCR RT-PCR Real-Time PCR Sekwencjonowanie hybrydyzacja
Techniki oparte o metodę PCR Amplifikacja wybranych fragmentów genomu Ważne aby szukany fragment występował w wielu kopiach w genomie rrna grzybów występuje w 60-200 kopiach zawiera w swojej sekwencji: Konserwatywne regiony kodujące elementy strukturalne rybosomu: 18S, 5,8S, 26S Rozdzielające regiony niekodujące ITS (internal transcripted spacer) Międzygenowe regiony IGS (intergenic spacer region)
Fragmenty genomów wykorzystywane w molekularnej diagnostyce grzybiczej Mitochondrialne DNA: 16 rdna, cytochrom b, podjednostki dehydrogenazy NADH i oksydazy cytochromowej Pozostałe fragmenty: sekwencja kodująca białka szoku termicznego HSP 90 sekwencje kodujące dla aktyny, demetylazy lanosterolu C19 geny kodujące: syntazę chitynową, zasadową proteazę, enolazy
Izolacja materiału genetycznego grzybów Mała ilość komórek grzybiczych w materiale klinicznym Wydajność przeprowadzonej izolacji znacznie wpływa na wynik Izolacja znacznie trudniejsza niż w przypadku bakterii czy wirusów ze względu na konieczność rozbicia ściany komórkowej grzybów Ryzyko kontaminacji zarodnikami grzybów występującymi w powietrzu
Zalety stosowania metod biologii molekularnej w diagnostyce mykologicznej Identyfikacja bezpośrednio z materiału klinicznego Wysoka czułość i swoistość metod Możliwość wykrycia we wczesnym etapie choroby Krótki czas oczekiwania na wynik badania Szybsze wprowadzenie leczenia przeciwgrzybiczego
Wady metod biologii molekularnej w diagnostyce mykologicznej Otrzymywanie wyników zarówno fałszywie ujemnych jak i fałszywie dodatnich Trudności w interpretacji otrzymanych wyników Brak standaryzacji: Nie ujednolicona metoda izolacji oraz oczyszczania DNA Problemy ze znalezieniem specyficznych sekwencji docelowych w genomie Interpretacji wyników u osób z immunosupresją Mała dostępność metod Koszty Aparat Odczynniki Szkolenia personelu
Użycie metod biologii molekularnej w diagnostyce zakażeń grzybiczych nie zwalnia z hodowli drobnoustroju, co jest niezbędne w celu określenia jego lekowrażliwości!
Spektrometria masowatechnologia MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of- Flighing Mass Spectrometry)
MALDI-TOFF MS Analiza unikatowego, niepowtarzalnego profilu białkowego tzw. molekularny odcisk palca Bardzo krótki czas wykonania badania (około 5 minut) i uzyskania wyniku (40sek-2 min./próbkę) W przypadku grzybów przygotowanie próbki trwa około 20 min
Wykonanie badania 1 2 Czysta kultura drobnoustroju nanoszona na metalową płytkę Wstępna ekstrakcja białek komórkowych z użyciem etanolu i kwasu mrówkowego 3 4 Pokrycie próbki roztworem matrycy- krystalizacja Poddanie próbki pulsacyjnemu bombardowaniu promieniami lasera (240 strzałów lasera) 5 Identyfikacja drobnoustroju
Odczyt próbki w aparacie Absorpcja fotonów przez kryształki matrycy Białka drobnoustrojów zostają naładowane dodatnio przez protony matrycy Przemieszczanie się białek w kierunku elektrody Szybkość poruszania się tych jonów jest odwrotnie proporcjonalna do ich masy oraz ładunku Za elektrodą jony poruszają się przez region pozbawiony pola elektrostatycznego w kierunku detektora Różnice w masie oraz ładunku powodują różny czas dotarcia do detektora jonów tak zwany czas przelotu Rejestracja czasu przelotu, generowane jest widmo pików odpowiadające poszczególnym białkom i peptydom Analiza i porównanie otrzymanych widm z bazą danych
Poprawność identyfikacji drobnoustrojów w metodzie MALDI-TOF MS Wskaźnik punktowy mieszący się w przedziale od 0-3,000 Zakres Prawdopodobieństwo identyfikacji 2,300-3,000 Wysoce prawdopodobna identyfikacja do gatunku 2,000-2,299 Pewna identyfikacja do rodzaju, prawdopodobna do gatunku 1,700-1,999 Prawdopodobna identyfikacja do rodzaju 0,000-1,600 Identyfikacja niewiarygodna
Zalety technologii MALDI-TOF MS Prostota wykonania badania Niewielka ilość próbki potrzebna do wykonania analizy Obszerna baza widm wzorcowych (do 4200 gatunków drobnoustrojów) dla szczepów referencyjnych stale aktualizowana Nieskomplikowane oprogramowanie komputerowe Niskie koszty eksploatacji systemu analitycznego Możliwość wykorzystania technologii do typowania genetycznego
Wady technologii MALDI-TOF MS Wysokie koszty zakupu systemu analitycznego i jego serwisowania Wymaga wcześniejszej hodowli drobnoustroju- choć dostępne już są zestawy do identyfikacji bezpośrednio z materiału klinicznego np. MALDI Sepsityper Kit Problemy w przypadku mieszanej hodowli drobnoustroju
DIAGNOSTYKA GRZYBÓW PLEŚNIOWYCH (1) Preparat bezpośredni z materiału klinicznego (opiłków paznokci / łusek skórnych), w celu wykazania obecności strzępków grzyba, konidioforów, konidiów Izolacja przez hodowlę (makrohodowla) Obserwacja makrohodowli w celu oceny morfologii kolonii: barwa, kształt, powierzchnia, wzniesienie nad powierzchnię podłoża, brzeg, konsystencja, zapach, wytwarzanie barwników do podłoża: Aspergillus fumigatus kolonie filcowate, zielone Aspergillus flavus kolonie filcowate, żółte Aspergillus niger kolonie puszyste, czarne
DIAGNOSTYKA GRZYBÓW PLEŚNIOWYCH(2) Mikrohodowla szkiełkowa (hodowla prowadzona na szkiełkach podstawowych w komorach wilgotnych) Obserwacja mikrohodowli w celu oceny elementów morfotycznych grzybów pleśniowych pozwalających na identyfikację (konidiofory, konidia), jeśli nie uzyska się ich w preparacie bezpośrednim lub preparacie z makrohodowli Identyfikacja na podstawie preparatu mikroskopowego z hodowli / mikrohodowli: Rodzaj Aspergillus konidiofory w kształcie kropidła, Rodzaj Penicillum konidiofory w kształcie pędzelka
Lekowrażliwość E-test, mikrorozcieńczenia w podłożu płynnym Metoda referencyjna, ilościowa MIC minimalne stężenie leku hamujące wzrost drobnoustroju Grupy leków przeciwgrzybiczych http://www.mycology.adelaide.e du.au /gallery/yeastlike_fungi/candida35.gif Polieny Amfoterycyna B (Ambisome, Amphocil,Abelcet) Nystatyna Azole Ketokonazol, Flukonazol, Itrakonazol, Worikonazol Posakonazol Rawukonazol Analogi nukleozydów 5-fluorocytozyna Kandyny Kaspofungina Anidulafungina Mykafungina Wiążą się z ergosterolem błony komórkowej Blokują syntezę ergosterolu Blokują syntezę kwasów nukleinowych Blokują syntezę glukanu
Miejsca działania leków przeciwgrzybiczych ALLILOAMINY blokują syntezę ergosterolu w błonie komórkowej ANTYBIOTYKI POLIENOWE zaburzenia syntezy ergosterolu uszkodzenie integralności błony ucieczka składników komórkowych AZOLE blokują syntezę ergosterolu w błonie komórkowej ECHINOKANDYNY blokowanie syntezy ściany komórkowej - niestabilność osmotyczna - liza komórki grzyba FLUCYTOZYNA wychwytywana aktywnie przez permeazę blokuje syntezę DNA/RNA
Leki przeciwgrzybicze przedstawione w chronologicznej kolejności wprowadzania do leczenia Nystatyna Amfoterycyna B 5-Fluorocytozyna Itrakonazol Flukonazol Ketokonazol Mikonazol Ekonazol Mykafungina Anidulafungina Kaspofungina Vorikonazol 1956 1960 1964 1968 1972 1976 1980 1984 1988 1992 1996 2000 2004 2008
Preparaty amfoterycyny B 1. AmBisome - liposomalna postać AMB 2. Amphocil - koloidalna forma AMB 3. Abelcet - lipidowy kompleks AMB AMB wywiera toksyczny wpływ na czynność nerek konwencjonalna AMB jest przeciwwskazana z powodu upośledzonej czynności nerek zalecany u biorców po przeszczepie szpiku, wątroby, płuc i nerek
Echinokandyny: cykliczne związki lipopeptydowe o właściwościach przeciwgrzybiczych mechanizm działania: blokowanie biosyntezy ściany komórkowej grzyba przez zahamowanie syntazy 1, 3 D-glukanowej (enzym ten nie występuje u ssaków) działanie grzybobójcze zależne od stężenia leku szerokie spektrum przeciwgrzybicze z wyjątkiem Cryptococcus sp., Mucor sp. dostępna w terapii kaspofungina, anidulafungina, mykafungina brak możliwości podania miejscowego
Flukonazol Stosowany ogólnie w zakażeniach błon śluzowych i skóry a także uogólnionych zakażeniach wywołanych przez: Candida spp., Cryptococcus neoformans, Blastomyces spp., Histoplasma spp., Microsporum spp., Trichophyton spp. Stosowany w kandydozie błon śluzowych jamy ustnej, gardła, przełyku, dróg moczowych, skóry, w kandydozach układowych i kryptokokozie W profilaktyce zakażeń grzybiczych
Itrakonazol Szeroki zakres działania: Aspergillus spp., Candida spp., Cryptococcus spp., Malassezia furfur, Histoplasma spp., Blastomyces spp., Trichophyton spp., Epidermophyton spp. Stosowany głównie w grzybicy pochwy i sromu, w zakażeniach dermatofitami (paznokcie), w grzybicach układowych: aspergillozie, kandydozie, kryptokokowym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych
Vorikonazol aktywny wobec Candida sp., Aspergillus sp., Cryptococcus neoformans, Blastomyces dermatidis, Histoplasma capsulatum jest 10-100 krotnie bardziej aktywny wobec Candida sp. Niż flukonazol i 2-8 razy niż itrakonazol wykazuje aktywność wobec opornych szczepów Candida na flukonazol (C. krusei, C. glabrata) postać doustna i dożylna
Posaconazol Wykazuje aktywność wobec Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Zygomycetes spp., Histoplasma spp., Candida spp. Oporna na Flukonazol i/lub Itrakonazol Aspergillus fumigatus oporny na Itrakonazol, Vorikonazol i Amphoterycynę B Cryptococcus neoformans Stosowany u pacjentów po przeszczepach narządów i przyjmujących leki przeciwnowotworowe.
Serologiczna diagnostyka zakażeń grzybiczych surowica krwi rozpuszczalne w surowicy antygeny odczyn lateksowy ( Pastorex Candida, Pastorex Aspergillus odczyn immunoenzymatyczny do wykrywania antygenu mannanowego Candida sp. w surowicy pacjenta oraz test do wykrywania antygenu galaktomannanowego Aspergillus sp. w surowicy pacjenta -przeciwciała anty-candida mannan immunodyfuzja (odczyn precypitacyjny) -przeciwciała anty-candida germ tubes odczyn immunoenzymatyczny do wykrywania swoistych przeciwciał anty-mannan w surowicy pacjenta