Praca oryginalna Original Article

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostic 2010 Volume 46 Number 4 371-378 Praca oryginalna Original Article Korelacja pomiędzy badaniem anty-hcv a HCV RNA. Problemy interpretacyjne wynikające z występowania wyników fałszywie dodatnich bądź fałszywie ujemnych w teście przesiewowym Correlation between anty-hcv and HCV-RNA tests. Interpretative problems arising from the occurrence of false positive or false negative results in screening tests Agnieszka Wierzbicka Pracownia Biologii Molekularnej, Laboratorium Centralne, Samodzielny Publiczny Wojewódzki Szpital Zespolony w Szczecinie Streszczenie Cel: Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest ważnym patogenem człowieka, gdyż zakażonych jest nim już ponad 17 mln ludzi na świecie. Diagnostyka obejmuje testy laboratoryjne, testy serologiczne, testy potwierdzenia RIBA HCV, oraz testy metodami biologii molekularnej: oznaczanie HCV-RNA (Real-Time PCR). Wiele problemów interpretacyjnych wynika z występowania wyników fałszywie dodatnich bądź fałszywie ujemnych w testach przesiewowych. Metody: W pracy przedstawiono metody badawcze wykorzystywane w diagnostyce WZW C, oraz wyniki badań własnych na grupie 300 osób, porównując wyniki testów serologicznych anty-hcv metodą immunoenzymatyczną (MEIA) w systemie AxSYM z wykrywaniem HCV-RNA, metodą Real-Time PCR, w teście jakościowym firmy Roche Diagnostics. U 90 (30%) badanych pacjentów z wyselekcjonowanych grup obserwowano wyniki fałszywie dodatnie bądź fałszywie ujemne wyniki badań przesiewowych. Wnioski: Stwierdzenie bądź wykluczenie WZW C powinno opierać się na szerokim panelu badawczym oraz obrazie klinicznym pacjenta, gdyż diagnostyka jest często trudna a wyniki badań niejednoznaczne, co wiąże się między innymi z występowaniem wyników fałszywie dodatnich bądź ujemnych w testach przesiewowych, w szczególnych grupach pacjentów: dializowanych, po przeszczepach, i na leczeniu immunosupresyjnym, u kobiet w ciąży, oraz osób zakażonych innymi wirusami, np. wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV). Summary Aim: Hepatitis C virus (HCV) is an important human pathogen, since it concerns 170 mln people worldwide. Its diagnostics involves lab tests, serological tests, confirmation tests RIBA HCV, and molecular assays for HCV-RNA (Real-Time PCR). Numerous interpretative problems arise from the occurrence of false positive or false negative results in screening tests. Methods: I have compared test methods used in the diagnostics of WZW C, and have included the results of my own research, that compared serological anti-hcv tests by the microparticle enzyme immunoassay (MEIA) in the AxSYM system with HCV-RNA detection, from Abbott, with the qualitative real-time PCR assay, from Roche Diagnostics. In 90 (30%) of examined patients from the selected groups, screen testing gave false positive or false negative results (n=300). Conclusions: Confirmation or exclusion of WZW C should be based on all the available test methods and on patient s clinical symptoms, because the diagnostics is often difficult and findings ambiguous. This arises, among others, from the occurrence of false positive or false negative results in screening tests, especially in atypical groups of patients: dialyzed, after transplants, immunosuppressive, women in pregnancy, and patients with Hepatitis B virus. Słowa kluczowe: Wirusowe zapalenie wątroby typu C, diagnostyka serologiczna, anty HCV, badania przesiewowe, RIBA test, HCV RNA Key words: Viral Hepatitis C, serological diagnostics, screen testing, anti-hcv, RIBA-test, HCV-RNA. 371

Korelacja pomiędzy badaniem anty-hcv a HCV RNA. Problemy interpretacyjne Wstęp Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest przyczyną wirusowego zapalenia wątroby typu C (WZW C). W 1989 r. po raz pierwszy zidentyfikowano i opisano hepatitis C virus jako główny czynnik etiologiczny zapaleń wątroby non-a/non-b (Choo i wsp. 1989) oraz raka i marskości wątroby [1]. Wirus HCV może przebiegać bezobjawowo jako zakażenie utajo - ne. Wykazuje dużą wrażliwość na środki chemiczne i me to - dy dezynfekcji, większą niż HBV, lecz mniejszą niż HIV. Osoby przewlekle zakażone wykazują podwyższone ryzyko powikłań odległych zakażenia, w tym przewlekłego zapalenia, marskości oraz pierwotnego raka wątrobowokomórkowego (HCC). Większość (96%) zakażonych nie jest świadoma swojego stanu, ponieważ zazwyczaj przewlekła infekcja jest skąpoobjawowa lub bezobjawowa i trwa latami. Eliminacja wirusa następuje u 15-30% chorych, głownie w przypadku objawowego przebiegu ostrego WZW C. U pozostałych chorych rozwija się zapalenie przewlekłe, a u 5-20% z nich może dojść do marskości wątroby w ciągu 20-25 lat, związaną z poważnymi powikłaniami (wodobrzusze, żylaki przełyku, żółtaczka, encefalopatia, zaburzenia krzepnięcia). Zapaleniu wątroby, wywołanemu przez HCV, często towarzyszą choroby autoimmunologiczne w tym autoimmunologiczne zapalenie wątroby (AIH), które znacznie pogarszają rokowanie i czas przeżycia, oraz krioglobulinemia, występująca u po - nad 26% pacjentów przewlekle zakażonych HCV [2,3,6]. Źródłem zakażenia HCV jest człowiek a do transmisji może dojść w czasie używania niedostatecznie wysterylizowanego sprzętu wielokrotnego użytku, powtórnego wykorzystywania narzędzi pierwotnie przeznaczonych do jednorazowego użytku, zakłuć, ekspozycji materiału zakaźnego na błony śluzowe, podania zainfekowanych preparatów krwiopochodnych itp. a także nieprzestrzegania standardów higieny podczas procesów diagnostycznych i leczniczych. Ocenia się, że około 55-60% do zakażenia mogło dość w ramach procedur związanych ze służbą zdrowia [1,4]. Innymi źródłami zakażeń może być wykonywanie zabiegów pielęgnacyjnych i upiększających takich jak manikiur, pedikiur, tatuaże, kolczykowanie, akupunktura, oraz przeniesienie zakażenia w populacji narkomanów poprzez stosowanie środków odurzających drogą dożylną lub donosową. Do połowy lat dziewięćdziesiątych XX wieku grupie ryzyka były także osoby, którym wykonywano transfuzje krwi, lub przetaczano preparaty krwiopochodne; jednak wprowadzone po 2000 r. obowiązkowe badania materiału od dawcy prawie całkowicie zminimalizowało tę drogę infekcji [5]. Ważne jest także, iż obecnie zakażenie HCV jest zaliczane do chorób przenoszonych drogą płciową ryzyko zakażenia przez kontakty seksualne wynosi od 1,5%/rok, dla porównania HIV 0,5% [2]. W Polsce wg danych Polskiej grupy Ekspertów HCV szacunkowa liczba zakażonych może wynosić nawet 730 000 osób, czyli 1,9% Polaków może być zakażonych wirusem HCV (dane z października 2010 r.). Wykrywalność zakażeń jest bardzo niska, gdyż poziom świadomości społecznej jest niski. Ponadto nadal dla wielu osób nieznane są drogi zakażenia, a jednocześnie nie udało się dotychczas uzyskać skutecznej szczepionki przeciwko WZW C. Działania profilaktyczne nacelowane na poprawę świadomości społecznej oraz prowadzenie badań przesiewowych mogłoby poprawić sytuację epidemiologiczną w kraju. Według szacunków Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) na całym świecie jest już ponad 170 mln osób zakażonych HCV [19]. Przenoszenie parenteralne HCV znajduje odzwierciedlenie w dużej częstości zakażeń wśród znanych grup ryzyka (np. uzależnieni od narkotyków) jednak niepokojąco wzrasta odsetek zakażonych wśród pacjentów ośrodków szpitalnych, opiekuńczych, pacjentów dializowanych, osób korzystających z dostępnych zabiegów pielęgnacyjnych, co przy dużej liczbie nosicieli może powodować, iż na ryzyko zachorowania na wirusowe zapalenie wątroby typu C narażony jest każdy, bez względu na płeć, wiek, status społeczny i materialny. Dzięki skutecznym kampaniom systematycznie wzrasta jednak liczba osób ba da ją - cych się w kierunku WZW C. Diagnostyka WZW C WZW C najczęściej przebiega bezobjawowo, choć mogą pojawiać się niespecyficzne objawy: osłabienie i zmęczenie, ucisk w nadbrzuszu, utrata łaknienia, zmęczenie, senność, apatia; objawy depresji; zespół suchości, objawy skórno-śluzówkowe; choroby nerek rozplemowe zapalenie kłębuszków nerkowych (MPGN); znacznie rzadziej żółtaczka [6]. U zakażonych HCV dość często występuje także nieznacznie powiększona śledziona (ok. 50%) i/lub wątroba (w obrazie USG). Objawy te często są niecharakterystyczne i trudne do przyporządkowania konkretnej jednostce chorobowej, co przy wspomnianej niskiej świadomości społecznej, oraz niekiedy utrudnionym dostępie do specjalisty i szerokiej wielotorowej diagnostyki może powodować bagatelizowanie objawów chorobowych, lub też mylną ich interpretację. Należy podkreślić, iż aktualnie dysponujemy szerokim wachlarzem ba - dań opierających się na badaniach pomocniczych, serologicznych badaniach przesiewowych, testach potwierdzenia, oraz technikach biologii molekularnej. Badania pomocnicze obejmują najczęściej badania biochemiczne, mierzące po - ziom aktywności enzymów wątrobowych takich jak aminotransferaza alaninowa (ALT), aminotransferaza asparaginianowa (AST), gamma-glutamyl transpeptydaza (GGTP), fosfataza zasadowa (ALP), dehydrogenaza mleczanowa (LDH) oraz stężenie bilirubiny. Z uwagi na fakt, iż przewlekłe zapalenie wątroby typu C charakteryzuje się wahaniami aktywności transaminaz a około jedna trzecia pacjentów (20-40%) wykazuje prawidłowe ich wartości [1], należy ostrożnie podchodzić do interpretacji szczególnie podczas 372

A. Wierzbicka w surowicy znajdują się przeciwciała anty-hcv, to reagują one z antygenowymi białkami wirusa znajdującymi się na błonie. Zmiana koloru (reakcja barwna dzięki dodanemu enzymowi) wskazuje na to, że przeciwciała zareagowały z białkami. Rycina 1. Związek pomiędzy rekombinowanymi białkami HCV w teście AxSYM HCV version 3.0, a strukturalnymi i niestrukturalnymi białkami genomu HCV (wg firmy Abbott). HCr43 Rekombinowane białko HCV wykazujące ekspresję u Escherischa coli, zawiera sekwencje białek strukturalnych rdzenia wirusa oraz białek niestrukturalnych NS3 (biorących udział w replikacji) c200 Rekombinowane białko HCV wykazujące ekspresję u Saccharomyces cerevisiae zawiera aminokwasy 1192-1931, które prawdopodobnie powodują kodowanie regionów NS3 i NS4 genomu HCV. c100-3 Rekombinowane białko HCV wykazujące ekspresję u Saccharomyces cerevisiae zawiera sekwencje niestrukturalnych białek NS3 i NS4. NS5 Rekombinowane białko HCV wykazujące ekspresję u Saccharomyces cerevisiae zawiera sekwencje niestrukturalnego białka NS5. diagnozowania fazy przewlekłej oraz u pacjentów bez klinicz - nej manifestacji objawów chorobowych. K Ma da liński i wsp. [16] w badaniach i poziomu anty-hcv i HCV-RNA u chorych z pierwotnym zespołem Sjögrena wykazali, iż u siedmiu pa - cjentów, od których uzyskano dane badań biochemicznych (na 20 chorych posiadających przeciwciała anty-hcv) wartość aktywności ALT przekroczona została tylko u 3 chorych przy wartości prawidłowej < 30 IU/L, a średnia wartość ALT u 7 chorych wynosiła 34.3 IU/L, czyli tylko nieznacznie przewyższała górną granice wartości referencyjnej. Rekombinowane testy immunoblot (RIBA) Są to testy uzupełniające do oznaczania przeciwciał anty- HCV (RIBA) przeznaczone jako dodatkowe bardziej swoiste testy do badania próbek ludzkiej surowiec lub osocza. Rekombinowane testy immunoblot (RIBA) zawierają te same antygeny HCV co testy EIA, a także dysmutazę nadtlenkową (SOD). Dodatni wynik testu RIBA definiowany jest jako reaktywność na dwa lub więcej antygeny HCV, przy braku reaktywności na SOD. Reaktywność na pojedynczy antygen wirusa HCV lub reaktywność w szerokim zakresie antygenów wraz z reakcją na SOD uznawane są za wyniki nieokreślone ( CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA paskowy test immunoblot do oznaczania przeciwciała przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C firmy Ortho Diagnostic na podstawie ulotki producenta). Badania mikroskopowe Hybrydyzacja in situ Wirus HCV rozprzestrzenia się w organizmie ludzkim za pomocą kompleksów immunologicznych/krioglobulin i jest znajdowany w wielu miejscach, m.in. w komórkach mózgu, w tym w komórkach glejowych, w płynie mózgowo-rdzeniowym, w komórkach krwi obwodowej makrofagach, limfocytach T i B oraz w komórkach szpiku kostnego [5]. Najczulsze Metody serologiczne Dzisiejsza diagnostyka serologiczna wykorzystuje testy, oparte na wykrywaniu przeciwciał anty-hcv. Są to testy EIA (enzyme immunosorbent assay) immunoenzymatyczne drugiej i trzeciej generacji pozwalają one wykrywać przeciwciała skierowane przeciwko antygenom wirusa typu C, które zwykle pojawiają się średnio po 80 dniach od zaka - żenia (zakres od 33 do 129 dni). Testy EIA-2 wprowadzono już w 1990 r, jednak okazały się mało czułe [14]. Testy EIA-3 (testy trzeciej generacji) zostały zaakceptowane przez FDA jako testy o większej czułości i specyficzności niż uprzednio stosowane. Obecnie umożliwiają wykrywanie przeciwciał anty-hcv przy czułości diagnostycznej od 99,4% do 99,9%. Rycina 2. Obraz biopsji wątroby w mikroskopie świetlnym pokazujący pozytywnie oznakowane hepatocyty z infekcją HCV, przy użyciu hybrydyzacji in situ, powię k- szenie 20x [8]. (Majerowicz S i wsp., 2004) Metoda immunoblottingu Western blot Metodę immunoblottingu Western blot" stosuje się jako tzw. test potwierdzenia. Surowica inkubowana jest na nitrocelulozowych błonach, na których umieszczone są rozdzielone białka wirusowe c33c, NS5, C100p, c22p i 5-1-1p. Jeżeli Rycina 3. Obraz hepatocytów w mikroskopie elektronowym z ukazanymi wtrętami koloidowymi wewnątrz rer, przy użyciu hybrydyzacji in situ, powiększenie 60000x [8] (Majerowicz S i wsp., 2004) 373

Korelacja pomiędzy badaniem anty-hcv a HCV RNA. Problemy interpretacyjne oznaczenie HCV RNA odnosi się do komórek jedno jądrza - stch krwi obwodowej (badania PBMC), czy tkanek, które mogą być miejscem replikacji czulszym niż surowica czy osocze. Szczegółowe badania morfologiczne przeprowadzone przez Aldonę Kasprzak i wsp. [7] wykazały w biopunktatach od chorych z przewlekłym zapaleniem wątroby typu C przede wszystkim zmiany w strukturze jąder hepatocytów, opisane po raz pierwszy: zmiany kształtu, obrzęk, hyperchromazję, zaburzenia struktury chromatynowej, zwiększenie liczby jąderek oraz uszkodzenia błony jądrowej. Amplifikacja, czyli namnożenie materiału genetycznego wi - ru sa umożliwia wykrycie już bardzo małej ilości cząsteczek wirusa w surowicy bądź osoczu. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w trakcie kilkugodzinnego pojedynczego procesu enzymatycznego pozwala na powielenie (amplifikację) do 10 6-10 9 razy wyjściowej kopii odpowiedniego fragmen tu DNA (po odwrotnej transkrypcji RNA) o długości od kilkunastu do kilkudziesięciu tysięcy par zasad. Każdy cykl w przy bli - żeniu podwaja liczbę segmentów docelowych DNA [20]. Grupa badana i metody Porównano wyniki testów serologicznych anty-hcv z badaniami HCV-RNA (metodą Real-Time PCR) wykonanych dla pacjentów Samodzielnego Publicznego Wojewódzkiego Szpi tala Zespolonego w Szczecinie, w latach 2009-2010. Badania molekularne były poprzedzone przez badania serologiczne, tj. jakościowe oznaczanie obecności przeciwciał anty-hcv w osoczu, bądź surowicy metodą immunoenzymatyczną (MEIA) w systemie AxSYM, firmy Abbott. Wynik każdego testu obliczany jest ze stosunku współczynnika próbki do współczynnika odcięcia S/CO = Sample rate/ Cutoff rate, czyli ze stosunku wartości natężenia fluorescencji badanej próbki do wartości natężenia fluorescencji punktu odcięcia (CO) dla każdej próbki badanej oraz próbki kontrolnej (wg metodyki producenta). Obecność lub brak przeciwciał anty-hcv w próbce określana jest poprzez porównanie wartości sygnału badanej próbki do sygnału dla wartości odcięcia (cutoff), określonej podczas uprzedniego przeprowadzania kalibracji. Próbki o wartościach S/CO<1 są uwa ża - ne jako ujemne. Jeżeli wartość sygnału badanej próbki jest większa lub równa wartości odcięcia, próbka taka uważana jest za anty-hcv dodatnią reaktywną (wg metodyki producenta). Materiał do badań serologicznych stanowiła surowica, uzyskana poprzez odwirowanie krwi żylnej pobranej do probówki bez antykoagulantu. Krew pełną przechowywano do czasu wykonania analizy w temp. 2-8 C. Badania wykonano w jednym powtórzeniu. Materiał do badań HCV-RNA stanowiło osocze, uzyskane poprzez odwirowanie krwi pełnej pobranej na antykoagulant EDTA. Osocze do czasu przeprowadzenia analizy przechowywano w sterylnych probówkach polipropylenowych w temp. -20 C (wg zaleceń producenta). Badania wykonano za pomocą testu Cobas AmpliPrep/Cobas Amplicor HCV v 2.0 firmy Roche Diagnostics. W teście tym wykorzystuje się odwrotną transkrypcję docelowego RNA do generacji komplementarnego DNA (cdna), amplifikację docelowego cdna na drodze PCR, oraz hybrydyzację kwasu nukleinowego do detekcji HCV-RNA w surowicy lub osoczu ludzkim. Izolacja wirusa, oraz odwrotna transkrypcja, ampfllikacja i detekcja odbywa się automatycznie w analizatorach COBAS AmpliPrep oraz Cobas Amplicor firmy Roche Diagnostics. Test umożliwia wykrycie RNA wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) w ludzkim osoczu, już od 10 IU/ml osocza. Z każdą serią próbek przebadane zostały dostarczone przez producenta kontrole ujemne i dodatnie, co weryfikuje poprawność przebiegu reakcji. Badania wykonywano w jednym powtórzeniu. Badania serologiczne i molekularne wykonywano z pojedynczego pobrania (badania molekularne z kolejnej próbki pobranej od tego samego pacjenta). Prowadzone badania nie obejmowały testów immunoblot, gdyż w Szczecinie nie wykonuje się testów potwierdzenia: RIBA anty-hcv. Przebadano 300 osób. W badaniach skoncentrowano się na pacjentach z grup szczególnych pacjenci z obniżoną odpornością (n=26), po przeszczepach narządowych, dializowani (n=150), z towarzyszącymi chorobami przewlekłymi (n=21). wzięto także pod uwagę pacjentów z oddziałów dziecięcych (n=86), oraz kandydatów do zawodowej służby wojskowej, którą stanowili młodzi mężczyźni, ze średnią wieku 28 lat (n=17). U dzieci rozpiętość wieku wynosiła od 4 m-cy do 17 lat. Jednocześnie porównano wielkość współczynników odcięcia S/CO między pacjentami. Wyniki Spośród przebadanych 300 osób zidentyfikowano 86 pa - cjen tów, u których wykryto przeciwciała anty-hcv w teście skriningowym a nie wykryto HCV-RNA w teście jakościowym metodą Real-Time PCR, oraz 4 osoby, u których nie wykryto przeciwciał anty-hcv a wykryto RNA wirusa w ba - daniach molekularnych. Wśród 23 z przebadanych 86 pacjentów oddziałów dziecięcych, oraz poradni hepatologicznych dziecięcych SPWSZ Szczecin nie wykryto HCV-RNA pomimo wykrycia przeciwciał anty-hcv o wartości współczynnika S/CO między 1,15 aż do 85,90 (wynik interpretowany jako dodatni). U 14 z tych 23 pacjentów stwierdzono przebyte WZW C (u siedmiorga dzieci matek z przebytym lub czynnym WZW C), u 4 pacjentów współistniejącą chorobą nowotworową (białaczka), u 2 pacjentów niedoczynność tarczycy, u 2 pacjentów choroby autoimmunologiczne (alergia,astma), oraz pojedynczo: histiocytoza X, zakażenie HSV, zakażenia CMV, zakażenie HBV, Toxoplazmoza, brak nerki, plastyka pęcherza, przepuklina rdzeniowa, AIH, inne choroby wielonarządowe. Niektóre z tych jednostek chorobowych współistniały ze sobą. Wśród 150 badanych pacjentów oddziałów Dializ, Nefrologii i Transplantologii SPWSZ Szczecin i innych ośrodków dializacyjnych u 26 nie wykryto HCV-RNA pomimo wystąpienia 374

A. Wierzbicka przeciwciał anty-hcv o wartości współczynnika S/CO między 1,01 aż do 70,12 (wynik interpretowany jako do - datni), gdzie u dwóch z nich stwierdzono przebyte WZW C, a u pięciu koinfekcję z WZW B. U pozostałych 19 pacjentów nie stwierdzono objawów klinicznych odpowiadających WZW C. U dwóch pacjentów wykryto natomiast HCV-RNA pomimo braku wykrycia przeciwciał anty-hcv (współczynnik S/CO: 0,20 i 0,34). Wśród 26 pacjentów oddziału Nabytych Niedoborów Immunologicznych u dwóch pacjentów nie wykryto HCV-RNA pomimo wystąpienia przeciwciał anty-hcv o wartości współ czynnika S/CO 3,03 i 3,02 (wynik interpretowany jako dodatni), gdzie u pacjenta nr 1 stwierdzono koinfekcję z WZW B u pacjenta nr 2 przebyte WZW B oraz prawdopodobnie przebyte WZW C. U dwóch pacjentów wykryto HCV RNA pomimo niewykrycia przeciwciał anty-hcv lub wykrycia przeciwciał anty-hcv o niskim współczynniku S/CO (współ czynnik S/CO odpowiednio: 0,62 i 1,27), gdzie u pacjenta nr 1 (koinfekcja HIV), współistniał głęboki niedobór odporności z liczbą limfocytów CD4<200 kom/µl, a u pacjenta nr 2 rzadki genotyp HIV 1 D (+), oraz CD 4<250 kom/µl. U trzech pacjentów Hepatologicznej Poradni Konsultacyjnej nie wykryto HCV-RNA pomimo wystąpienia przeciwciał anty-hcv o wartości współczynnika S/CO od 1,11 do 16,01 (wynik interpretowany jako dodatni): pacjent nr 1 (S/CO 16,01) po leczeniu WZW C, pacjent nr 2 (S/CO 2,20) łuszczyca, choroba autoimmunologiczna (pacjent przyjmował Prograf), pacjent nr 3 (S/CO 1,11) fałszywie dodatni wynik WR, toczeń (w trakcie diagnozy), Zespół Stevensa-Johnsona, rumień, nadwrażliwość w wywiadzie. W innych przypadkach: u 7 pacjentów z oddziału Hematologii i Onkologii nie wykryto HCV-RNA pomimo wystąpienia przeciwciał anty HCV o wartości współczynnika S/CO od 1,17 do 1,73 (wynik interpretowany jako dodatni) u 1 pacjentki nie wykryto HCV-RNA pomimo wykrycia przeciwciał anty-hcv (współczynnik S/CO 1,12) niepowodzenia naturalnego rozrodu (udane zapłodnienie in vitro). u 10 pacjentów nie wykryto HCV-RNA pomimo wykrycia przeciwciał anty-hcv (współczynniki S/CO od 1,11 do 9,0) wywiad w kierunku WZW C ujemny, dodatkowe badania laboratoryjne w kierunku chorób wątroby w normie. Wśród 17 badanych mężczyzn (kandydatów do służby wojsko wej) u 14 w badaniu przesiewowym wykryto przeciwciała anty-hcv (S/CO od 1,3-4,0) natomiast nie wykryto HCV-RNA. Dyskusja W diagnostyce WZW typu C z wyżej wymienionych metod rutynowo stosuje się testy serologiczne badania przesiewowe, oraz rzadziej testy metodami biologii molekularnej w jednostkach posiadających wyspecjalizowane pracownie oraz sprzęt badawczy. Tymczasem obie metody mają ograniczenia, wynikające z metodyki badań. Producenci testów przesiewowych podają w metodykach, iż żadna z obecnie dostępnych metod detekcji przeciwciał przeciw HCV nie daje 100% gwarancji wykrycia wszystkich potencjalnie zakaźnych jednostek we krwi lub zakażonych osobników. Negatywny wynik testu nie wyklucza możliwości ekspozycji na HCV lub samej infekcji. Z danych polskiej fundacji Pod prąd żółtej rzeki, skupiającej osoby zakażone WZW C wynika, iż jeden wynik ujemny oznaczenia HCV-RNA nie uprawnia do wykluczenia rozpoznania zakażenia lub potwierdzenia eliminacji wirusa u chorego na zapalenie wątroby typu C, zwłaszcza przy stwierdzonych przeciwciałach anty-hcv oraz podwyższonych aminotransferazach. W takim przypadku trzeba okresowo kontrolować aktywność ALT i powtarzać RT-PCR. Wiele źródeł podaje szereg czynników powodujących fał - szy wie dodatnie wyniki badań przesiewowych w kierunku wykrycia HCV: u pacjentów z obniżoną odpornością np. u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek, krioglobulinemią, w przebiegu szpiczaka mnogiego; w koinfekcji HIV, HBV; w przewlekłej białaczce limfatycznej i innych chorobach nowotworowych; w reumatoidalnym zapaleniu stawów; w autoimmunologicznym zapaleniu wątroby (AIH), oraz innych chorobach autoimmunologicznych (np. lupus erythematosus systemicus); w innych schorzeniach wątroby (hemosyderoza, hemochromatoza); w następstwie szczepienia przeciwko grypie; w przewlekłej sterydoterapii; u ciężarnych; w innych chorobach towarzyszących (wymaga dalszych badań); obserwuje się ponadto wiele reakcji krzyżowych z innymi antygenami. Ujemny wynik w teście przesiewowym anty-hcv w za leż - ności od wyniku testu na obecność wirusowego RNA może wykluczać infekcję HCV, jeśli HCV-RNA jest ujemny, co ma miejsce przede wszystkim u osób zdrowych, bez zaburzeń układu odpornościowego. Natomiast ujemny anty-hcv oraz dodatni HCV-RNA świadczą o czynnej infekcji wirusowej, prawdopodobnie u osoby z obniżoną odpornością. Dodatni wynik w teście skriningowym może potwierdzić czyn ną infekcję w zależności od wyników testów potwierdzenia czy oznaczenia HCV-RNA niemniej obserwuje się fałszywie dodatnie wynik testu ELISA z ujemnym HCV-RNA (tab. I) [5]. Duża grupa pacjentów posiada przeciwciała przeciwko HCV, jeszcze kilka lat po leczeniu/samowyleczeniu i ustąpieniu ob ja wów, wyjątkowo mogą się one utrzymywać przez całe życie. 375

Korelacja pomiędzy badaniem anty-hcv a HCV RNA. Problemy interpretacyjne Tabela I Interpretacja testów skriningowych anty-hcv i HCV-RNA w diagnostyce infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C. Wyniki badań ujemny ujemny anty-hcv HCV-RNA dodatni anty-hcv dodatni HCV-RNA ujemny HCV-RNA dodatni HCV-RNA Interpretacja Wykluczenie zakażenie HCV Potwierdzenie czynnej infekcji HCV (prawdopodobnie u osoby z zaburzeniami układu odpornościowego) Wykluczenie zakażenia HCV (prawdopodobnie fałszywie dodatni wynik testu anty-hcv), lub możliwość przebycia infekcji HCV Potwierdzenie czynnej infekcji HCV Powyższe wnioski znajdują odzwierciedlenie w badaniach własnych i dotyczą one ozdrowieńców oraz pacjentów dializo wanych, po przeszczepach narządowych, gdzie występu - je nieprawidłowe działanie układu odpornościowego. U niektórych chorych pomimo stwierdzenia obecności wirusa we krwi nie obserwuje się wytworzenia przeciwciał, co skutkuje fałszywie ujemnymi wynikami badań przesiewowych w kierunku wykrycia HCV. Powodem może być pozostawanie pacjenta w tzw. okienku serologicznym, czyli w okresie pomiędzy zainfekowaniem a wytworzeniem się przeciwciał trwa ono przeciętnie kilka miesięcy (najczęściej między 10 a 14 tygodniem od zakażenia), a poszczególni pacjenci wykazują dość znaczne różnice w szybkości wytworzenia się tych przeciwciał. U części osób zakażonych zachodzi zjawisko serokonwersji, tj. poziom przeciwciał spada poniżej progu wykrywalności [5]. U pewnej grupy chorych nigdy nie dochodzi do wytworzenia się anty-hcv, np. u pacjentów immunosupresyjnych, części dializowanych, z agammaglobulinemią. Problem diagnostyczny stanowią więc chorzy, u których nie są wytwarzane przeciwciała anty- HCV np. z powodu nieprawidłowej czynności układu odpornościowego. Osoby takie, choć faktycznie zakażone, nie są wyłapywane w badaniach epidemiologicznych [9]. W badaniach własnych brak wykrycia przeciwciał anty-hcv zaobserwowano u pacjentów zakażonych wirusem HIV, z uwagi jednak na małą ilość badanych pacjentów nie są to wartości istotnie statystycznie. W badaniach autorów bydgoskich u dzieci z zakażeniami mieszanymi HBV i HCV wykazano, iż częstość serokonwersji w układzie HBeAg/anty-Hbe (utrata antygenu HBe i pojawienie się we krwi przeciwciał Anty-HBe) występowała istotnie statystycznie częściej po nadkażeniu HCV, niż u nie leczonych dzieci z WZW B. Można przypuszczać, że nadkażenie HCV mobilizuje układ immunologiczny na drodze uruchomienia kaskady cytokin [10]. Ciekawą grupę stanowią także przytoczeni w artykule młodzi mężczyźni (roczniki 1968-1985) żołnierze lub kandydaci do służby wojskowej (skierowani z Terenowej Wojskowej Ko - misji Lekarskiej), u których pomimo wystąpienia przeciwciał anty-hcv nie stwierdzono cech ostrego, przewlekłego lub przebytego WZW C, obecnie lub w wywiadzie, a wyniki badań laboratoryjnych i przedmiotowych nie odbiegały od normy (u jednego pacjenta stwierdzono alergię w testach skórnych). Po wykonaniu badań HCV-RNA oraz pełnej diagnostyki w kierunku chorób wątroby wszyscy zostali sklasyfikowani przez lekarza orzekającego jako w pełni zdolni do zawodowej służby wojskowej z adnotacją w dokumentacji medycznej o nosicielstwie nieswoistych przeciwciał. Brak prawidłowo przeprowadzonej pełnej diagnostyki w takich przypadkach może skutkować uznaniem kandydata jako niezdolnego do służby wg 44 pkt. 9 (Dz. Ust. Nr 146 z dnia 16.12.1995 r.). W przypadku kandydata do ubezpieczenia na życie prawidłowa interpretacja badań serologicznych w kierunku wirusowego zapalenia wątroby typu C może prze są - dzać o warunkach ubezpieczenia lub odrzuceniu wniosku. Powyższa wiedza może pozwolić na uniknięcie niepotrzebnej stygmatyzacji pacjentów jeszcze przed postawieniem ostatecznej diagnozy a co za tym idzie daje możliwość nie wdrażania pochopnie niepotrzebnego leczenia, czy kosztownych procedur medycznych. Ponieważ u części pacjentów brak jest świadomości, co do możliwości bycia nosicielem WZW C (zasada mnie to nie dotyczy ), oraz objawy są niespecyficzne i trudne do przypisania WZW C, pacjent nie trafia do specjalisty, którego wiedza, doświadczenie i możliwości pozwolą na zdiagnozowanie choroby. W wielu przypadkach testy laboratoryjne dają sprzeczne wyniki, a diagnostyka jest niepełna lub/i oparta często tylko na badaniach przesiewowych, lub innych niespecyficznych dla WZW C testach laboratoryjnych (np. ALT, AST, GGTP, ALP, LDH, BIL). Ponadto wielu pacjentów nie reaguje na obecnie stosowane leczenie (w zależności od stanu pacjenta, przewlekłości choroby, genotypu wirusa itp.) albo nie kończy leczenia z powodu zbytniego nasilenia skutków ubocznych. W Polsce i na świecie prowadzono wiele badań dotyczących korelacji pomiędzy badaniami serologicznymi a molekularnymi u różnych grup osób, przy czym skupiono się w nich także na wielkości współczynnika S/CO testu przesiewowego. Oszacowanie wyniku ilościowego anty-hcv wyra - żonego jako proporcja S/CO daje dodatkowe istotne informacje, np. wszystkie wyniki wysoko dodatnie (S/CO>8) znajdują potwierdzenie w teście RIBA [5]. Przykładami takich badań są badania Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie z 2005 r. [11]. HCV-RNA wykryto u 18% dawców krwi z przeciwciałami anty-hcv. Częstość wykrywania HCV-RNA zależała od wartości S/CO testu przesiewowego. Przy wartości współczynnika S/CO>4,0 HCV-RNA wykryto u 65% osób. Niskie wartości S/CO w teście EIA szczególnie w populacji o niskim ryzyku zakażenia, jaką jest grupa dawców krwi, z dużym prawdopodobieństwem reprezentują tzw. wyniki fałszywie dodatnie (tzw. BFP). Wśród przyczyn wymienia się szczepienia przeciwko grypie czy obecność autoprzeciwciał. Do podobnych wniosków 376

A. Wierzbicka doszli Zofia Moraczewska i wsp. [12] badając HCV-RNA wśród polskich dawców krwi oraz preparatach osoczopochodnych. W badaniach poza krajem na uwagę zasługują badania indyjskie. W badaniach tych ustalony został algorytm postępowania z dawcami krwi w bankach krwi w bankach krwi. Jeśli dawcy mieli dodatni wynik testu przesiewowego wg autorów powinni być oni poinformowani w banku krwi o wy - so kim odsetku wyników fałszywie dodatnich, oraz o znaczeniu alternatywnych badań w wyspecjalizowanym laboratorium. W przypadku pozytywnego badania dawcy w drugim ośrodku powinien on być skierowany do hepatologa celem dalszej diagnostyki, w tym na dodatkowe testy anty-hcv i HCV-RNA. Negatywne lub niejasne wyniki badań testów immunoblot wymagałyby badania RNA. Badania indyjskie ujawniły wysoki poziom fałszywie dodatnich wyników badań przesiewowych wśród dawców krwi. Spośród 57 próbek pozytywnych z banku 23 próbki (45%) dały wynik badania negatywny krwi zarówno w teście MEIA AxSYM HCV (Abbott) jak i w teście potwierdzenia LIA (INNO-LIA HCV Ab III, Innogenetics) [13]. Także w badaniach amerykańskich Robert Dufour i wsp. [14] w programie badawczym przebadali 17418 pacjentów. 2986 (17,1%) próbek było anty-hcv pozytywnych a 490 (16,4%) miało współczynnik S/CO <3,7 (tzw. nisko pozytywny ). Wykorzystano testy przesiewowe III generacji anty-hcv (Ortho Clinical Diagnostics). Test RIBA wykonano u 263 pacjentów z wynikiem nisko pozytywnym. Wyniki: 86% ujemne, 12% nieokreślony, a tylko 2% pozytywny. Zwrócono uwagę, iż współczynnik S/CO jest ważny w oszacowaniu ryzyka infekcji. Laboratorium powinno raportować współczynnik S/CO wraz z rezultatami testu anty-hcv EIA i zlecać uzupełniające testy RIBA w przypadku uzyskania nisko pozytywnej wartości testu przesiewowego, aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie. W badaniach meksykańskich analizując wyniki badań daw - ców krwi autorzy doszli do wniosków, iż bardzo niski poziom przeciwciał anty-hcv jest czynnikiem predykcyjnym fałszywie dodatnich rezultatów badań [15]. Do podobnych wniosków doszli badacze z Turcji i Chin [17,18]. Wnioski Diagnostyka WZW C jest często trudna a wyniki badań niejednoznaczne. Wiąże się to z występowaniem nietypowych grup pacjentów, np. dializowanych, po przeszczepach, z wrodzonymi/nabytymi niedoborami odporności, lub z to wa - rzyszącymi innymi jednostkami chorobowymi. W celu stwierdzenie bądź wykluczenia WZW C u nietypowych grup pacjentów: dializowanych, po przeszczepach, z wrodzonymi lub nabytymi niedoborami odporności, bądź towarzyszącymi innymi chorobami należy stosować pełen panel badawczy, tj. testy przesiewowe (poziom przeciwciał anty-hcv), testy potwierdzenia (metody immunoblot), testy molekularne (oznaczenie HCV-RNA), oraz testy biochemiczne mierzące poziom enzymów wątrobowych. Należy zawsze pamiętać o możliwości wystąpienia wyników fałszywie dodatnich bądź ujemnych w testach przesiewowych, gdzie powyższe wyniki nie zostają potwierdzone w metodach Western Blot lub diagnostyką molekularną. Współczynnik S/CO testu przesiewowego anty-hcv może być pomocny w oszacowaniu ryzyka infekcji. Piśmiennictwo 1. Stefan Mauss, Jurgen K. Rockstroh, Hans Jager: Zapalenie wątroby a zakażenie HIV; Urban & Partner, Wydanie I polskie, Wrocław 2004:1-6 2. Szczeklik A, Gajewski P. rozdz. Choroby wątroby; Choroby wewnętrzne. Medycyna Praktyczna, Kraków, Wydanie I; 2009: 514-523 3. Jabłońska J, Ząbek J, Loch T i wsp. Krioglobulinemia u chorych zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu C. Część I wybrane aspekty kliniczne. Hepatol Pol 1999; 6: 165-170. 4. Magdzik W. Epidemiologia wirusowych zapaleń wątroby typu B i C w Polsce, z uwzględnieniem dzieci. Hepatol Pol 1997; 4 (supl.1): 5-9 5. Madaliński K. Badania przeglądowe zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu C; Abbott Voice 2009; 2: 3-6 6. Jabłońska J, Ząbek J, Madaliński K i wsp. Pozawątrobowe objawy zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C, Reumatologia 2009; 47: 364-367 7. Kasprzak A, Biczysko W, Adamek A i wsp. Morphological lesions detected by light and electron microscopes in chronic type B hepatitis. Pol J Pathol 2003; 54: 129-142. 8. Majerowicz S, Grief C, Ferguson D i wsp. In situ hybridization of hepatitis C virus RNA in liver cells of an experimentally infected rhesus macaque. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2004; 99: 629-631. 9. Wawrzynowicz-Syczewska M. Diagnostyka Serologiczna Za ka - żeń Wirusami Hepatotropowymi. Abbott Voice 2005; 3(12): 3-9 10. Pawłowska M, Halota W. Zakażenia mieszane HBV i HCV u dzieci z uwzględnieniem badań własnych. Przeg Epidemiol. 2003; 57: 459-464. 11. Brojer E. Badania serologicznych i molekularnych markerów HCV u dawców krwi w Polsce. Przeg Epidemiol. 2005; 59: 511-517. 12. Moraczewska Z i wsp. Wykrywanie RNA HCV wśród polskich dawców krwi oraz preparatach osoczopochodnych. Acta Haematologica Polonica 2000; 31: 391-397. 13. Raghuraman S, Subramaniam T, Daniel D i wsp. Occurrence of False Positives during Testing for Antibodies to Hepatitis C Virus among Volunteer Blood Donors in India. Journal of Clinical Microbiologyl 2003; 4: 1788-1790. 14. Dufour R D, Talastas M, Fernandez M i wsp. Low-Positive Anti- Hepatitis C Virus Enzyme Immunoassay Results: An Important Predictor of Low Likelihood of Hepatitis C Infection. Clinical Chemistry 2003; 49: 479-486. 15. Contreras AM, Mendez C i wsp. Very low hepatitis C antibody levels predict false-positive results and avoid supplemental testing. Transfusion 2008 Dec; 48: 2540-2548. 16. Madaliński K, Godzi P, Zimmermann-Górska I i wsp. Anty-HCV oraz HCV-RNA u chorych z pierwotnym zespołem Sjögrena. Przegl Epidemiol 2009; 63: 299-304. 17. Klesi R, Ozdemir M, Kurtoglu MG i wsp. Evaluation and comparison of three different anti-hepatitis C virus antibody test based on chemiluminescence and enzyme-linked immunosorbent assay methods used in the diagnosis of hepatitis C infections in Turkey. J Int Med Res 2009 sep-oct; 37: 1420-1429. 18. Rao HY, Ren FR, Guan WL i wsp. Evaluation of the performance of the Eiagen HCV test for detection of hepatitis C virus infection. J Virol Methods 2009; 162: 203-207. 19. Patel K i wsp. Diagnosis and treatment of chronic hepatitis C infection. BMJ 2006, 332: 1013-1017. 20. Bartkowiak J. Badania Molekularne w rozpoznawaniu i różnicowaniu chorób zakaźnych. Przegl Epidemiol 2003; 57:381-389. 377

Korelacja pomiędzy badaniem anty-hcv a HCV RNA. Problemy interpretacyjne Adres do korespondencji: Laboratorium Centralne Samodzielny Publiczny Szpital Zespolony Ul. Arkońska 4, 71-455 Szczecin Tel. (91) 813 95 85 e-mail: wierzbicka@spwsz.szczecin.pl (Praca wpłynęła do Redakcji: 2011-01-10) (Praca przekazana do opublikowania: 2011-02-06) 378