KATEDRA INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ INSTRUKCJE DO ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH Ćwiczenie nr 1 Przedmiot: Techniki Rozdzielania Mieszanin Kierunek studiów: Biotechnologia, semestr VI, studiów I-go stopnia Przygotowali: dr inż. G. Boczkaj mgr inż. J. Głazowska mgr inż. M. Jaszczołt Opracował i zatwierdził: prof. dr hab. inż. Marian Kamiński Gdańsk, 2014 1
Spis treści 1. Wprowadzenie... 3 1.1. Charakterystyka mleka oraz α-laktoalbuminy... 3 2. Podstawowe pojęcia chromatografii i parametry opisujące układ chromatograficzny... 3 3. TLC- definicja i zasady procesu rozdzielania... 7 4. Chromatografia wykluczania... 8 4.1. Mechanizm rozdzielania substancji w chromatografii wykluczania (żelowej)... 8 5. Wymagania do sprawdzianu... 14 6. Przebieg ćwiczenia... 14 7. Literatura... 17 2
1. Wprowadzenie 1.1. Charakterystyka mleka oraz α-laktoalbuminy Mleko to płynna wydzielina wyspecjalizowanego gruczołu ssaków, zawierająca 80-90 % wody i 10-20 % (u krów zwykle 12-13 %) suchej masy, która składa się głównie z tłuszczu, białek, cukru mlekowego (laktozy) i soli mineralnych. Około 98 % wszystkich lipidów mleka to glicerydy kwasów tłuszczowych, pozostałe zaś to wolne kwasy tłuszczowe, fosfolipidy i sterole (w tym cholesterol). Niewielką ilościowo pozycję stanowią inne związki chemiczne słabo rozpuszczalne w wodzie, m.in. karotenoidy i witaminy rozpuszczalne w tłuszczach. Najważniejszym węglowodanem obecnym w krowim mleku jest laktoza, która po spożyciu mleka jest wchłaniana, po uprzedniej hydrolizie do cukrów prostych przy udziale odpowiedniego enzymu wydzielanego w jelicie cienkim. Ze składników mineralnych obecnych w mleku. w największej ilości występują: wapń, fosfor i potas. Wśród witamin znajdują się przede wszystkim witaminy rozpuszczalne w tłuszczach: A, D, E i K, ale także rozpuszczalne w wodzie witaminy z grupy B, witamina C i H. Białka stanowią 95 % wszystkich związków azotowych mleka. Mleko krowie zawiera około trzydziestu różnych białek, które stanowią przeciętnie 30 35 g masy w litrze (3-3,5 %). Białka mleka krowiego dzielą się na dwie frakcje: Białka kazeinowe główna frakcja (78 85 %) Białka serwatkowe (15 25 %). Kazeina składa się z czterech frakcji: αs1, αs2, β i γ kazeiny. Do białek serwatkowych należą β laktoglobulina (36 %), α laktoalbumina (20 %), albumina surowicza (5 %), immunoglobuliny (10 %), laktoferyna (4 %), proteozo-peptony (20 %), laktoperoksydaza. Masa cząsteczkowa głównych białek serwatkowych wynosi: kazeiny 19 24 kda, α- laktoalbuminy 14,4 kda, β-laktoglobuliny 18,4 kda. Cechą charakterystyczną α laktoalbuminy jest duża odporność na wysoka temperaturę. Odmiennie od albumin surowicy krwi α-laktoalbumina zawiera oligosacharyd, który jest przyłączony do łańcucha polipeptydowego przez grupę β-karboksylową reszty kwasu asparaginowego. Ludzka α-laktoalbumina (masa cząsteczkowa 14 176 Da) składa się z 123 aminokwasów i zawiera cztery mostki disiarczkowe. Pierwszorzędowa struktura tego białka jest zgodna ze strukturami α-laktoalbuminy u innych gatunków ssaków. Analiza struktur wykazała, że α-laktoalbumina zawiera 30 % aminokwasów tworzących strukturę α i 14 % aminokwasów tworzących strukturę β. Wykazano, że łańcuch α-laktoalbuminy jest pofałdowany w podobny sposób jak cząsteczka lizozymu. α-laktoalbumina pochodząca z mleka krowiego wykazuje duże podobieństwo w budowie do α-laktoalbuminy pochodzenia ludzkiego. 2. Podstawowe pojęcia chromatografii i parametry opisujące układ chromatograficzny Chromatografia jest techniką rozdzielania mieszanin substancji w układzie dwufazowym (faza stacjonarna/faza ruchoma). Jest stosowana do rozdzielania substancji, które wykazują rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych, wodzie lub ich mieszaninach. Rozdzielanie chromatograficzne to zespół oddziaływań fazy ruchomej, stacjonarnej z substancjami rozdzielanymi. Są to m. in. oddziaływania van der Waalsa, elektrostatyczne, wodorowe, dipol-dipol i inne. 3
Wyniki rozdzielania zapisywane są w formie pików chromatograficznych, których kształt (rozkład stężenia) odpowiada pasmu stężeniowemu substancji opuszczającej kolumnę chromatograficzną, a zapis ten nosi nazwę chromatogramu. Chromatogram może być źródłem informacji dwojakiego typu: jakościowych na podstawie miejsca piku na chromatogramie można m.in. wnioskować o rodzaju (właściwościach fizykochemicznych) rozdzielanych substancji, a na podstawie liczby pików, o liczbie składników w mieszaninie (jednakże pod warunkiem, że zastosowany układ chromatograficzny zapewnia rozdzielenie wszystkich składników mieszaniny a detektor jest czuły na wszystkie substancje); ilościowych wielkość rejestrowanego sygnału detektora, mierzona wysokością, albo powierzchnią piku chromatograficznego jest funkcją stężenia bądź masy substancji w próbce dozowanej do kolumny. Na rysunku 1 przedstawiono schemat klasycznej kolumny chromatograficznej oraz wynik procesu rozdzielania w kolumnie, tzn. chromatogram. Rys. 1. Schemat kolumny chromatograficznej i chromatogram rozdzielonej mieszaniny. 4
Rozdział chromatograficzny to wielokrotna sorpcja i desorpcja substancji z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej i odwrotnie, odbywająca się w warunkach przepływu eluentu w przestrzeni między-ziarnowej, w makro- i mezo-porach wypełnienia kolumny. W konsekwencji proces wymiany masy odbywa się zawsze w warunkach tym większego stopnia odchylenia od równowagi, im większa jest wartość linowej (u) prędkości przepływu eluentu w kolumnie (im większa wartość objętościowego natężenia przepływu eluentu w kolumnie (w)). W zależności od energii oddziaływań z każdą z faz, składniki mieszaniny szybciej lub wolniej przemieszczają się wzdłuż warstwy wypełnienia i opuszczają kolumnę w różnym czasie. Jednocześnie, pasma ulegają poszerzeniu (rozmyciu) na skutek procesów dyfuzyjnych i dyspersyjnych oraz w rezultacie ograniczonej szybkości zjawisk sorpcji-desorpcji. Im bardziej intensywna jest dyspersja, tym mniejsza jest tzw. sprawność rozdzielania w kolumnie chromatograficznej, tym mniejszą liczbą półek teoretycznych (N, zależność 1) charakteryzuje się kolumna oraz, tym większa jest wartość tzw. wysokości równoważnej półce teoretycznej (H HETP, lub WRPT, zależność 2). gdzie: 5,545 l R odległość maksimum piku od punktu dozowania, w 1/2 szerokość piku w połowie wysokości (w przypadku pików gaussowskich ) L długość wypełnienia kolumny. (1) (2) Ze względu na różny mechanizm oddziaływań rozdzielanych substancji z fazą ruchomą i stacjonarną układy chromatograficzne dzieli się na: Adsorpcyjne (ciecz - ciało stałe- L/S) w normalnych układach faz (NP), gdy wykorzystuje się interakcje polarnych grup funkcyjnych mieszaniny rozdzielanych składników oraz konkurencyjne oddziaływania polarne składników eluentu z polarnymi centrami aktywnymi, obecnymi na powierzchni fazy stacjonarnej. W warunkach bezwodnych mamy rzeczywiście do czynienia z warunkami klasycznej adsorpcji, w warunkach względnie wysokich zawartości wody w eluencie, ma miejsce mechanizm oddziaływań hydrofilowych HILIC. Przeciwnymi do tych układów są tzw. odwrócone układy faz (RP), gdy faza stacjonarna jest niepolarna, albo względnie nisko polarna (o charakterze hydrofobowym), a faza ruchoma polarna, jako mieszanina wody / wodnego roztworu buforowego i organicznego dodatku (organicznych dodatków), rozpuszczalnych w wodzie / w roztworze buforowym. Retencja i selektywność rozdzielania substancji jest zależna głównie od stopnia hydrofobowości cząsteczek, albo fragmentów cząsteczek znajdujących się na powierzchni sorpcyjnej i w przestrzeni eluentu. Na powierzchni sorpcyjnej, a także w przestrzeni eluentu mają miejsce oddziaływania o charakterze hydrofobowym, a w przestrzeni eluentu, dodatkowo o charakterze hydrofilowym. Do tej grupy zalicza się też niekiedy tzw. chromatografię oddziaływań hydrofobowych (HIC), gdzie do rozdzielania wykorzystuje się hydrofobowe oddziaływania makromolekuł z hydrofobową powierzchnią fazy stacjonarnej, wzmacniane w warunkach zbliżonych do warunków tzw. wysalania. Jednakże, mechanizmy 5
oddziaływań międzycząsteczkowych są w warunkach HIC całkowicie odmienne od oddziaływań w warunkach RP, za wyjątkiem występowania oddziaływań van der Waalsa między powierzchnią fazy stacjonarnej i hydrofobowymi fragmentami powierzchni rozdzielanych cząsteczek. Podziałowe (L/L) ciecz, jako faza ruchoma/ciecz, jako ciekła faza stacjonarna na powierzchni sorpcyjnej, albo ciecz, jako faza ruchoma/dynamicznie generowana ciekła faza stacjonarna na powierzchni sorpcyjnej (albo w całej objętości wewnątrz porów wypełnienia). O rozdzielaniu decyduje różnica współczynników podziału składników rozdzielanej mieszaniny między dwie fazy ciekłe, tzn. między ciekłą fazę ruchomą i ciekłą fazę stacjonarną - osadzoną statycznie na nośniku, bądź generowaną w sposób dynamiczny w czasie przepływu eluentu przez kolumnę. W praktyce wykorzystuje się tego rodzaju oddziaływania do rozdzielania w układach normalnych (NP-w), albo w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILIC). Chociaż historycznie wykorzystywano tu także warunki odwróconych układów faz, gdy fazą stacjonarną był n-oktanol, albo di-propionitryl. Jonowymienne (IExC), kationo-wymienne (SCX/SA), albo aniono-wymienne (SAX/SB), zwane, w ich nowoczesnej realizacji, w zastosowaniu do rozdzielania jonów nieorganicznych, albo niewielkich jonów organicznych jonowymi (IC), gdy rozdzielanie mieszaniny jest oparte na odwracalnej wymianie jonów eluentu i składników rozdzielanej mieszaniny, z jonami immobilizowanymi na powierzchni fazy stacjonarnej. Ważne jest stworzenie takich warunków, aby wszystkie składowe układu rozdzielczego znajdowały się w postaci elektrolitycznie zdysocjowanej. Do tej grupy zalicza się czasem niesłusznie - tzw. chromatografię wykluczania jonowego (IExcl-C). Mechanizm rozdzielania nie jest wówczas jonowymienny. Wykorzystuje się zjawisko powstawania tzw. membrany Donnana. Chromatografia par jonowych - alternatywa dla chromatografii jonowymiennej, wykorzystywana z fazami stacjonarnymi układów faz odwróconych, gdy jonowe, albo bardzo silnie polarne fragmenty cząsteczek substancji rozdzielanych są maskowane odpowiednim organicznym przeciw-jonem i powstaje kompleks, który zachowuje się w układzie chromatograficznym podobnie jak substancja neutralna, albo, gdy dzięki adsorpcji hydrofobowej części organicznego kationu, lub anionu do hydrofobowej powierzchni sorpcyjnej, tworzy się tam dynamicznie generowana jonowymienna faza stacjonarna. Chromatografię wykluczania, nazywaną chromatografią żelową (GPC Gel Permeation Chromatography), lub wykluczania sterycznego (Size Exclusion Chromatography), stosowaną, albo w warunkach lipofilowych, albo hydrofilowych, do rozdzielania substancji o różnej masie molowej (w zakresie do ok. 10 000 000 Da), a także do rozdzielania, wyodrębniania, a czasem i do oznaczania zawartości składników lub grup składników wyraźnie różniących się masą cząsteczkową (wielkością cząsteczek / cząstek), w tym do tzw. odsalania białek. Wykorzystuje się mechanizm tzw. sita molekularnego, czy wykluczania sterycznego - eliminując, na ile to możliwe, zjawiska sorpcji. Chromatografię powinowactwa (AC Affinity Chromatography), stosowaną wyłącznie w badaniach biomedycznych, w biochemii i w biotechnologii. Wykorzystuje się specyficzne reakcje chemiczne (np. oddziaływanie enzym - koenzym), albo innego typu specyficzne oddziaływania między w specjalny sposób spreparowaną fazą stacjonarną a substancjami rozdzielanymi (np. tzw. chromatografia metalo-powinowactwa - oddziaływania Ni +2...S-S mostki di-siarczkowe). 6
Chromatografię powinowactwa można też stosować bez kolumny, wykonując rozdzielenie w naczyniu laboratoryjnym, albo bezpośrednio w bioreaktorze. 3. TLC- definicja i zasady procesu rozdzielania TLC (Thin Layer Chromatography), chromatografia cienkowarstwowa lub nazywana ostatnio planarną jest rodzajem chromatografii cieczowej, w której faza stacjonarna występuje w postaci cienkiej warstwy. Gdy warstwę tę stanowi bibuła mówi się o chromatografii bibułowej, w przypadku warstwy porowatej na powierzchni płytki szklanej bądź aluminiowej, chromatografię nazywamy cienkowarstwową. Można wykorzystywać te same mechanizmy rozdzielania, jak w chromatografii kolumnowej, poza chromatografią wykluczania. W praktyce, jednak, są produkowane tylko płytki TLC dla warunków NP / HILIC, albo RP. Niezwykle ważną zaletą TLC, jest możliwość jednoczesnego rozdzielania wielu próbek, z tym, mieszanin wzorców, a także możliwość obserwacji istnienia, albo braku elucji wszystkich substancji stanowiących składniki rozdzielanej mieszaniny. Sposób rozdzielania mieszaniny substancji metodą chromatografii cienkowarstwowej można przedstawić w sposób następujący: suchą, aktywowaną, albo czasem dezaktywowaną, dzięki ekspozycji w oparach eluentu, płytkę wraz z nałożonymi na nią w określonych miejscach mieszaninami substancji, albo/i wzorcami, umieszcza się w komorze chromatograficznej wypełnionej do odpowiedniego poziomu rozpuszczalnikiem oraz korzystnie, nasyconej oparami eluentu. Po umieszczeniu płytki w komorze chromatograficznej, faza ruchoma dzięki siłom kapilarnym, migruje wzdłuż fazy stacjonarnej i w zależności od energii oddziaływań substancji rozdzielanych i składników eluentu z fazą stacjonarną oraz w przestrzeni eluentu, substancje rozdzielane / grupy składników rozdzielanej mieszaniny przebywają różną drogę. W efekcie rozdzielania znajdują się w różnych miejscach warstwy, na której podlegały rozdzielaniu. Do opisu zjawisk zachodzących w warstwie chromatograficznej stosuje się parametry akie jak: współczynnik retencji - k = (1-R f )/(R f ) współczynnik opóźnienia czasowego R f współczynnik hr f = 100xR f Współczynnik retencji k (3), który w istocie - służy do liczbowego wyrażania retencji w warunkach elucyjnej chromatografii kolumnowej, może być też obliczany na podstawie wartość R f, w przypadku chromatografii cienkowarstwowej. Pozwala na obiektywne porównywanie selektywności różnych układów chromatograficznych, tzn. zróżnicowania retencji różnych substancji w konkretnym układzie rozdzielczym. Współczynnik opóźnienia czasowego hr f (zależność 5) definiowany jest, jako stosunek drogi przebytej przez środek plamki substancji (a) do drogi czoła fazy ruchomej (b) powiększony 100 razy. Wartość hr f może się zmieniać od 0 do 100. Gdy współczynnik przyjmuje wartość bliską 0 to oznacza to, że substancje zbyt silnie oddziaływają z fazą stacjonarną, w przypadku, gdy hr f przyjmuje wartość bliską 100 to substancje wędrują z czołem rozpuszczalnika i brak jest oddziaływań z fazą stacjonarną. Optymalną wartość hr f osiąga w przedziale od 20 do 80 co oznacza iż warunki chromatograficzne są stabilne. Rysunek 2 ilustruje omawiane powyżej zależności. 1 (3) 7
gdzie: (4) 100% (5) a odległość plamki od miejsca naniesienia mieszaniny subst. A i B (startu) b odległość czoła eluentu od miejsca naniesienia mieszaniny subst. A i B (startu) Rys.2. Chromatogram cienkowarstwowy mieszaniny dwóch substancji A i B. 4. Chromatografia wykluczania 4.1. Mechanizm rozdzielania substancji w chromatografii wykluczania (żelowej) Faza stacjonarna w chromatografii wykluczania zbudowana jest z porowatych ziaren, pozwala na otrzymanie wewnątrz złoża sorbentu przestrzeni między- i wewnątrz-ziarnowych. W przypadku kolumn monolitycznych, wypełnienie zbudowane jest z materiału stanowiącego całość, struktura podobną do gąbki. Posiada makro-pory o dużych rozmiarach - w miejsce porów między-ziarnowych i mikro-pory wewnątrz litego szkieletu. Dodatkowo, wyróżnia się niekiedy makro-pory, tzn. pory pośrednie między mikro i makro-porami. Pory wewnątrz ziaren wypełnienia kolumny, albo mikro-pory w kolumnach monolitycznych, nie są jednakowe pod względem średnic, a więc charakteryzują się określonym rozkładem wartości promieni hydrodynamicznych. W kolumnach do chromatografii wykluczania wartość przeciętna i charakter rozkładu średnic porów są tak dobrane, aby ich rozmiary były dostosowane do wielkości średnic hydrodynamicznych rozdzielanych cząsteczek. 8
Rys. 3. Ilustracja zależności logarytmu masy cząsteczkowej od objętości elucji (log Mw = f(ve), otrzymywanej podczas kalibracji metody oznaczania rozkładu masy cząsteczkowej z zastosowaniem chromatografii wykluczania. W warunkach chromatografii wykluczania dąży się, do całkowitego wyeliminowania oddziaływań sorpcyjnych między powierzchnią wypełnienia kolumny i cząsteczkami rozdzielanych substancji. Wówczas jedynym mechanizmem rozdzielania jest wykorzystanie zróżnicowania drogi i czasu dyfuzji cząsteczek/cząstek o różnej wielkości i masie cząsteczkowej, w przestrzeni porów wewnątrz ziaren wypełnienia kolumny (czasem także wirusów, lateksu, nano-cząstek itp.) albo w mikro-porach kolumny monolitycznej. W konsekwencji uzyskuje się określoną zależność funkcyjną między wartością logarytmu masy molekularnej rozdzielanych cząsteczek i objętością ich elucji z kolumny (rys. 3). Składniki próbki o największych wymiarach cząsteczek lub cząstek, o największej masie cząsteczkowej (jednocześnie o niskich wartościach współczynnika dyfuzji molekularnej), wnikają do porów o największych średnicach, do których są w stanie wniknąć, albo płyną między ziarnami (w przestrzeni makro- i mezo-porów). W ostatnim przypadku mówimy o pełnym wykluczaniu. W konsekwencji, wiąże się to z niskimi wartościami czasu przebywania w kolumnie i elucją w krótkim czasie od dozowania. Cząsteczki o najmniejszych wymiarach, a więc o najmniejszej masie cząsteczkowej (o największej wartości współczynnika dyfuzji) wnikają do wszystkich, albo prawie do wszystkich porów do których są w stanie wniknąć. Stąd ich czas przebywania w kolumnie jest najdłuższy i eluowane są najpóźniej. Substancje o pośrednich rozmiarach, a więc o pośrednich masach cząsteczkowych i pośrednich wartościach współczynnika dyfuzji, wnikają do tych porów, które są dostatecznie dużych rozmiarów. Czas przebywania w kolumnie jest, więc, zależny od wielkości cząsteczek / cząstek. Jednocześnie długość kolumny powinna być względnie duża oraz prędkość 9
przepływu eluentu, zwłaszcza w przypadku rozdzielania dużych cząsteczek / cząstek względnie niska. Chromatografia wykluczania jest wykonywana w dwóch głównych alternatywnych układach separacyjnych: w warunkach niewodnych, tzn. w warunkach, nazywanych lipofilowymi, z zastosowaniem takich faz ruchomych, jak: THF, chlorek metylen,u dioksan, chlorobenzen, ksylen oraz faz stacjonarnych: kopolimeru styren-diwinylobenzen (najczęściej), poliestrów lub innego typu polimerów. Układ ten wykorzystywany jest do badań rozkładu masy cząsteczkowej polimerów nisko i średnio polarnych, rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach niepolarnych, a także lipidów, fosfolipidów itp. niskopolarnych substancji pochodzenia naturalnego; w warunkach wodnych, z wykorzystaniem takich faz ruchomych jak: bufory lub rozpuszczalniki organiczne, takie jak dimetyloformamid, metanol, acetonitryl i ich mieszaniny z wodą; z zastosowaniem faz stacjonarnych takich jak: wypełnienia o ziarnach wykonanych z polarnych polimerów, takich jak polidekstrany i inne policukry, poliwęglany, szkła porowate, silanizowany żel krzemionkowy. Układ ten wykorzystywany jest do rozdzielania, a także do charakteryzowania rozkładu masy cząsteczkowej polimerów polarnych, a szczególnie biopolimerów, takich jak polisacharydy, białka, nukleotydy i tym podobne, niekiedy w połączeniach z substancjami o niższej polarności. Rozkład masy cząsteczkowej (RMC) jest istotnym parametrem szczególnie materiałów polimerowych. Wyznacza się go także dla innych materiałów tj. asfalty i ciężki frakcje naftowe. Warunki rozdzielania względem masy cząsteczkowej są wykorzystywane bardzo szeroko również w przypadku mieszanin pochodzenia naturalnego (biomolekuł, w tym szczególnie biopolimerów). Istnieje kilka alternatywnych technik wyznaczania rozkładu masy cząsteczkowej, wśród których największą rolę odgrywa chromatografia wykluczania (SEC, ang. Size Exclusin Chromatography) - dawniej zwana chromatografią żelową, GPC ang. Gel Permeation Chromatography - oraz technika frakcjonowania w polu sił (FFF, ang. Field Flow Fractionation). Ze względu na możliwość zastosowania w SEC "typowej" aparatury do chromatografii cieczowej, wykorzystywanej powszechnie w laboratoriach analityki technicznej, właśnie SEC jest najczęściej stosowaną techniką wyznaczania RMC. Chromatografia wykluczania jest techniką rozdzielania substancji, w której wykorzystuje się niejonowy mechanizm sita molekularnego, nazwany też mechanizmem wykluczania molekularnego. W odróżnieniu od innych rodzajów chromatografii, w chromatografii żelowej rozdziela się substancje prawie wyłącznie wg rozmiarów ich cząsteczek w roztworze (a dokładniej promienia hydrodynamicznego). W celu zapewnienia takich warunków rozdzielania stosuje się kolumny o ściśle zdefiniowanej wielkości porów oraz eluenty tak dobrane, aby nie miało miejsca oddziaływanie rozdzielanych molekuł z fazą stacjonarną. W rozdzielaniu wykorzystuje się zróżnicowanie dostępności molekuł do porów o zróżnicowanych średnicach, a w konsekwencji - drogi i czasu dyfuzji cząsteczek o zróżnicowanej wielkości i masie cząsteczkowej, w przestrzeni porów wewnątrz ziaren wypełnienia kolumny. W warunkach SEC mniejsze molekuły wnikają do większej liczby porów, przez co ich "droga" przez kolumnę jest dłuższa w porównaniu z większymi cząsteczkami, które wnikają tylko do części porów. W konsekwencji, większe cząsteczki szybciej opuszczają kolumnę - tzn. posiadają niższą retencję. 10
W celu opanowania podstaw techniki SEC, przed przystąpieniem do laboratorium, Studenci są zobowiązani do wnikliwego przestudiowania odpowiedniego rozdziału z pozycji [1] wykazu literatury uzupełniającej. Zakres stosowania Rozdzielanie względem masy cząsteczkowej mieszanin: 1) kopolimerów, 2) gumy naturalnej i syntetycznej, 3) poliamidów, poliestrów i fluoropolimerów 4) asfaltów 5) homopolimerów i kopolimerów akrylamidu 6) alkoholu i octanu poliwinylowego 7) homopolimerów i kopolimerów vinylopirolidonu 8) celulozy i jej pochodnych 9) białek 10) kwasów nukleionowych i wielu innych. Oznaczanie średniej wartości oraz rozkładu masy cząsteczkowej. Oznaczanie obecności i zawartości produktów polimeryzacji oraz frakcji wysokomolekularnej (wykluczanej w układzie zastosowanych kolumn) w materiałach niskocząsteczkowych - np. paliwach silnikowych. Oznaczanie orientacyjnego przebiegu rozkładu temperatury wrzenia (TBP / FBP), a szczególnie wartości tzw. "końca wrzenia" badanego materiału naftowego. Oznaczanie zawartości wiskozatora w roztworze w oleju bazowym lub oleju smarowym; Identyfikacja typu asfaltu na zasadzie porównawczej rozkładu masy cząsteczkowej asfaltów, oznaczanie zawartości modyfikatora w asfaltach modyfikowanych polimerami. W przypadku SEC w warunkach wodnych (hyfrofilowych), próbkę materiału badanego rozpuszcza się w wodzie lub roztworze wodnym soli nieorganicznej/ organicznej zapewniającym wyeliminowanie oddziaływań z fazą stacjonarną - najczęściej jest nim fosforan sodu (czasami dodawana jest dodatkowa sól nieorganiczna, np. chlorek sodu). W przypadku ryzyka występowania w próbce materii organicznej lub zanieczyszczeń nierozpuszczalnych w zastosowanym rozpuszczalniku, próbkę należy przefiltrować (np. przez filtr teflonowy o średnicy porów 0,45µm). Tak przygotowany roztwór dozuje się (typowe objętości od 20-100 µl). Kolumna na wylocie jest połączona z detektorem. Najczęściej stosowanym detektorem w SEC jest detektor refraktometryczny, którego sygnał jest proporcjonalny do stężenia oraz jest zależny od współczynnika załamania światła substancji. Do detekcji w SEC nadają się wszystkie detektory stosowane w cieczowej chromatografii, z tym, że w przypadku wyznaczania na podstawie chromatogramu rozkładu masy cząsteczkowej, konieczne jest, aby detektor charakteryzował się uniwersalną odpowiedzią względem analizowanych substancji. W celu wyznaczenia średniej wartości oraz rozkładu masy cząsteczkowej, należy dokonać kalibracji, w oparciu o analizę roztworu wzorców (korzystnie wąsko-dyspersyjnych - tzn. o małym rozrzucie mas cząsteczkowych) o znanej masie cząsteczkowej. Najczęściej wykorzystywane są wzorce polipeptydów lub polisacharydów, czasami stosowane są polistyreny (w tym wypadku bezwzględnie należy zastosować warunki niewodne). Na podstawie chromatogramu roztworu wzorcowego odczytuje się wartości objętości elucji (V) lub czasu retencji (R t,) oraz przyporządkowuje wartości masy cząsteczkowej. Następnie wykonuje się wykres zależności logm = f(v lub R t ) (Rys. 8). 11
7 6 5 LogM= -0,8782Rt + 11,12 R² = 0,9978 LogM 4 3 2 1 0 5 6 7 8 9 10 11 Rt [min] Rys. 4 Krzywa kalibracyjna wykonana dla wzorców polistyrenów Chromatogram próbki należy podzielić na równe fragmenty. Powinno być ich, co najmniej 25 - programy komputerowe stosowane do obróbki danych w SEC dzielą chromatogram na kilka tysięcy fragmentów. Dla każdego fragmentu wyznacz sie wartość czasu, która dzieli fragment na dwie równe pod względem pola powierzchni pod fragmenty. Dla każdej z tak wyznaczonych wartości czasu odczytuje się z krzywej kalibracyjnej wartość masy cząsteczkowej. W celu dokładnego określenia udziału danej frakcji, dodatkowo, należy zastosować metodę normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi. Na podstawie równań (1) i (2) można obliczyć odpowiednio średnią masę M cząsteczkową ( n ) oraz średnią ważoną masę cząsteczkową ( M równania (3) oblicza się polidyspersyjność (D) mieszaniny. ni M i Ai M n = = n A i i M i (1) 2 ni M i Ai M i M W = = ni M i Ai (2) M D = M W W ). Na podstawie n (3) gdzie: M i - masa cząsteczkowa i [g/mol] n i - liczba cząsteczek w mieszaninie o masie M i m i - masa cząsteczek w mieszaninie o masie M i A i - pole powierzchni piku pochodzące od cząsteczek o masie M i [j. powierzchni piku] Na rysunku 5 przedstawiono chromatogram rozdzielania w warunkach SEC z detektorem refraktometrycznym próbki asfaltu przemysłowego. 12
Rys 5 Chromatogram rozdzielania próbki materiału Asfalt przemysłowy PS 95/35, techniką chromatografii wykluczania (GPC/SEC), detektor refraktometryczny, kolumna: LiChrogel PS MIX, 5 µm, 250 x 7 mm, przepływ eluentu0,7 ml/min, temperatura 33 C, objętość dozowana 20 µl, stężenie próbki: 0,05g/1ml w tetrahydrofuranie. Na rysunku 6przedstawiono wyznaczony rozkład masy cząsteczkowej asfaltu. Liczbowo wartość śćśrednią średnią oraz rozkład masy cząsteczkowej, a także orientacyjny zakres liczby atomów węgla dla poszczególnych frakcji zestawiono w tabeli 1. Tabela 1.. Wyniki badania materiału asfalt przemysłowy PS 95/35, z wykorzystaniem techniki chromatografii wykluczania (żelowej) HPLC-GPC/SEC Zakres masy cząsteczkowej [Da] Zakres liczby atomów węgla Udział masowy [%] Średnia masa cząsteczkowa [Da] Liczba atomów węgla w maksimum rozkładu 2523328-151676 194102-1166711667 1,6% 151676-29155 11667-2243 9,0% 29155-6332 2243-487487 17,3% 6332-2693 487-207 17,8% 2693-1145 207-88 29,8% 1145-597 88-46 11,5% 597-287 46-22 8,3% 287-106 22-8 4,7% 1174 90 13
35,0% 30,0% 25,0% %zawartości 20,0% 15,0% 10,0% 5,0% 0,0% 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 masa molekularna [Da] Rysunek 6 Rozkład masy molekularnej dla próbki materiału asfalt przemysłowy PS 95/35, wyznaczony na podstawie chromatogramu z rys. 5, w oparciu o kalibrację z wykorzystaniem wąsko-dyspersyjnych materiałów wzorcowych polistyrenu. 5. Wymagania do sprawdzianu Na sprawdzianie obowiązuje treść niniejszej instrukcji, jak również odpowiednie, związane z treścią instrukcji rozdziały książki*. Dodatkowo Student winien być zaznajomiony materiałem podstawowego kursu Inżynierii Chemicznej i Procesowej. 6. Przebieg ćwiczenia I. Przygotowanie serwatki z mleka krowiego: a) zakwaszenie mleka (ścięcie kazeiny) b) sedymentacja kazeiny c) dekantacja serwatki znad kazeiny d) filtracja lub wirowanie II. Kontrola poprawności przygotowania serwatki zbadanie obecności α-laktoalbuminy / laktozy w serwatce, za pomocą cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC) w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILIC) oraz odwróconych układów faz (RP). III. Wyznaczenie rozkładu masy cząsteczkowej polimeru z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej w warunkach wykluczania sterycznego w opcji hydrofilowej i/lub lipofilowej. Opis ćwiczenia I. Przygotowanie serwatki z mleka: a) Zakwaszenie mleka Do przygotowanej zlewki o pojemności 200 ml wlać ok. 150 ml mleka. Następnie dodać pod wyciągiem niewielką ilość kwasu (200 µl do 1 ml) otrzymanego od Prowadzącego intensywnie mieszając podczas dodawania. W momencie zauważenia niewielkich grudek na ściankach naczynia zmierzyć papierkiem wartość ph. Jeśli wartość ph będzie bliska 5 dodać 14
krople kwasu i zmierzyć ph za pomocą ph metru. ph roztworu należy ustawić w zakresie 4,56 do 4,6, gdyż w tym zakresie zachodzi denaturacja kazeiny. b) sedymentacja kazeiny opis ćwiczenia w Instrukcji dla TR TCH 3 rok Ćwiczenie 1b- Sedymentacja, dekantacja, elutriacja i granulometria mikroskopowa c) dekantacja serwatki znad kazeiny - opis ćwiczenia w Instrukcji dla TR TCH 3 rok Ćwiczenie 1b- Sedymentacja, dekantacja, elutriacja i granulometria mikroskopowa d) filtracja i wirowanie opis ćwiczenia w Instrukcji dla TR TCH 3 rok Ćwiczenie 1c- Filtracja, strącanie, -wirowanie II. Kontrola poprawności przygotowania serwatki zbadanie obecności α-laktoalbuminy w serwatce, za pomocą cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC) z zastosowaniem warunków zaproponowanych przez Studentów oraz zaakceptowanych przez Prowadzącego. W celu sprawdzenia poprawności przygotowania serwatki, pod względem obecności α laktoalbuminy, należy na aluminiową płytkę chromatograficzną (pokrytej żelem krzemionkowym w przypadku HILIC oraz żelem krzemionkowym modyfikowanym oktadecylosilanem w przypadku RP) nałożyć ok. 10 µl serwatki w postaci małej plamki (φ plamki ok. 1mm) oraz obok nałożyć ok. 2 µl wodnego roztworu wzorca α laktoalbumin. Tak przygotowaną próbkę umieścić w wcześniej napełnionej eluentem komorze chromatograficznej, w której ustalona jest równowaga termodynamiczna pomiędzy fazą ciekłą i gazową w całej objętości komory. Po rozwinięciu chromatografu TLC, należy płytkę obejrzeć w świetle dziennym oraz pod lampą UV przy 254 oraz 365 nm i zanotować wnioski z obserwacji. Dodatkowo osuszoną płytkę należy spryskać 1 % etanolowym roztworem ninhydryny. Następnie płytkę należy ogrzać przez 5min. w temperaturze 95 ºC. Po ochłodzeniu płytki i upływie niezbędnego czasu stabilizacji (ok. 15min.) należy zanotować obserwacje prowadzone w świetle widzialnym. Po skończeniu zajęć otrzymaną serwatkę należy oddać prowadzącemu, a płytkę TLC załączyć do raportu. II. Warunki badań Pompa strzykawkowa, dozownik Rheodyne Rh-7725i z pętlą dozującą 20 µl Kolumna: LiChrogel PS MIX, 5 µm, 250 x 7 mm (MERCK, Niemcy) lub LiChrospher DIOL 5 µm, 250 x 4 mm (MERCK, Niemcy) Eluent: dichlorometan (DCM), 1,0 ml/min lub 0,15MK 2 HPO 4 + 0,3M NaCl 1,0 ml/min (lub inne zaproponowane przez Studentów / Prowadzącego) Temperatura 25 C Detektor refraktometryczny RI (Knauer, Niemcy) Objętość dozowanej próbki: 20 µl Stężenie próbki: 0,05g/mL DCM III. Sposób postępowania 1. Sporządzić roztwór: a. nisko dyspersyjnych wzorców polimerów o średnich masach molekularnych: 2 750 000 Da, 120 000 Da, 11 600 Da, 5 450 Da, 245 Da, i aceton lub azydek sodu o masie molekularnej 58 Da (stężenie końcowe ok. 3 mg / ml). b. wybranego polimeru (np. styropian lub serwatka) o stężeniu ok. 0,05 g/ml 2. Sprawdzić gotowość aparatury i systemu rejestracji danych zgodnie z uwagami Prowadzącego 15
3. Ustabilizować warunki rozdzielania po zapewnieniu wypełnienia kanału odniesienia detektora RI aktualnie stosowanym eluentem (konieczne uzyskanie stabilnej linii podstawowej detektora wahania wskazań na wyświetlaczu mniejsze od 0,2 jednostek względnych); 4. Po ustaleniu warunków oznaczania, nastrzyknąć kolejno roztwór wzorcowych polimerów; 5. W trakcie rozdzielania przygotować tabelę kalibracyjną oraz naszkicować schemat układu stosowanego w ćwiczeniu 6. Następnie wykonać w identycznych warunkach analizę chromatograficzną roztworu polimeru 7. Opracować uzyskany chromatogram wzorców oraz próbki oraz wydrukować chromatogramy do pliku pdf. 8. Na podstawie uzyskanych rezultatów wyznaczyć średnią masę oraz rozkład masy cząsteczkowej. Sprawozdanie Każda grupa przygotowuje odrębne sprawozdanie w formie odręcznego czytelnego manuskryptu, z odpowiednimi obliczeniami i wykresami oraz naszkicowanymi odręcznie i poprawnie opisanymi chromatogramami. Każde z pięciu ćwiczeń stanowi odrębną część sprawozdania końcowego i powinno zawierać następujące części oraz informacje: - Wprowadzenie - opis operacji przygotowawczych oraz separacyjnych i wykorzystywane zjawiska fizykochemiczne mające główny / drugorzędny wpływ na osiągane rezultaty rozdzielania, opis optymalnych warunków i ograniczeń utrudniających / uniemożliwiających osiągnięcie optymalnych warunków, opinię dotyczącą zalet i wad uwzględnionych operacji i procesów separacyjnych, a także technik detekcji oraz metod oznaczania; - Cel ćwiczenia; - Część doświadczalna - opis i warunki eksperymentów wykonanych podczas ćwiczenia, z podziałem, jak w publikacji naukowej, na: Materiały; Aparatura i wyposażenie; Metodyka i sposób opracowania wyników (Proszę stosować tabelaryczne przedstawianie danych i warunków oraz zamieszczać schematy budowy stanowisk laboratoryjnych, aparatury, kolumn i sprzętu pomocniczego z odpowiednimi opisami w podpisie pod rysunkami - w sposób jak najkrótszy, jednak na tyle jednoznaczny, aby można było na tej podstawie zamieszczonych danych i informacji powtórzyć eksperymenty bez konsultowania się z wykonawcą, tzn., konieczne jest podanie nazw,typu, modelu, stopnia czystości, producenta, stężeń itp. danych, proszę w części metodyka zamieścić także przykłady wykonanych obliczeń wraz z jednostkami fizycznymi, po jednym przykładzie dla obliczania konkretnej wielkości) - Wyniki i dyskusja - zestawienie wyników w formie rysunków, tabel, fotografii, danych uzyskanych w rezultacie wykonanych obliczeń itp., wraz z opisem, co one przedstawiają i jakie wnioski z nich wynikają; - Wnioski końcowe - zestawienie wniosków wynikających z całej serii pięciu ćwiczeń, jednak bez powtarzania wniosków zamieszczonych w poszczególnych częściach sprawozdania, natomiast kilka wniosków znajdujących się w różnych częściach sprawozdania może być podstawą do sformułowania odpowiedniego wniosku końcowego (w tym sensie powtórzenie jest dopuszczalne); 16
- Spis literatury - proszę zamieścić w sposób zgodny z zasadami cytowania literatury stosowanymi w publikacjach naukowych tylko te pozycje, z których rzeczywiście korzystali autorzy sprawozdania. Nad przygotowaniem sprawozdania powinna pracować cała grupa wykonująca ćwiczenie. Na stronie czołowej powinny zostać wpisane czytelnie nazwiska osób wykonujących ćwiczenie oraz sprawozdanie wraz z podpisami. Podpis oznacza, że określona osoba brała udział w pracy nad przygotowaniem sprawozdania i współodpowiada za jego treść i zamieszczone wnioski. 7. Literatura Literatura podstawowa: * M.Kamiński (ed.) Chromatografia Cieczowa, CEEAM, Gdańsk, 2004., ** Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT-W-wa, wyd. 2000 lub 2005., *** J. Cazes (ed) Encyclopedia of Chromatography, Marcel Dekker, New York, 2001. Literatura dodatkowa: 1) M. Berek, M. Dressler, M. Kubin, K. Marcinka, Chromatografia żelowa, PWN, W-wa, 1989., 2) K. Hostettman, A. Morston, Preparative Chromatography Techniques Applications, Springer Verlag, 1998., 3) O. Mikes, HPLC of Biopolimers ond Biooligomers Elsevier, Amsterdam, 1988., 4) J. Weiss, Handbook of ion chromatography vol 1,2, Wiley-VCH 2004., 5) R. Rautenbach, Procesy membranowe, WNT-W-wa, wyd. 1996. 17