RHAMM/CD168 może stanowić nowy cel dla immunoterapii pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową B-komórkową

PRACA POGLĄDOWA Acta Haematologica Polonica Review Article 2006, 37, Nr 3 str. 305 315 KRZYSZTOF GIANNOPOULOS 1,3, ANNA DMOSZYŃSKA 2, JACEK ROLIŃSKI 3, Li LI 1, IWONA HUS 2, JACEK TABARKIEWICZ 3, AGNIESZKA BOJARSKA-JUNAK 3, JOCHEN GREINER 1, MICHAEL SCHMITT 1 RHAMM/CD168 może stanowić nowy cel dla immunoterapii pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową B-komórkową RHAMM/CD168 might represent novel target for immunotherapy of patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) 1 Laboratorium Immunologii Nowotworów Uniwersytetu w Ulm, Niemcy Kierownik: Prof. Michael Schmitt 2 Klinika Hematoonkologii Akademii Medycznej w Lublinie Kierownik: Prof. dr hab. med. Anna Dmoszyńska 3 Zakład Immunologii Klinicznej AM w Lublinie Kierownik: Prof. dr hab. med. Jacek Roliński SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka limfocytowa B komórkowa (PBL-B) Antygeny związane z nowotworami/białaczkami (TAA, LAA) Limfocyty T cytotoksyczne (CTL) Receptor dla ruchliwości zależnej od kwasu hialuronowego (receptor for hyaluronic acid mediated motility) (RHAMM/CD168) KEY WORDS: B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) Tumor associated antigens (TAAs) Leukemia associated antigens (LAAs) Cytotoxic T lymphocytes (CTL) Receptor for hyaluronic acid mediated motility (RHAMM/CD168) STRESZCZENIE: Identyfikacja antygenów związanych z nowotworami/białaczkami (tumor associated antigens/leukemia associated antigens TAA/LAA) może otworzyć drogę dla swoistej immunoterapii pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową B komórkową (PBL-B). Przy użyciu metody łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RT-PCR) przeanalizowano ekspresję antygenu nowotworowego RHAMM/CD168, zidentyfikowanego wcześniej jako LAA przy użyciu metody serologicznej analizy ekspresji biblioteki genowej cdna (SEREX) u pacjentów z białaczkami szpikowymi. Porównano profil ekspresji genu RHAMM na komórkach jednojądrzastych wyizolowanych od 30 chorych z PBL-B oraz 20 zdrowych ochotników. Zaobserwowano ekspresję mrna dla RHAMM/CD168 u 75% pacjentów oraz brak ekspresji tego antygenu na komórkach zdrowych ochotników. Ze względu na ograniczoną ekspresję RHAMM-u w zdrowych tkankach (tylko w grasicy i jądrach) oraz wysoką częstość występowania, nawet u pacjentów we wczesnych stadiach PBL-B, oznaczono ilościowo poziom ekspresji RHAMM przy użyciu RT-PCR w czasie rzeczywistym oraz przeprowadzono testy czynnościowe. W hodowli mieszanej limfocytów z peptydem R3 (najbardziej immunogennym epitopem dla RHAMM) oceniono swoiste dla

50 K. GIANNOPOULOS i wsp. RHAMM limfocyty T cytotoksyczne (CTL) używając testu cytotoksyczności ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot). Biorąc pod uwagę otrzymane wyniki oraz wcześniejsze doniesienia o zwiększonej swoistej odpowiedzi cytotoksycznej przeciwko R3 u jednego z czterech HLA-A2 pozytywnych pacjentów z PBL-B poddanych immunoterapii przy użyciu komórek dendrytycznych stymulowanych lizatami uważamy, że RHAMM/CD168 może być interesującym antygenem dla przyszłej celowanej immunoterapii pacjentów z PBL-B. SUMMARY: Definition of appropriate target antigens might open new avenues to antigen targeted immunotherapies for patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL). In myeloid leukemias, we defined recently the receptor for hyaluronan mediated motility RHAMM/CD168 as an antigen eliciting both humoral and cellular immune responses. Here, we investigated 30 B-CLL patients versus 20 healthy volunteers (HV) for the expression of antigen RHAMM/CD168 on mrna level. Lack of RHAMM expression in HV was detected, which makes this particular antigen an interesting target for immunotherapy. The quantity of RHAMM/ CD168 expression was characterized by real time RT-PCR in 24 CLL patients and 5 healthy volunteers. Functional analyses (mixed lymphocyte peptide cultures followed by ELISPOT assays) were performed to evaluate the immunogenicity of RHAMM/CD168. We found RHAMM/ CD168 expression significantly (p<0.0001) higher in CLL patients than in HV. Specific CD8+ cytotoxic T-cell (CTL) responses against RHAMM/CD168 could be detected in vitro, by specific interferon gamma secretion when CTLs encounter RHAMM-derived peptide as target structure. Recently, we have described enhanced CTL against RHAMM/CD168 observed in one of four HLA-A2 positive CLL patients treated with DC vaccine. Therefore, the antigen RHAMM/CD168 might represent an interesting potential target for immunotherapies in patients with B-CLL. WPROWADZENIE Przewlekła białaczką limfocytowa B-komórkowa jest najczęściej występującą białaczką w państwach Europy Zachodniej oraz w Stanach Zjednoczonych (1). Jest chorobą mającą heterogenny przebieg ze średnim czasem przeżycia od 7 lat w przypadkach źle rokujących, do średnio 15 lat w przypadkach o łagodnym przebiegu. Wyodrębniono szereg czynników prognostycznych między innymi.: trisomia chromosomu 12, delecja 13q, delecja 11q, delecja 17p, mutacje zmiennej części łańcucha ciężkiego IgVH, ekspresja białka ZAP-70, ekspresja CD38, ekspresja HLA-G (2). Największą wartość prognostyczną wydają się mieć mutacje zmiennej części łańcucha ciężkiego IgVH oraz delecja 17p (2, 3). Ze względu na zaawansowany wiek pacjentów, chemioterapia jest często źle tolerowana, dlatego istnieje konieczność zastosowania innych strategii terapeutycznych. Układ odpornościowy może rozpoznawać i eliminować komórki nowotworowe, jednak ta odpowiedź jest nieskuteczna, co jest jednym z czynników patogenezy większości chorób nowotworowych. Metodą, która może zwiększyć szansę pacjentów na pokonanie choroby i uzyskanie długotrwałych remisji, wydaje się być immunoterapia mająca na celu przywrócenie lub wzmocnienie mechanizmów obrony przeciwnowotworowej organizmu. Ostatnio opisane zostały wyniki pierwszych prób klinicznych z czynną immunoterapią przy użyciu komórek dendrytycznych stymulowanych mieszanką antygenów nowotworowych obecnych w lizatach komórek białaczkowych. Bardziej specy-

RHAMM/CD168 nowy cel dla immunoterapii 51 ficzną formą immunoterapii wydaje się być terapia celowana na komórki nowotworowe, które różnią się fenotypowo od komórek zdrowych. Rozpoznawanie komórek nowotworowych przez komórki układu odpornościowego jest możliwe dzięki obecności na ich powierzchni określonych antygenów, tzw. antygenów związanych z nowotworem (tumor associated antigens, TAA). Antygeny takie zidentyfikowano również na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej B-komórkowej (fibromodulina (4), OFAiLRP (5), survivin (6)). Turley i wsp. opisali występowanie ekspresji RHAMM na poziomie mrna u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B-komórkową (7). Antygen RHAMM został również zidentyfikowany przez grupę badaczy z Ulm jako antygen towarzyszący białaczkom (leukemia associated antigen LAA) (8). Ostatnio zidentyfikowano immunogenne epitopy dla antygenu RHAMM/CD168 indukujące odpowiedz cytotoksyczna u chorych na ostrą i przewlekłą białaczkę szpikową (8,9). W tej pracy skupiliśmy się na określeniu ekspresji antygenu RHAMM/CD168 u chorych na PBL-B. Ze względu na ekspresję ograniczoną do komórek nowotworowych oraz częste występowanie antygenu RHAMM u pacjentów z PBL-B staraliśmy się scharakteryzować antygen RHAMM jako potencjalny cel dla immunoterapii chorych z PBL-B. W celu oceny immunogenności antygenu RHAMM wykonano mieszaną hodowlę limfocytów z peptydem R3, będącym najbardziej immunogennym epitopem MHC I u chorych na ostrą białaczkę szpikową (9). Chcieliśmy sprawdzić czy możliwa jest indukcja swoistej odpowiedzi immunologicznej na antygen RHAMM u chorych na PBL-B, co mogłoby uczynić antygen RHAMM interesującym celem dla immunoterapii PBL-B. MATERIAŁ I METODY Badaniem została objęta grupa 30 chorych z de novo rozpoznaną, wcześniej nieleczoną przewlekłą białaczką limfocytową B-komórkową (23 pacjentów we wczesnych stadiach choroby 0-2 w klasyfikacji wg. Rai oraz 7 w zaawansowanych stadiach choroby 3 i 4 wg. klasyfikacji Rai). Grupę kontrolną przy ocenie częstości występowania antygenu RHAMM stanowiło 20 zdrowych osób, w podobnym do grupy badanej przedziale wiekowym. Krew pobierana była z żyły odłokciowej pacjenta w ilości 15 ml. Izolacja komórek jednojądrzastych Krew obwodowa pobrana od pacjenta lub zdrowego ochotnika była wirowana przez 20 minut przy prędkości 1500g w gradiencie gęstości (Gradisol L) w celu wyizolowania komórek jednojądrzastych (KJ). KJ po dwukrotnym przepłukaniu PBS (bez Ca i Mg) zostały policzone w kamerze Neubauera. Żywotność była oceniona przy użyciu testu barwienia błękitem trypanu.

52 K. GIANNOPOULOS i wsp. Izolacja mrna, reakcja odwrotnej transkrypcji oraz reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RT-PCR) mrna zostało wyizolowane przy użyciu kolumn magnetycznych µmacs mrna Isolation Kit (Miltenyi Biotec), zgodnie z zaleceniami producenta. W grupie kontrolnej dodatkowo do oceny ilościowej przed izolacją mrna, wyizolowano komórki CD19+ przy użyciu kolumn magnetycznych MACS (Miltenyi Biotec), zgodnie z zaleceniami producenta. Jakość i ilość otrzymanego RNA została obliczona fotometrycznie. 50ng mrna zostało odwrotnie przepisane przy użyciu 1st Strand cdna Synthesis Kit for RT-PCR (Roche) zgodnie z zaleceniami producenta w 20 µl cdna. Do każdej reakcji PCR użyto 1µl cdna. Przy użyciu RT-PCR została oceniona ekspresja antygenu RHAMM/CD168 u chorych na PBL-B oraz u zdrowych ochotników reprezentujących grupę kontrolną. Następnie ilość antygenu RHAMM została określona ilościowo przy użyciu RT-PCR w czasie rzeczywistym ( real time RT-PCR). Ilość produktu została przeliczona na kopie transkryptu RHAMM na 10mln komórek, a następnie znormalizowana względem antygenu o stałej ekspresji, białka wiążącego ramkę- -TATA (TATA binding protein TBP). Szczegółową metodykę opisano wcześniej (9). Mieszana hodowla limfocytów z peptydem oraz test swoistego wydzielania interferonu gamma (IFN-γ) ELISPOT W celu oceny immunogenności nowo zidentyfikowanych antygenów użyta była metoda mieszanej hodowli limfocytów z syntetycznym peptydem odpowiadającym antygenowi (MLPC mixed lymphocyte peptide culture) oraz ocena wytwarzania interferonu gamma w odpowiedzi na antygen przy użyciu wysoce specyficznego testu ELI- SPOT, szczegółową metodykę opisano wcześniej (9). W skrócie, KJ były inkubowane z przeciwciałami anty-cd8 połączonymi z cząsteczką (beadsem) magnetyczną i następnie separowane w polu magnetycznym, zgodnie z zaleceniami producenta MACS Magnetic Isolation (Miltenyi Biotec). Populacja CD8-, reprezentująca w naszym systemie głównie komórki prezentujące antygen była naświetlana (30Gy) oraz stymulowana odpowiednio peptydem: dla RHAMM/CD168 peptydem R3 (ILSLELMKL), peptydem macierzy grypy (influenza matrix protein IMP, GILGFVFTL) jako pozytywna kontrola związana z rozpoznaniem antygenów grypy oraz bez peptydu, jako kontrola negatywna. Po dwóch cyklach stymulacji (16 dni), w medium zawierającym 10 U/ml IL-2 (human Interleukin-2, Sigma-Aldrich) i 20 ng/ml IL-7 (recombinant, human Interleukin-7, Strathmann Biotec AG), oceniane było wydzielanie interferonu gamma (INFγ) przez stymulowane komórki CD8+ przy kontakcie z antygenem przy użyciu testu ELISPOT. W skrócie, po całonocnej inkubacji membrany wiążącej białka 96-dołkowej płytki (Millipore) z przeciwciałem monoklonalnym anty-inf-γ (Mabtech), płytka była przepłukana PBS-em. Następnie płytka była inkubowana z 10% ludzką surowicą AB (Sigma-Aldrich) przez 2 godziny w 37 C w celu zablokowania niespecyficznego łączenia z przeciwciałami. Limfocyty CD8+, były inkubowane całą noc z komórkami re-

RHAMM/CD168 nowy cel dla immunoterapii 53 prezentującymi struktury celowe (target cells) komórki linii komórkowej T2 nieposiadające białka związanego z transportem antygenów Transporter Associated with Antigen Processing (TAP) na których powierzchni opłaszczony był antygen, przeciwko któremu reakcja cytotoksyczna T-komórkowa była badana. Jako niespecyficzna pozytywna kontrola do limfocytów CD8+ dodany został mitogen 1 µl/ml Pokeweed Mitogen (PWM) (Sigma-Aldrich). Specyficzną kontrolą pozytywną związaną z rozpoznanym antygenem stanowiły komórki T2 opłaszczone białkiem macierzy grypy (IMP). Jako kontrola negatywna użyte były komórki linii komórkowej T2 nieopłaszczone żadnym antygenem. Następnego dnia po umyciu PBS-em płytek dodane zostało przeciwciało anty-ifn-γ (0,2 µg/ml) do każdego dołka. Po 2 godzinach inkubacji w pokojowej temperaturze płyta została opłukana i dodany został kompleks streptawidyny z alkaliczną fosfatazą (1 µg/ml, Mabtech). Po 2 godzinach płytka została przepłukana i dodana została mieszanina BCIP i NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium, Sigma-Aldrich) w celu uzyskania reakcji barwnej. Po wysuszeniu specyficzne wydzielanie IFN-γ w odpowiedzi na antygen zostało ocenione przy użyciu czytnika ELISPOT (CTL). WYNIKI Ekspresja RHAMM/CD168 u chorych na PBL-B Przy użyciu reakcji RT-PCR stwierdzono ekspresję antygenu RHAMM/CD168 u 77% chorych na PBL-B. W tradycyjnej reakcji RT-PCR użyte były primery znajdujące się w egzonach 1 i 8, w celu oceny ekspresji obu wariantów RHAMM (Ryc. 1). U wszystkich pacjentów, u których stwierdzono ekspresję antygenu RHAMM, obecne były obie formy antygenu RHAMM warianty obróbkowe (splice variants) z (RHAM- M FL ) oraz bez egzonu 4 (RHAMM -exon4 ). U pacjentów w zaawansowanych stadiach choroby (stadia 3 i 4 wg klasyfikacji Rai) obserwowano częstszą ekspresję antygenu RHAMM (100%) w porównaniu z (61%) chorymi we wczesnych stadiach (0 2 wg Rai). Nie stwierdzono ekspresji antygenu RHAMM u zdrowych osób. Ilość RHAMM/CD168 normalizowana względem TBP Do oceny ilości antygenu RHAMM/CD168 użyta została reakcja RT-PCR w czasie rzeczywistym ( real time ). Zaobserwowano statystycznie istotną zwiększoną ilość antygenu RHAMM u chorych we wczesnych stadiach choroby (0 1 wg Rai) w porównaniu do kontroli zdrowych komórek CD19 (Ryc. 3). Wyniki normalizowano względem genu konstytutywnego TBP (TATA binding proteine).

54 K. GIANNOPOULOS i wsp. R3 ILSLELMKL ATG exon 4 exon 13 TAA 5 1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 3 RHAMM/RHAMM -exon4 RHAMM = exon Ryc. 1. Schemat budowy antygenu RHAMM/CD168 Fig. 1. A schematic map of RHAMM/CD168 Rysunek przedstawia schemat budowy antygenu RHAMM. Szare prostokąty oznaczają egzony. Egzony (4 i 13), mogące niewystępować w opisanych w literaturze wariantach obróbkowych (spilce variants), zaznaczono jako prostokąty kreskowane. Dodatkowo oznaczono miejsca przyłączania się primerów użytych w reakcjach RT-PCR, RT-PCR w czasie rzeczywistym oraz umiejscowienie epitopu R3. częstośćekspresji antygenurhamm %) ( 100 80 60 40 20 0 0% (zdrowi, n=20) 61% wczesne stadia (0-2 w klasyfikacji Rai, n=23) p = 0.014 100% zaawansowane stadia (3-4 w klasyfikacji Rai, n=7) Ryc. 2. Ekspresja RHAMM/RHAMM -exon4 w zależności od stadium zaawansowania choroby Fig. 2. Stage of disease and RHAMM/RHAMM -exon4 expression Histogram przedstawia wyniki RT-PCR. Częstość występowania antygenu odnotowano w %.

RHAMM/CD168 nowy cel dla immunoterapii 55 ilośćantygenurhamm względem TBP 1 1 0.80,8 0.60,6 0.40,4 0.20,2 0 0 p<0.0001 zdrowi HV PBL-B CLL (n=5) (n=24) ędem TBP ilośćantygenurhamm wzgl 1 1 0.80,8 0.60,6 0.40,4 0.20,2 0 0 PBL-B stadium 0 w klasyfikacji Rai (n=11) p=0.377 PBL-B stadium 1 w klasyfikacji Rai (n=13) 0 RAI 1 RAI A B Rycina 3. Ilość antygenu RHAMM normalizowana względem TBP na komórkach PBL-B, w porównaniu ze zdrowymi limfocytami B (A) oraz w zależności od stadium zaawansowania choroby (B) Figure 3. The relative ratio of RHAMM/TBP in B-CLL patients versus healthy volunteers (A) and in early stages of disease stage 0 versus stage 1 according to Rai classification (B) kontrola negatywna 102 kontrola pozytywna (PWM) 494 IMP 92 R3 192 Rycina 4. Swoista odpowiedz T cytotoksyczna przeciwko epitopowi R3 antygenu RHAMM/CD168 (wyniki testu ELISPOT dla IFN-γ, po 16 dniach stymulacji w mieszanej hodowli limfocytów) Figure 4. Specific CTL responses against RHAMM/CD168 in one selected CLL patient after 16 days of MLPC (as assessed by ELISPOT assay for IFN-γ, numbers indicate the mean value of spots in triplicate per 40,000 CD8+ cells) Liczby oznaczają średnią wartość punktów z trzech dołków na 40000 limfocytów CD8+.

56 K. GIANNOPOULOS i wsp. Swoista odpowiedź T cytotoksyczna przeciwko antygenowi RHAMM/CD168 w hodowli mieszanej limfocytów z epitopem R3 W celu oceny immunogenności nowo zidentyfikowanych antygenów użyta była metoda mieszanej hodowli limfocytów z syntetycznym peptydem odpowiadającym antygenowi oraz ocena wytwarzania interferonu gamma w odpowiedzi na epitop R3, będący najbardziej immunogennym epitopem MHC I antygenu RHAMM u chorych z ostrą białaczką szpikową. Po 2 tygodniach stymulacji komórek T CD8+, peptydem R3 zauważono zwiększone wytwarzanie interferonu gamma w teście ELISPOT w odpowiedzi na kontakt z komórkami opłaszczonymi przez antygen RHAMM (Ryc. 4), w porównaniu z kontrolą. Rycina 1 obrazuje wzajemne ułożenie primerów używanych do reakcji RT-PCR oraz położenie epitopu R3. DYSKUSJA Identyfikacja nowych struktur mogących być celem dla przyszłej terapii pacjentów chorych na PBL-B stanowi niezwykle ważny krok w poszukiwaniu nowych form terapii tej nieuleczalnej choroby. Struktura taka może nie tylko być wykorzystana w celowanej chemioterapii, ale może również stanowić cel dla immunoterapii, wykorzystującej komórki układu immunologicznego, rozpoznające struktury nowotworowe (10). Istnieje wiele koncepcji wykorzystania takich struktur w immunoterapii. Może być ona użyta do stymulacji ex vivo komórek dendrytycznych z zamiarem ich wykorzystania w szczepionce mającej na celu zwiększenie skuteczności prezentacji antygenu nowotworowego in vivo komórkom efektorowym. Taki antygen może również posłużyć do namnożenia ex vivo klonów swoistych komórek T cytotoksycznych skierowanych przeciwko danemu antygenowi nowotworowemu, a następnie wszczepieniu ich do organizmu gospodarza celem zwiększenia liczby komórek efektorowych funkcjonalnie czynnych przeciwko komórkom białaczkowym. Zidentyfikowane epitopy MHC klasy I danego antygenu nowotworowego mogą również być dostarczane do organizmu jako element szczepionki peptydowej, mającej na celu prezentacje poszczególnych struktur (epitopów) antygenu komórkom efektorowym w odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom białaczkowym (11, 12). Poszukując nowego celu do immunoterapii przeciwnowotworowej niezwykle ważne wydaje się zidentyfikowanie antygenu charakteryzującego się: 1) występowaniem antygenu związanego z nowotworami ograniczonego do komórek białaczkowych, 2) występowaniem u dużej liczby chorych, 3) brakiem ekspresji na komórkach progenitorowych, 4) zidentyfikowaniem immunogennych epitopów, 5) uzyskaniem odpowiedzi cytotoksycznej przeciwko tym epitopom przez komórki T chorych na PBL-B. Wyniki przedstawione w powyższej pracy wskazują, że antygen RHAMM/CD168 może spełniać funkcję celu dla terapii chorych na PBL-B. RHAMM/CD168 jest recep-

RHAMM/CD168 nowy cel dla immunoterapii 57 torem dla kwasu hialuronowego, którego ekspresja zwiększona jest w chorobach nowotworowych. Początkowo RHAMM/CD168 był opisywany jako cząsteczka warunkująca ruchliwość komórek i przechodzenie przez fazy cyklu z G2 do fazy M (7). Cząsteczka RHAMM odgrywa znaczącą rolę w organizacji oraz funkcjonowaniu aparatu mitotycznego (13). Zwiększona ekspresja cząsteczki RHAMM silnie aktywuje erk1 (extracellular-regulated kinase 1) (14) oraz uczestniczy w transformacji ras (15). Odnotowano zwiększoną ekspresję RHAMM w raku sutka oraz raku jelita grubego w zaawansowanych stadiach choroby lub przy istniejących przerzutach nowotworowych (16, 17). Turley i wsp. (7) opisali występowanie ekspresji RHAMM na poziomie mrna u raczej ograniczonej liczby chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B-ko-mórkową. Doniesienia o występowaniu RHAMM na poziomie białkowym są niejednoznaczne. Till i wsp. (18) obserwowali zwiększoną ekspresję cząsteczki RHAMM u wszystkich (6/6) badanych pacjentów z PBL-B, lecz Craine i wsp. (19) obserwowali niskie stężenie antygenu RHAMM u badanych pacjentów z PBL-B. W powyższej pracy opisujemy ekspresję antygenu RHAMM u 77% chorych na PBL-B, charakteryzującą się częstszą ekspresją w bardziej zaawansowanych stadiach choroby. U chorych na raka jelita grubego oraz na przewlekłą białaczkę szpikową wykazano również tendencję do częstszej ekspresji RHAMM/CD168 u pacjentów w zaawansowanych stadiach choroby lub u pacjentów z przerzutami (8, 16). We wcześniejszych badaniach in vitro obserwowaliśmy odpowiedź cytotoksyczną charakteryzującą się wydzielaniem GranzymuB przeciwko peptydowi R3 u pacjentów z PBL-B (20). Ostatnio zidentyfikowaliśmy swoiste komórki CD8+ charakterystyczne dla epitopu R3 jako komórki efektorowe charakteryzujące się wysoką ekspresją CD45RA bez ekspresji CCR7 (21). Szczepionka z zastosowaniem komórek dendrytycznych stymulowanych mieszaniną antygenów nowotworowych w postaci lizatów komórek białaczkowych indukowała odpowiedź cytotoksyczną u pacjentów z PBL-B (22), również przeciwko R3, co czyni RHAMM/CD168 niezwykle interesującym celem w immunoterapii peptydowej. Ponadto profil ekspresji RHAMM (brak ekspresji RHAMM w tkankach zdrowych) wydaje się być sprzyjający zastosowaniu tego antygenu jako celu dla immunoterapii (8). Ostatnio immunogenne epitopy dla RHAMM/CD168 zostały zidentyfikowane i opisane przez grupę badaczy z Uniwersytetu w Ulm w Niemczech (9). Rozpoczęto pilotowe badania nad zastosowaniem epitopu R3 w szczepieniu peptydowym pacjentów z ostrą białaczką szpikową, szpiczakiem mnogim oraz zespołem mielodysplastycznym. Pierwsze obiecujące wyniki ogłoszono podczas Zjazdu Amerykańskiego Towarzystwa Hematologów w Atlancie w grudniu 2005 roku (23). We wczesnych stadiach PBL-B stosowana jest strategia obserwacji tzw. watch and wait, co czyni ten okres wyjątkowo bezpiecznym dla wprowadzania nowych form leczenia. Dodatkowo, we wczesnych stadiach choroby PBL-B funkcja limfocytów nie jest jeszcze upośledzona (24, 25), oraz jak wykazano w tej pracy indukcja odpowiedzi przeciwko epitopowi R3 jest możliwa.

58 K. GIANNOPOULOS i wsp. Idealny cel dla immunoterapii powinien indukować lub zwiększać częstotliwość swoistych limfocytów T cytotoksycznych skierowanych przeciwko danemu antygenowi nowotworowemu w warunkach in vivo, czyli w skutecznej terapii przeciw-nowotworowej, jaką może być reakcja przeszczep przeciwko białaczce, immunoterapia bierna czy szczepionka nowotworowa. Zaobserwowano indukcję/zwiększenie swoistych limfocytów skierowanych przeciwko RHAMM u pacjenta otrzymującego szczepionkę złożoną z komórek dendrytycznych stymulowanych antygenami nowotworowymi pod postacią lizatów komórek nowotworowych (22). Podsumowując, wykazaliśmy obecność antygenu RHAMM/CD168 u znacznej liczby chorych na PBL-B, zwiększającą się wraz z zaawansowaniem choroby. Ilość antygenu RHAMM znacznie większą u pacjentów z PBL-B, w porównaniu z prawidłowymi limfocytami CD19, co może świadczyć o bezpieczeństwie oraz selektywności działania potencjalnej terapii skierowanej przeciwko antygenowi RHAMM. Dowiedliśmy również, że istnieje możliwość indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko epitopowi R3, u pacjentów we wczesnych stadiach zaawansowania PBL-B. Wydaje się, że antygen RHAMM/CD168 może stanowić interesujący cel dla immunoterapii chorych na PBL-B. PIŚMIENNICTWO 1. Keating MJ, Chiorazzi N, Messmer B et al. Biology and treatment of chronic lymphocytic leukemia. Hematology 2003; ASH Educational Program: 153 175. 2. Kröber A, Seiler T, Benner A et al. V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002; 100: 1410 1416. 3. Crespo M, Bosch F, Villamor N et al. ZAP-70 Expression as a surrogate for immunoglobulinvariable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2003; 348: 1764 1775. 4. Mayr C, Bund D, Schlee M et al. Fibromodulin as a novel tumor-associated antigen (TAA) in chronic lymphocytic leukemia (CLL) which allows expansion of specific CD8+ autologous T lymphocytes. Blood 2005; 105: 1566 1573. 5. Siegel S, Wagner A, Kabelitz D et al. Induction of cytotoxic T-cell responses against the oncofetal antigen-immature laminin receptor for the treatment of hematologic malignancies. Blood 2003; 102: 4416 4423. 6. Schmidt SM, Schag K, Müller MR et al. Survivin is a shared tumor-associated antigen expressed in a broad variety of malignancies and recognized by specific cytotoxic T cells. Blood 2003; 102: 571 576. 7. Turley EA, Belch AR, Poppema S, Pilarski LM. Expression and function of a receptor of hyaluronan-mediated motility (RHAMM) on normal and malignant B lymphocytes. Blood 1993; 81: 446 453. 8. Greiner J, Ringhoffer M, Taniguchi M et al. RHAMM is a new immunogenic tumor-associated antigen overexpressed in acute and chronic myeloid leukemia. Exp J Hematol 2002; 30: 1029 1035. 9. Greiner J, Li L, Ringhoffer M, Barth TFE et al. Identification and characterization of epitopes of the receptor for hyaluronic acid mediated motility (RHAMM/CD168) recognized by CD8 positive T cells of HLA-A2 positive patients with acute myeloid leukemia. Blood 2005; 106: 938 945. 10. Jäger E, Jäger D, Knuth A. Antigen-specific immunotherapy and cancer vaccines. Int J Cancer 2003; 106: 817 820. 11. Parmiani G, Castelli C, Dalerba P, Mortarini R, Rivoltini L, Marincola FM, Anichini A. Cancer immunotherapy with peptide-based vaccines: what have we achieved? Where are we going? J Natl Cancer Inst. 2002; 94: 805 818.

RHAMM/CD168 nowy cel dla immunoterapii 59 12. Brinkman JA, Fausch SC, Weber JS, Kast WM. Peptide-based vaccines for cancer immunotherapy. Expert Opin Biol Ther. 2004; 4: 181 198. 13. Assmann V, Jenkinson D, Marshall JF, Hart IR. The intracellular hyaluronan receptor RHAMM/ IHABP interacts with microtubules and actin filaments. Journal of Cell Science 1999; 112: 3943 3954. 14. Zhang S, Chang MCY, Zylka D, Turley S, Harrison R and Turley EA. The hyaluronan receptor RHAMM regulates extracellular-regulated kinase. J Biol Chem 1998; 273: 11342 11348. 15. Hall CL, Yang B, Yang X et al. Overexpression of the hyaluronan receptor RHAMM is transforming and is also required for H-ras transformation. Cell 1995; 82: 19 26. 16. Yamada Y, Itano N, Narimatsu H et al. Receptor for hyaluronan-mediated motility and CD44 expressions in colon cancer assessed by quantitative analysis using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Jpn J Cancer Res 1999; 90: 987 992. 17. Assmann V, Marshal JF, Fieber C, Hofmann M and Hart IR. The human hyaluronan receptor RHAMM is expressed as an intracellular protein in breast cancer cells. J Cell Sci 1998; 111: 1685 1694. 18. Till KJ, Zuzel M, Cawley JC. The role of hyaluronan and interleukin 8 in the migration of chronic lymphocytic leukemia cells within lymphoreticular tissues. Cancer Res 1999; 59: 4419 4426. 19. Craine M, Belch A.R., Mant M.J. and Pilarski L. Overexpression of the receptor for hyaluronanmediated motolity (RHAMM) characterizes the malignant clones in multiple myeloma: identification of three distinct RHAMM variants. Blood 1999; 93: 1684 1696. 20. Giannopoulos K., Li L., Bojarska-Junak A., Rolinski J, Dmoszyńska A., Hus I., Greiner J., Döhner H, Schmitt M. Expression of RHAMM/CD168 and other tumor associated antigens in patients with B- cell chronic lymphocytic leukemia. Haematologica/The Hematology Journal 2005; 90: 570. 21. Giannopoulos K., Hus I., Li L., Bojarska-Junak A., Greiner J., Roliński J., Dmoszyńska A., Döhner H., Schmitt M. The Receptor for Hyaluronic Acid Mediated Motility (RHAMM/CD168) Is a Potential Target for Immunotherapy of Patients with B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia. Blood 2005; 106: 20a. 22. Hus I, Rolinski J, Tabarkiewicz J, Wojas K, Bojarska-Junak A, Greiner J, Giannopoulos K, Dmoszynska A, Schmitt M. Allogeneic dendritic cells pulsed with tumor lysates or apoptotic bodies as immunotherapy for patients with early-stage B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2005; 19: 1621 1627. 23. Greiner J., Giannopoulos K., Li L., Liebisch P., Wendl C., Chen J., Ringhoffer M., Guillaume P., Ritter G., Döhner H., Schmitt M. RHAMM/CD168-R3 Peptide Vaccination of HLA-A2+ Patients with Acute Myeloid Leukemia (AML), Myelodysplastic Syndrome (MDS) and Multiple Myeloma (MM). Blood 2005; 106: 780a. 24. Goldman D. Chronic lymphocytic leukemia and its impact on the immune system. Clin J Oncol Nurs 2000; 4: 233 236. 25. Tsiodras S, Samonis G, Keating MJ, Kontoyiannis DP. Infection and immunity in chronic lymphocytic leukemia. Mayo Clin Proc 2000; 75: 1039 1054. Praca wpłynęła do Redakcji 16.02.2006 r. i została zakwalifikowana do druku 14.06.2006 r. Adres Autora: Zakład Immunologii Klinicznej Akademii Medycznej w Lublinie ul. Jaczewskiego 8 20-950 Lublin