Wprowadzenie do cytometrii przepływowej: co i jak mierzy cytometr

Fakultet: Cytometria zastosowanie w badaniach biologicznych Wprowadzenie do cytometrii przepływowej: co i jak mierzy cytometr Nadzieja Drela Zakład Immunologii WB UW ndrela@biol.uw.edu.pl

FLOW = fluid CYTO = cell METRY = measure

Czy są jakieś cechy wspólne? Blood cells Chromosomes Algae Protozoa beads

8 mm 12 mm 14 mm wielkość względna ziarnistość względna wewnętrzna organizacja

Co się dzieje, gdy na komórkę pada wiązka światła?

Pomiar światła rozproszonego do przodu (FSC) i na boki (SSC) Coherent lightsource (488 nm) Forward scatter Cell size (488 nm) Side scatter Granularity (488 nm) Forward scatter (FSC) measured along the axis of the incoming light proportional the the cell size / cell surface (only true for perfect round cells) Side scatter (SSC) measured in 90 direction to the excitation light proportional to cell complexity or granularity

Fluorescencja l=488 nm l=530 nm Excitation light Emission light The fluorochrome molecule absorbes the energy of the incoming light It releases the absorbed energy by: vibration and dissipated heat emission of a photon with a higher wavelength ( = less energetic)

Intensywność fluorescencji Number of Events FITC FITC FITC FITC FITC FITC 10 1 10 2 10 3 10 4 Relative fluorescence intensity

Automatyczny mikroskop Detector & Counter Waste Sample This primitive diagram shows the principle: Cells are passing the microscope objective, and an electronic circuit decides whether the cells is fluorescent or not. This is how a flow cytometer works!

Jak to jest mierzone? Elementy typowego cytometru przepływowego: Układ hydrauliczny (układ płynów) Źródła światła Układ optyczny Układ elektryczny (przetwarzanie sygnałów świetlnych na impulsy elektryczne (analogowe) System analizy danych

FACS Calibur FACS Verse FACS Aria

Cytometr schemat budowy

Cytometr schemat budowy Źródło światła Układ hydrauliczny Flow chamber Układ optyczny Komputer (zbieranie danych, analiza) Układ elektryczny

Źródła światła Blue laser (488 nm) Red laser (637 nm) Blue laser (488 nm) Red laser (635 nm) Yellow laser (561 nm) Violet laser (407 nm) Głównym źródłem światła są lasery emitujące światło monochromatyczne o dużym natężeniu. Światło laserowe charakteryzuje się ograniczonym spot size, co oznacza, że wiązka światła jest zogniskowana w małej objętości płynu, przez który przechodzi komórka. W efekcie, w wiążce światła znajduje się tylko jedna komórka. Najczęściej używane lasery są chłodzone powietrzem: Argonowy, blue laser 488 nm He-Ne 633 nm Moc laserów: 10-25 mw Laser diodowy, 488 nm, 200 mw (większa moc lasera zwiększa jego czułość. Lasery o dużej mocy używane są do analizy chromosomów i ich sortowania.

Układ hydrauliczny (flow chamber/ flow cell)

Ogniskowanie hydrodynamiczne

Ogniskowanie hydrodynamiczne Sample Sheath Sample Sheath Sample pressure low, small core stream. Good for DNA analysis High sample pressure, broader core stream. Bad for DNA analysis Laser Beams

Ogniskowanie hydrodynamiczne c.d. Prędkość przepływu komórek: Low - 240/sekundę Medium - 700/sekundę High 1200/sekundę

Układ optyczny

Filtry optyczne Absorbed Reflected Transmited

Typowy układ filtrów selekcjonujących światło o określonej długości fali Filtry/zwierciadła dichroiczne filtry optyczne do selektywnego przepuszczania światła w danym zakresie widma, a odbijania w każdym innym zakresie.

Filtry optyczne Longpass Shortpass Bandpass 460 500 540 460 500 540 460 500 540 LP 500 SP 500 BP500/50

Układ elektryczny: jak powstaje sygnał elektryczny przy pomocy fotopowielaczy 1. Laser t Voltage 2. Laser t Voltage 3. Laser t Voltage

Zadania układu elektronicznego Convert the optical signals into electronic signals (voltage pulses) Digitise the data Analyse Height (H), Width (W) and Area (A) of the pulse Send the data to the analysis computer

Voltage Pulse Height (H) Height, Area, and Width Pulse area(a) 0 40 Pulse Width (W) Time (µs)

Height PE Generowanie sygnału cyfrowego Digital data in memory Field Programmable Gate Arrays Digital Signal Processor Computer Area FITC

Przetwarzanie sygnału

Fluorescencja jeszcze raz l=488 nm l=530 nm Excitation light Emission light The fluorochrome molecule absorbes the energy of the incoming light It releases the absorbed energy by: vibration and dissipated heat emission of a photon with a higher wavelength ( = less energetic)

Wykorzystywanie fluorochromów

Wzbudzenie fluorescencji

Przesunięcie Stokesa

Fluorochromy pojedyncze i tandemowe Większość tandemowych wzbudzana przez 488 nm (cel: zwiększenie przesunięcia Stokesa)

Spektra emisji fuorescencji

Kompensacja ~700 ~700

Kompensacja Which marker for compensation? Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). Use bright markers to setup proper compensation.

Relative Intensity Kompensacja FITC 530/30 PE 585/42 APC 660/20 PerCP-Cy5.5 695/40 PE-Cy7 780/60 500nm 550nm 600nm 650nm 700nm 750nm 800nm Wavelength (nm)

Analiza danych Histogram Cytogram A - dot plot B - density plot C - contour plot

Jak wykorzystać informacje o rozproszeniu światła przez różne obiekty (komórki) Side scatter Granulocytes Monocytes Debris Lymphocytes Forward scatter

Skala liniowa vs logarytmiczna

Cytometria przepływowa Pomiar komórek zawieszonych w płynie Analiza wielu parametrów jednocześnie (analiza wieloparametrowa) Jedna komórka analizowana jest raz: analizowane są komórki w populacji w zawiesinie Pomiar światła rozproszonego i pomiar fluorescencji emitowanej przez fluorochromy Sortowanie komórek/chromosomów Duża szybkość pomiaru (do 10 tys. komórek/sek.) Wykrywanie śladowych populacji komórek

Dziękuję za uwagę