Obecność laktoferyny w kale jako wskaźnik zakażenia Clostridium difficile u dzieci

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 1-8 Obecność laktoferyny w kale jako wskaźnik zakażenia Clostridium difficile u dzieci Presence of lactoferrin in faeces as the indicator of Clostridium difficile in pediatric patients Sylwia Dąbrowska 1, Urszula Demkow 1,2, Edyta Podsiadły 1 1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Imunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego SPDSK, Warszawa 2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Imunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Warszawski Uniwersytet Medyczny Zakażenie Clostridium difficile (CDI) jest wciąż mało poznanym czynnikiem zachorowań w populacji pediatrycznej. Celem pracy była ocena przydatności badania podwyższonego poziomu laktoferyny w kale jako wskaźnika potwierdzającego zakażenie C. difficile. Zbadano 55 próbek kału, pochodzących od dzieci z klinicznymi objawami infekcji, w których wykryto toksynę A/B lub izolowano toksynotwórczy szczep C. difficile. Grupę kontrolną stanowiło 15 próbek kału, pobranych od dzieci, u których nie potwierdzono bakteriologicznym badaniem CDI oraz 7 próbek kału pobranych od zdrowych dzieci. Przeprowadzone badania wykazały u 45,5% (25/55) chorych z CDI podwyższony poziom laktoferyny a u 54,5% badanych osób z tej grupy ujemny wynik oznaczenia. W grupie kontrolnej laktoferynę w istotnym stężeniu stwierdzono u jednego dziecka, od którego wyhodowano szczep nietoksynotwórczy (1/15), natomiast oznaczenia wykonane we wszystkich próbkach kału pobranych od zdrowych osób dały wynik ujemny. Nie zaobserwowano różnic w częstości występowania podniesionego poziomu CRP u dzieci z CDI w stosunku do pacjentów bez zakażenia. Laktoferyna wydaje się obiecującym wskaźnikiem różnicującym między kolonizacją a zakażeniem CDI w populacji pediatrycznej. Słowa kluczowe: laktoferyna, Clostridium.difficile, dzieci ABSTRACT Introduction: Number of infection caused by Clostridium difficile in hospitalized children is increasing. Even though children unlike adults seldom develop complications after being

2 S. Dąbrowska, U. Demkow, E. Podsiadły Nr 1 ill, cases of persistent diarrhoea triggered by this pathogen and mortality from this origin have been reported. At present the important problem constitute differentiation between the colonization and infection limiting the proper diagnosis of C. difficile infections (CDI) in this age group. The aim of this study was to evaluate the presence of lactoferrin in faeces as the inflammatory marker confirming C. difficile infections in children. Methods: Seventy seven samples of faeces where examined. Among them in 55 toxin A/B or C. difficile toxinogenic strain and in 15 nontoxinogenic C. difficile had been detected, 7 were collected from healthy children. Stool samples were tested with the use of method routinely applied in laboratory: automatic VIDAS C. difficile Toxin A&B test (biomerieux, France), culture and GDH test. Lactoferrin in stool has been identified with ELISA IBD- -SCAN test (Techlab, Blacksburg, VA). The CRP protein was detected with VITROS 5600. Results: Among 55 children with CDI lactoferrin was detected in 45,5% (25/55) of them. In 30 (54,5%) CDI patients the inflammatory biomarker was not identified. In 15 persons with nontoxinogenic strain cultured, one child had lactoferrin present. CDI was detected most frequently (51%) in 6-11 years old children. The increase of CDI cases was observed in period 2013-2014. Neither differences in frequency of raised CRP level in examined groups of children nor correlation between presence of lactoferrin and CRP was observed. Conclusions: Lactoferrin an intestinal inflammatory biomarker may be a useful tool in distinguishing between C. difficile infection and colonization. More studies including clinical observations are needed. Key words: lactoferrin, Clostridium difficile, children Clostridium difficile jest jedną z najczęstszych przyczyn biegunek związanych z hospitalizacją osób dorosłych (7). Na zakażenia C. difficile (CDI ang. Clostridium difficile infection) szczególnie narażone są osoby > 65 roku życia, u których występują one 20-krotnie częściej, niż u osób poniżej 20 roku życia. Do niedawna przeważał pogląd, że u dzieci w wieku 5-14 lat zapadalność na te zakażenia jest bardzo niska (7). Ostatnie badania wskazują, że CDI jest istotnym czynnikiem zachorowań a nawet śmiertelności w populacji pediatrycznej (4,13,14). U dzieci w odróżnieniu od osób dorosłych rzadziej występują powikłania po przechorowaniu, jednak biegunka wywołana przez ten patogen może przechodzić w formę przewlekłą i stanowić problem w wyleczeniu. Jedną z cech CDI jest zapalenie śluzówki okrężnicy rozwijające się pod wpływem toksyn wydzielanych przez bakterie (3). Toksyny oddziałują na komórki nabłonka jelita grubego, powodując rozluźnienie silnych połączeń międzykomórkowych, co indukuje apoptozę i powoduje infiltrację oraz agregację neutrofili (3). Zarówno fekalna laktoferyna jak i fekalna kalprotektyna są wskaźnikami zwiększania translokacji granulocytów do śluzówki jelitowej (3,6). Z tego względu produkty wydzielane przez leukocyty w kale jak: cytokiny, laktoferyna, kalprotektyna są kandydatami na biomarkery zapalenia jelitowego. Laktoferyna należy do wielofunkcyjnych białek z grupy transferryn, jest produkowana przez granulocyty obojętnochłonne. Występuje w wydzielinach śluzowych: ślinie, w mleku matki (siara), łzach, nasieniu, drogach oddechowych, układzie pokarmowym oraz w granulocytach obojętnochłonnych, nerkach i w kale (1,2,12). Już w latach 90-tych ubiegłego wieku podkreślano możliwość wykorzystania oznaczania stężenia laktoferyny w kale do

Nr 1 Laktoferyna w kale jako wskaźnik zakażenia C. difficile 3 różnicowania między biegunką o etiologii bakteryjnej i wirusowej postulując wykorzystanie tego parametru w diagnostyce ostrych biegunek. Poziom laktoferyny w kale wzrasta w przypadku zakażenia patogenami wywołującymi biegunki o charakterze zapalnym jak: Shigella sp., EIEC, VTEC. Oznaczanie stężenia laktoferyny znalazło zastosowanie w diagnostyce nieswoistego zapalenia jelit oraz jako marker zapalenia występującego w obrębie jelit zarówno o infekcyjnym jak i nieinfekcyjnym podłożu. Zaobserwowano zależność poziomu laktoferyny od natężenia zmian w obrazie endoskopowym, im wyższy stopień nasilenia zmian w badaniu koloskopowym tym wyższe było jej stężenie w kale (1,2). Jednak według niektórych autorów, umiejscowienie zmian w jelitach nie znajduje odzwierciedlenia w poziomach tego białka w stolcach (1,2). Nosicielstwo C. difficile zarówno toksynotwórczymi jak i nietoksynotwórczymi szczepami jest wysokie, stwierdzono je u 3% zdrowych osób oraz 20-40% osób hospitalizowanych (7). Nie zawsze w wyniku kolonizacji dochodzi do rozwoju zakażenia. Istotnym ograniczeniem diagnostyki zakażeń C. difficile u dzieci jest brak wiarygodnych markerów, które umożliwiłyby zróżnicowanie pomiędzy kolonizacją a zakażeniem. Celem przeprowadzonego badania było sprawdzenie możliwości wykorzystania laktoferyny jako lokalnego markera zapalnego związanego z rozwojem CDI u dzieci. MATERIAŁ I METODY Próbki materiału klinicznego. Zbadano 55 próbek kału, w których wykryto toksynę A/B C. difficile lub wyhodowano toksynotwórczy szczep C. difficile. Próbki pochodziły od dzieci hospitalizowanych w Samodzielnym Publicznym Dziecięcym Szpitalu Klinicznym w Warszawie z objawami nieżytu żołądkowo-jelitowego i zostały przysłane do przyszpitalnej Pracowni Mikrobiologii na badanie w kierunku C. difficile. Próbki zbierano w okresie wrzesień 2013 - luty 2015 od dzieci do 18 roku życia. W przeprowadzonej pracy badano pierwszą otrzymaną próbkę kału. Grupę odniesienia stanowiły 22 próbki kału pobrane od: 7 dzieci bez objawów zakażenia pokarmowego i 15 próbek, w których stwierdzono obecność nietoksynotwórczego szczepu C. difficile. Jako zakażenie C. difficile uznawano przypadek nieżytu żołądkowo-jelitowego z pozytywnym testem na obecność toksyny A/B C. difficile w kale lub wyhodowanie toksynotwórczego szczepu C. difficile. Pierwsza próbka kału przysłana od chorego z podejrzeniem CDI, po wykonaniu badania w kierunku toksyny C. difficile była mrożona w temp. -80 C i przechowywana w tych warunkach do momentu oznaczenia laktoferyny. Wszystkie analizowane próbki kału wykorzystywane w badaniu były traktowane jako pozostałości po rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej. Oznaczanie obecności laktoferyny w kale. Poziom laktoferyny w kale oznaczano testem ELISA IBD-SCAN (Techlab, Blacksburg, VA) wg instrukcji producenta. W skrócie, 50 mg lub 50 ml kału rozcieńczano w rozcieńczalniku do próbek w stosunku 1:10, 1:100. Zawiesinę inkubowano na płytce opłaszczonej swoistymi przeciwciałami poliklonalnymi przeciwko laktoferynie. Powstałe kompleksy wykrywano przeciwciałami poliklonalnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową. Do wykreślenia krzywej kalibracyjnej zastosowano standardy laktoferyny w zakresie od 6,25 do 100 ng/ml korzystając z programu EXEL stosując analizę Trendu liniowego/typu regresji. Pomiar absorbancji wykonano na aparacie Fluorostar Omega (BMG LabTech, Niemcy). Zgodnie z instrukcją producenta za

4 S. Dąbrowska, U. Demkow, E. Podsiadły Nr 1 wartości prawidłowe uważano stężenie laktoferyny w zakresie 0-7,24μg/ml kału. Wszystkie próbki, w których wykryto stężenie laktoferyny 7,25μg/ml uważano za dodatnie. Oznaczanie obecności toksyny A/B C. difficile oraz wykrywanie C. difficile w próbkach kału. Jakościowe wykrywanie toksyny A/B C. difficile w próbkach stolca wykonano przy pomocy automatycznego testu VIDAS C. difficile Toxin A&B (biomerieux, Francja). W oznaczeniu wykorzystano technikę ELFA (enzymoimmunofluorescencji), w której mierzona fluorescencja była wprost proporcjonalna do ilości toksyny A/B. Za wynik ujemny przyjmowano wartość < 0,13; jako wynik wątpliwy - od 0,13 do 0,37, a jako wartość dodatnią powyżej 0,37. W próbkach ujemnych badano obecność dehydrogenazy glutaminianowej (GDH) za pomocą testu immunochromatograficznego Clostridium K-seT (CORIS BioConcept, Belgia). Próbki w których wykryto obecność GDH wysiewano na podłoże Clo (Biomerieux, Francja). Inkubację prowadzono w temp. 36 +/- 1 C warunkach beztlenowych przez 48 h. Kolonie fenotypowo przypominające te tworzone przez C. difficile (kształt, zapach) identyfikowano przy pomocy testów biochemicznych rapid ID 32 A (biomerieux, Francja). Dla każdego wyhodowanego szczepu C. difficile badano jego zdolność do wytwarzania toksyn metodą ELFA VIDAS C. difficile Toxin A&B (biomerieux, Francja). Wykrywanie obecności rotawirusów i adenowirusów w kale. U 37 dzieci ze stwierdzonym CDI wykonano oznaczenie w kierunku obecności rota-, adenowirusów testem imunochromatograficznym VIKIA Roto Adeno (biomerieux, Francja). Badania wykonano zgodnie z instrukcją producenta. Grudkę kału rozcieńczano w rozpuszczalniku i nanoszono na okienko testowe. Odczyt prowadzono po 10 minutach inkubacji. Wykrywanie białka CRP. Białko CRP wykonywano przy użyciu slajdów CRP VITROS oraz zestawu kalibracyjnego 7 do systemu biochemicznego VITROS na analizatorze VITROS 5600. Za wynik dodatni uznawano wartość > 0,5mg/dl. WYNIKI Spośród grupy badanych u 55 dzieci stwierdzono obecność toksyny lub szczepu toksynotwórczego C. difficile, a u 15 chorych wykryto kolonizację nietoksynotwórczym szczepem C. difficile (Tabela I). Tabela I. Obecność laktoferyny w kale dzieci chorych z nieżytem żołądkowo-jelitowym. Grupa badana Dzieci z obecną toksyną A/B C. difficile lub toksynotwórczym szczepem Dzieci skolonizowane szczepami nietoksynotwórczymi Dzieci bez objawów nieżytu żołądkowo-jelitowego Liczba badanych Liczba (odsetek) osób z obecną laktoferyną Laktoferyna Liczba (odsetek) osób bez laktoferyny Liczba osób z podwyższonym poziomem CRP 55 25 (45,5%) 30 (54,5%) 27 (49,1%) 15 1 (6,7%) 14 (93,3%) 8 (53,3 %) 7 0 7 (100%) nd

Nr 1 Laktoferyna w kale jako wskaźnik zakażenia C. difficile 5 Zakażenie CDI wykrywano najczęściej w grupie wiekowej 6-11 lat (27/53, 51%). U dzieci w wieku 2-5 lat toksynę A/B lub C. difficile wykryto u 28,3% badanych, natomiast u dzieci 12-18 letnich u 20,8% (Tabela II). Tabela II. Występowanie zakażeń C. difficile w zależności od wieku. Wiek (lata) Liczba dzieci z CDI 2-5 15 6-11 27 12-18 11 RAZEM 53 W wyniku retrospektywnej analizy przeprowadzonej na podstawie badań wykonanych w okresie 2013-2014 w SPDSK stwierdzono wzrost liczby CDI. W roku 2013 CDI stwierdzono u 10,8%, a w 2014 u 14,9% u hospitalizowanych dzieci (Tabela III). Tabela III. Odsetek potwierdzonych diagnostycznie pediatrycznych przypadków CDI w latach 2013-2014. Rok Liczba osób badanych w kierunku C. difficile Liczba dodatnich wyników Odsetek dodatnich wyników 2013 415 45 10,8% 2014 443 66 14,9% Razem 858 111 12,9% U 45,5% dzieci z laboratoryjnie potwierdzonym podejrzeniem CDI stwierdzono podwyższony poziom laktoferyny. U 54,5 dzieci z tej grupy nie wykryto tego białka. Częstość występowania laktoferyny w kale była wyższa w próbkach pochodzących od dzieci z CDI niż u dzieci skolonizowanych nietoksynotwórczymi szczepami tych bakterii (1/15) i dzieci zdrowych (0/7) (Tabela I). Nie zaobserwowano różnic w częstości występowania podniesionego poziomu CRP u dzieci z CDI w stosunku do dzieci skolonizowanych nietoksynotwórczymi szczepami C. difficile, odsetki osób z wynikiem dodatnim wynosiły odpowiednio 49% i 53% (Tabela I). U 11 dzieci z CDI nie doszło do wytworzenia żadnego z badanych markerów zapalenia: CRP i laktoferyny. U 12 dzieci stwierdzono zarówno podwyższony poziom laktoferyny jak i CRP. Natomiast u 25 badanych z CDI wskaźniki te nie korelowały (Tabela IV). Tabela IV. Korelacja między podwyższonym stężeniem CRP a obecnością laktoferyny w kale u 48 dzieci z CDI. Laktoferyna (+) CRP Laktoferyna (+) CRP n Laktoferyna (-) CRP Laktoferyna (-) CRP n Liczba 12 11 14 11 Odsetek 25 22,9 29,2 22,9 Laktoferyna (+) chorzy z poziomem laktoferyny w kale 7,25 µg/ml CRP n poziom CRP w granicach wartości normalnych CRP - podwyższone stężenie CRP

6 S. Dąbrowska, U. Demkow, E. Podsiadły Nr 1 Testy na obecność rotawirusów wykonano u 37 z 55 dzieci z CDI. U jednego z pacjentów stwierdzono jednoczesną koinfekcję rotawirusem a u 3 adenowirusem. U żadnego z badanych chorych nie znaleziono innego bakteryjnego czynnika wywołującego nieżyt żołądkowo-jelitowy. DYSKUSJA Obecność laktoferyny w kale stwierdzono u około 46% dzieci z potwierdzonym laboratoryjnie CDI. U 54% badanych z tej grupy nie wykazano w stolcu markera zapalnego. Prawdopodobnie obraz kliniczny zakażenia różnił się w obrębie tych dwóch grup (zbieranie tych danych klinicznych nie zostało objęte protokołem badania). El Feghaly i wsp. (5), którzy badali u dzieci z CDI obecność w kale takich markerów zapalnych jak: pp38, CXCL-5, Il-8 i laktoferyna, stwierdzili, że czynniki te występują tylko w stolcu pacjentów z objawowym CDI. Nie stwierdzano ich obecności u chorych skolonizowanych bez objawów chorobowych (5). Uzyskany w niniejszej pracy brak odpowiedzi zapalnej u dzieci którym zlecono wykonanie badania w tym kierunku najprawdopodobniej stanowi dowód na kolonizację. Dowiedziono, że przedłużonemu nosicielstwu C. dificile sprzyja długotrwała hospitalizacja i kontakt ze skontaminowanym środowiskiem szpitalnym (9,10). W przypadku prezentowanych badań był to bardzo silny czynnik ryzyka i dotyczył wszystkich badanych pacjentów. Udowodnienie prawdopodobnego braku zależności między obecnością C. difficile lub ich toksyn a podejrzeniem aktywnego zakażenia wymagałoby wykonania analizy na podstawie danych klinicznych dotyczących badanych chorych. Zjawisko wysokiego odsetka kolonizacji i przedłużonego nosicielstwa C. difficle zostało zaobserwowane również przez innych badaczy (6,10). Badania przeprowadzone metodą real-time PCR wykazały, że liczba bakterii, stwierdzona na postawie uzyskanego Ct, jest wyższa u dzieci bezobjawowo skolonizowanych, niż u dzieci z aktywnym zakażeniem. Obserwacja ta sugeruje, że choroba o tej etiologii jest niezależna od obecności bakterii C. difficile, ale od odpowiedzi gospodarza, w tym odpowiedzi zapalnej. W grupie dzieci z objawowym zakażeniem C. difficile obecność markerów zapalnych (pp38, IL-8, CXCL-5) korelowała z wystąpieniem niepowodzenia w leczeniu (przedłużoną biegunką) i dłuższym czasem utrzymywania się objawów (5). W prezentowanym badaniu różnica w częstości występowania laktoferyny u dzieci u których zlecono badanie w kierunku C. difficile a skolonizowanych toksynotwórczymi szczepami C. difficile i dziećmi bez nieżytu żołądkowo-jelitowego była istotna statystycznie. W badaniu Pai i wsp. (11) wykazano, że przebieg CDI u dzieci jest dużo łagodniejszy niż u dorosłych i w związku z tym często nie wymaga leczenia. Dlatego największym problemem w diagnostyce CDI w populacji pediatrycznej wydaje się nie tylko wykrycie zakażenia, ale również wykluczenie kolonizacji. Otwartą kwestią pozostaje wybór najodpowiedniejszego markera zapalnego. W ostatnio opublikowanych badaniach wykazano, że wśród kliku badanych lokalnych markerów obecnych w kale rozwój zakażenia C. difficile korelował z obecnością pp38, niestety jednocześnie stwierdzono bardzo niską czułość tego parametru. Jednocześnie w badaniach tych wykazano, że podniesiony poziom markerów zapalnych istotnie zwiększa prawdopodobieństwo przejścia zakażenia w formę przewlekłą (5).

Nr 1 Laktoferyna w kale jako wskaźnik zakażenia C. difficile 7 Mimo, że kałowe markery stanu zapalnego wydają się mieć większe znaczenie w zakażeniach C. difficile według niektórych autorów w celu potwierdzenia infekcji istotne jest również stwierdzenie obecności ogólnych markerów stanu zapalnego jak: CRP, leukocytów, prokalcytoniny (7). W naszym badaniu nie stwierdziliśmy zależności pomiędzy białkiem stanu zapalnego CRP, a występowaniem CDI. Nie stwierdzono również korelacji między jednoczesnym występowaniem podwyższonego poziomu białka CRP i laktoferyny. Niektórzy autorzy podają sprzeczne informacje na temat korelacji CRP z obecnością laktoferyny w kale. Roszak zaobserwowała wzrost stężenia laktoferyny wraz ze wzrostem stężenia CRP, natomiast Borkowska nie wykazała korelacji między tymi parametrami (1,12). W badaniach przeprowadzonych w USA w latach 2006-2011 roczny wskaźnik zapadalności na CDI wzrósł z 2,6 do 4 na 1000 hospitalizacji. Średnia wieku dzieci z CDI wynosiła 4 lata. Autorzy odnotowali również, w okresie badania, wzrost liczby CDI w grupie wiekowej 5-17 lat (8). Wśród dzieci objętych przedstawianymi badaniami najczęściej stwierdzano zakażenia w grupie wiekowej 6-11 lat. Zarysowała się też tendencja coraz częstszego występowania tych zakażeń u hospitalizowanych dzieci w kolejnych latach. PODSUMOWANIE Uzyskane wyniki sugerują, że należy z ostrożnością interpretować obecność toksyny A/B C. difficile w kale u dzieci, gdyż jej wykrycie może nie stanowić potwierdzenia laboratoryjnego klinicznego podejrzenia choroby. Nie w każdej sytuacji w przypadku obecności C. difficile w jelicie dochodzi do rozwoju procesu zapalnego. Wykazanie w postępowaniu diagnostycznym, że wykryte bakterie jedynie kolonizują jelito grube pozwoliłoby uniknąć niepotrzebnej antybiotykoterapii oraz możliwości postawienia niewłaściwego rozpoznania. U dzieci w każdym wieku ostateczne potwierdzenie CDI stanowi stwierdzenie zmian w badaniu endoskopowym. PIŚMIENNICTWO 1. Borkowska A, Liberek A, Plata-Nazar K i inni. Utility of fecal marker of inflammation in the diagnostics of inflammatory bowel diseases. Med Wieku Rozwoj 2010;14: 37-41. 2. Borkowska A. Laktoferyna w kale jako wykładnik aktywności procesu zapalnego w nieswoistych zapaleniach jelit u dzieci. Praca na stopień doktora nauk medycznych. Akademia Medyczna w Gdańsku, Gdańsk 2008. 3. Darkoh C, Turnwald BP, Koo HL i inni. Colonic immunopathogenesis of Clostridium difficile infections. Clin Vaccine Immunol 2014; 21: 509-17. 4. Dulęba K, Pawłowska M, Wietlicka-Piszcz M. Clostridium difficile infection in children hospitalized due to dirrhea. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2014; 33: 201-9. 5. El Feghaly RE, Stauber JL, Tarr PI i inni. Intestinal inflammatory biomarkers and outcome in pediatric Clostridium difficile infections. J Pediatr 2013; 163: 1697-1704. 6. Guerrant RL, Araujo V, Soares E i inni. Measurement of fecal lactoferrin as a marker of fecal leukocytes. J Clin Microbiol 1992; 30: 1238-42. 7. Hryniewicz W, Martirosian G, Ozorowski T. Zakażenia Clostridium difficile Diagnostyka, terapia, leczenie. Narodowy Program Ochrony Antybiotyków. Warszawa 2011. 8. Khanna S, Baddour LM, Huskins WC i inni. The epidemiology of Clostridium difficile infection in children: a population-based study. Clin Infec Dis 2013; 56: 1401-6.

8 S. Dąbrowska, U. Demkow, E. Podsiadły Nr 1 9. Kim J. Editorial commentary: Clostridium difficile in pediatric oncology patients: more questions than answers. Clin Infect Dis 2014; 59:404-405. 10. Na JY, Park JM, Kim YJ i inni. Clinical characteristic of symptomatic Clostridium difficile infection in children: conditions as infection risk and whether probiotics is effective. Pediatr Gastroenterol Hepatol Nut 2014;17:232-8. 11. Pai S, Aliyu SH, Enoch DA i inni. Five years experience of Clostridium difficile infection in children at a UK tertiary hospital: proposed criteria for diagnosis and management. PLOS ONE 2012;7:e51728. 12. Roszak A. Ocena diagnostyczno-prognostyczna wybranych markerów zapalnych, flory bakteryjnej i predyspozycji genetycznych w nieswoistych chorobach zapalnych jelit u dzieci. Praca na stopień doktora nauk medycznych. Uniwersytet Medyczny w Poznaniu, Poznań 2012. 13. Schutze GE, Willoughby RE. Clostridium difficile infection in infants and children. Pediatrics 2013;131:196-200. 14. Wultańska D, Banaszkiewicz A, Radzikowski A i inni. Clostridium difficile infection In Polish pediatric outpatients with inflamatory bowel disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010;29:1265-70. Otrzymano: 30 III 2015 r. Adres Autora: 00-576 Warszawa, ul. Marszałkowska 24, Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Imunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego SPDSK w Warszawie