IDENTYFIKACJA I OCENA FUNKCJONALNA KOMÓREK NKT.

IDENTYFIKACJA I OCENA FUNKCJONALNA KOMÓREK NKT. Justyna Woś 1, Agnieszka Bojarska-Junak 1 1 Uniwersytet Medyczny, Lublin STRESZCZENIE Komórki NKT (natural killer T cells) stanowią specyficzną subpopulację limfocytów T wykazującą zarówno ekspresję markerów charakterystycznych dla limfocytów T, jak też typowych dla komórek NK. Liczne funkcje regulacyjne, a także efektorowe oraz unikalna zdolność do rozpoznania antygenów lipidowych zarówno komórek prawidłowych, jak też nowotworowych czy patogenów sprawia, iż komórki NKT odgrywają istotną rolę w odpowiedzi immunologicznej w przebiegu różnego rodzaju infekcji, nowotworów oraz wielu innych chorób. W związku z tym istotne znaczenie ma dokładna ocena ilościowa jak też jakościowa tej niewielkiej populacji komórkowej. Głównym narzędziem wykorzystywanym do identyfikacji komórek NKT jest wieloparametrowa cytometria przepływowa. SŁOWA KLUCZE: NKT, Cytometria przepływowa WSTĘP W ostatnich latach poczyniono istotny postęp w poznaniu cech immunofenotypowych i czynnościowych subpopulacji komórek NKT. Większość informacji na temat tej populacji komórek pochodzi z badań na myszach, jednak cechy fenotypowe i czynnościowe, a także mechanizmy odpowiedzialne za różnicowanie komórek NKT wydają sie podobne u obu gatunków [1,2,3]. Limfocyty NKT są niewielką grupą komórek stanowiącą we krwi od 0,01% do 1% (średnio około 0,1%) subpopulacji limfocytów T [4,5,6]. Jak na tak małą populację komórek, komórki NKT mają niezwykle wszechstronny i decydujący wpływ na wiele składowych układu odpornościowego, a także odpowiedź immunologiczną. Wydaje się, że komórki NKT działają w fazie pośredniej pomiędzy układami odporności wrodzonej i nabytej. Ponadto, przypisuje się im funkcje zarówno komórek regulatorowych, jak też efektorowych układu immunologicznego. 1

Komórki NKT są subpopulacją komórek Tɑβ, wykazującą koekspresję receptorów limfocytów T (TCR) i markerów charakterystycznych dla klasycznych komórek NK (CD161, CD56). W odróżnieniu od konwencjonalnych limfocytów T rozpoznających cząsteczki MHC klasy I i MHC klasy II, które prezentują antygeny peptydowe, komórki NKT wykazują zdolność rozpoznawania cząsteczek CD1d [1,7]. Ta monomorficzna cząsteczka prezentuje antygeny o charakterze lipidów i glikolipidów [8,9]. Dlatego też komórki NKT wypełniają lukę w repertuarze antygenów rozpoznawanych przez konwencjonalne limfocyty T. Ponadto NKT cechuje zdolność do szybkiego wydzielania cytokin przez co przyczyniają się do pobudzenia innych komórek układu immunologicznego - komórek NK, makrofagów, neutrofili, limfocytów B, a także typowych limfocytów T [10,11]. Aktywowane komórki NKT wydzielają cytokiny IL-4, IL-5 i Il-10 charakterystyczne dla limfocytów Th2 biorących udział w odpowiedzi humoralnej oraz IFN- i TNF, cytokiny charakterystyczne dla limfocytów Th1, biorących udział w odpowiedzi komórkowej. Ponadto, komórki NKT wykazują aktywność cytolityczną, ze względu na wysoki poziom perforyny, granzymu B, TRAIL oraz ligandu receptora FAS. Przyczyniają się w ten sposób do eliminacji komórek docelowych [6,11]. Liczne funkcje regulacyjne, a także efektorowe oraz unikalna zdolność do rozpoznania antygenów lipidowych zarówno komórek prawidłowych jak też guzów czy patogenów sprawia, iż komórki NKT odgrywają istotną rolę w odpowiedzi immunologicznej w przebiegu różnego rodzaju infekcji, nowotworów oraz wielu innych chorób [12]. Komórki NKT typu I "Klasyczne" komórki NKT (komórki NKT typu I, inkt) podlegają restrykcji CD1d oraz wykazują wyjątkową zdolność odpowiadania na stymulację ɑ-galaktozyloceramidem (ɑ-galcer). α-galcer otrzymany z gąbek morskich Agelas mauritianus był pierwszym opisanym ligandem klasycznych komórek NKT, zdolnym do indukcji ich proliferacji oraz wytwarzania cytokin. Komórki te charakteryzują się ekspresją łańcucha TCRɑ o stałej budowie: Vɑ24Jɑ18 u człowieka i Vɑ14Jɑ18 u myszy, a także ograniczonej liczbie łańcuchów β: Vβ11 u człowieka oraz Vβ8, Vβ7 i Vβ2 u myszy. Wykazano, że ludzkie komórki NKT typu I można podzielić na CD4+CD8, CD4 CD8+ lub podwójnie ujemne CD4 CD8 [1,10,13]. Komórki NKT typu II Komórki NKT typu II ("nieklasyczne" komórki NKT) stanowią drugą grupę subpopulacji komórek NKT, która również podlega restrykcji CD1d, 2

jednak w odróżnieniu od komórek NKT typu I, komórki NKT typu II nie odpowiadają na stymulację ɑ-galcer [14,15,16] Ponadto subpopulacja ta posiada heterogenny repertuar łańcuchów TCR oraz nie wykazuje ekspresji "klasycznych" łańcuchów TCRɑ Vɑ24- Jɑ18 u człowieka i Vɑ14-Jɑ18 u myszy [14]. IDENTYFIKACJA I OCENA FUNKCJONALNA KOMÓREK NKT Podstawowym krokiem w dokładnej analizie funkcjonalnej oraz czynnościowej komórek NKT jest ich precyzyjna identyfikacja. Jednakże, ocena tej subpopulacji komórek jest znacznie utrudniona głównie ze względu na niski odsetek komórek NKT. Z uwagi na brak wiedzy o specyficznych markerach, jak też fizjologicznych funkcjach komórek NKT typu II są one znacznie słabiej poznane. W większości dostępnych prac oceniana jest subpopulacja komórek inkt (NKT typu I), będąca obecnie jedynym rodzajem komórek NKT, który może zostać zidentyfikowany na podstawie budowy i swoistości receptorów TCR [15,16]. Jedną z powszechnych metod identyfikacji komórek NKT jest wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych anty-vα24 (klon C15) i anty-vβ11 (klon C21) [17,18]. Przeciwciała te charakteryzują się bardzo niskim nieswoistym barwieniem tła, jednak ich zastosowanie nie umożliwia podziału komórek NKT na poszczególne typy (komórki NKT typu I i NKT typu II) [19,20]. Istotny postęp w badaniu komórek NKT typu I, stanowił rozwój tetramerów CD1d naładowanych ɑ-galcer. Umożliwiło to jednoznaczne określenie klasycznych komórek NKT na podstawie samej reaktywności z CD1d/ɑ- GalCer, niezależnie od innych markerów fenotypowych [10,15,16] (Rycina 1). Liczne prace wskazują jednak, że tetramery α-galcer/cd1d mogą niespecyficznie wiązać się z limfocytami B. W związku z tym zaleca się zastosowanie przeciwciał anty-cd19 w celu wyeliminowania komórek niespecyficznie wyznakowanych α-galcer/cd1d [4,5]. Rycina 1. Identyfikacja komórek inkt za pomocą tetramerów α-galcer/cd1d (PROIMMUNE). 3

Przeciwciało monoklonalne inkt (klon 6B11) reaguje z unikalną determinantą w regionie CDR3 niezmiennego łańcucha TCR (Vα24Jα18) komórek inkt [19,21]. Zatem zastosowanie przeciwciała 6B11 samodzielnie, czy też w połączeniu z anty- Vβ11 i/lub anty-cd3 wydaje się doskonałym narzędziem do analizy klasycznych komórek NKT (Rycina 2). Rycina 2. Przykładowy obraz z cytometru przepływowego przedstawiajacy identyfikację komórek inkt za pomocą przeciwciała monoklonalnego anty-inkt (anty-vα24-jα18, klon 6B11) (BD Pharmingen). Ze względu na fakt, że niezmienny łańcuch Vα24 jest połączony tylko z łańcuchem Vβ11, mało prawdopodobne jest rozpoznanie innych komórek niż inkt przez przeciwciało 6B11 wśród limfocytów. W celu oceny funkcjonalnej oraz stopnia dojrzałości komórek NKT stosuje sie przeciwciało anty-cd161. Ekspresja antygenu NK1.1 (CD161) świadczy o pełnej dojrzałości komórek NKT. Obwodowe i grasicze komórki NKT NK1.1- (CD161-) są zwykle traktowane jako niedojrzałe [8,22,23,24]. Należy podkreślić, iż markery komórek NK mogą również występować na niektórych konwencjonalnych limfocytach T ocena tych receptorów na komórkach CD3 nie może być podstawą identyfikacji komórek NKT. Tak jak już wspomniano wcześniej cechą charakterystyczną komórek NKT jest zdolność do gwałtownej i szybkiej sekrecji cytokin IFN- i IL-4 oraz IL-2, -5, -6, -10, -13, -17, TNF, TGF-β i GM-CFS [8,25]. Cytokiny odgrywają kluczową rolę w reakcjach odpornościowych, reakcjach zapalnych, w procesach rozwoju, regeneracji i utrzymania homeostazy tkanek, a także aktywacji różnych komórek układu immmunologicznego. Dlatego istotne znaczenie może mieć ocena wewnątrzkomórkowej ekspresji cytokin w komórki NKT oraz ocena zdolności wydzielania cytokin przez te komórki. Dostępnych jest wiele metod mierzących ilość wydzielonej cytokiny np. test immunoenzymatyczny ELISA, ELISPOT. Znaczenie mogą mieć także metody oceniające ekspresję cytokin na poziomie mrna. Analiza cytometryczna daje możliwość oceny populacji komórek odpowiedzialnych za wydzielanie badanej cytokiny. Dzięki zastosowaniu mieszaniny znaczników immunofluorescencyjnych rozpoznających powierzchniowe oraz 4

wewnątrzkomorkowe antygeny możliwa jest analiza określonej populacji komórek, w tym komórek NKT. Metoda ta pozwalam na ocenę zdolności tych komórek do wytwarzania cytokin bez konieczności pracochłonnej separacji. Równie istotna jest ocena zdolności komórek NKT do wykazywania efektu cytotoksycznego. Aktywność cytolityczna komórek NKT zbliżona jest do aktywności komórek NK i polega ona na uczynnieniu układów generujących perforynę, granzymy i ligand receptora FAS [26]. Oceny takiej można dokonać metodą cytometrii przepływowej za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-granzym A (klon CB9) oraz anty-perforyna (klon dg9). Komórki NKT stanowią małą populację komórek, jednak przypisuje się jej duży wpływ na cały układ immunologiczny, głównie ze względu na zdolność wpływania na inne ważne elementy układu odpornościowego. Pomimo licznych badań komórki NKT wciąż nie są w pełni poznane. W świetle powyższych informacji istotne znaczenie ma dokładna ocena zarówno funkcjonalna, jak też czynnościowa komórek NKT. PIŚMIENNICTWO 1. Terabe M, Berzofsky JA. The role of NKT cells in tumor immunity. Adv Cancer Res. 2008; 101: 277-348. 2. Godfrey DI, Stankovic S, Baxter AG. Raising the NKT cell family. Nat Immunol. 2010; 11: 197 206. 3. van den Heuvel MJ, Garg N, Van Kaer L, Haeryfar SM. NKT cell costimulation: experimental progress and therapeutic promise. Trends Mol. Med. 2011; 17: 65 77. 4. Kita H, Naidenko OV, Kronenberg M, Ansari AA, Rogers P, He XS, Koning F, Mikayama T, Van De WJ, Coppel RL, Kaplan M, Gershwin ME. Quantitation and phenotypic analysis of natural killer T cells in primary biliary cirrhosis using a human CD1d tetramer. Gastroenterology. 2002; 123: 1031-1043. 5. Lee PT, Benlagha K, Teyton L, Bendelac A. Distinct functional lineages of human V(alpha)24 natural killer T cells. J Exp Med. 2002; 195: 637-641. 6. Gumperz JE, Miyake S, Yamamura T, Brenner MB. Functionally distinct subsets of CD1d-restricted natural killer T cells revealed by CD1d tetramer staining. J Exp Med. 2002; 195: 625-636. 7. Godfrey DI, Kronenberg M. Going both ways: immune regulation via CD1d-dependent NKT cells. J Clin Invest. 2004; 114: 1379-1388. 5

8. Bendelac A, Savage PB, Teyton L. The biology of NKT cells. Annu Rev Immunol. 2007; 25: 297-336. 9. Brutkiewicz RR. CD1d ligands: the good, the bad, and the ugly. J Immunol. 2006; 177: 769-775. 10. Matsuda JL, Mallevaey T, Scott- Browne J, Gapin L. CD1drestricted inkt cells, the 'Swiss- Army knife' of the immune system. Curr Opin Immunol. 2008; 20: 358-368. 11. Wu L, Gabriel CL, Parekh VV, Van Kaer L. Invariant natural killer T cells: innate-like T cells with potent immunomodulatory activities. Tissue Antigens. 2009; 73: 535-545. 12. Masaki T and Berzofsky JA. The Role of NKT Cells in Tumor Immunity. Adv Cancer Res. 2008; 101: 277 348. 13. Ishihara S, Nieda M, Kitayama J, Osada T, Yabe T, Ishikawa Y, Nagawa H, Muto T, Juji T. CD8(+)NKR-P1A (+)T cells preferentially accumulate in human liver. Eur. J. Immunol. 1999; 29: 2406 2413. 14. Godfrey DI, MacDonald HR, Kronenberg M, Smyth MJ, Van Kaer L. NKT cells: what's in a name? Nat Rev Immunol. 2004; 4: 231-237. 15. Matsuda JL, Naidenko OV, Gapin L, Nakayama T, Taniguchi M, Wang CR, Koezuka Y, Kronenberg M. Tracking the response of natural killer T cells to a glycolipid antigen using CD1d tetramers. J Exp Med. 2000; 192: 741-754. 16. Benlagha K, Weiss A, Beavis A, Teyton L, Bendelac A. In vivo identification of glycolipid antigenspecific T cells using fluorescent CD1d tetramers. J Exp Med. 2000; 191: 1895-1903. 17. Harner S, Noessner E, Nadas K, Leumann- -Runge A, Schiemann M, Faber FL, Heinrich J, Krauss- Etschmann S. Cord blood Vα24- Vβ11 natural killer T cells display a Th2-chemokine receptor profile and cytokine responses. PLoS One. 2011; 6:e15714. 18. Spada FM, Koezuka Y, Porcelli SA. CD1d- -restricted recognition of synthetic glycolipid antigens by human natural killer T cells. J Exp Med. 1998; 188:1529-1534. 19. Thomas SY, Hou R, Boyson JE, Means TK, Hess C, Olson DP, Strominger JL, Brenner MB, Gumperz JE, Wilson SB, Luster AD. CD1d-restricted NKT cells express a chemokine receptor profile indicative of Th1-Type inflammatory homing cells. J Immunol. 2003; 171: 2571-2580. 20. Kent SC, Hafler DA, Strominger JL, Wilson SB. Noncanonical Valpha24JalphaQ T cells with 6

conservative alpha chain CDR3 region amino acid substitutions are restricted by CD1d. Hum Immunol. 1999; 60: 1080-1089. 21. Boyson JE, Rybalov B, Koopman LA, Exley M, Balk SP, Racke FK, Schatz F, Masch R, Wilson SB, Strominger JL. CD1d and invariant NKT cells at the human maternalfetal interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99: 13741-13746. 22. Crowe NY, Uldrich AP, Kyparissoudis K, Hammond KJ, Hayakawa Y, Sidobre S, Keating R, Kronenberg M, Smyth MJ, Godfrey DI. Glycolipid antigen drives rapid expansion and sustained cytokine production by NK T cells. J. Immunol, 2003; 171: 4020 4027. 23. Harada M, Seino K, Wakao H, Sakata S, Ishizuka Y, Ito T, Kojo S, Nakayama T, Taniguchi M. Downregulation of the invariant Va14 antigen receptor in NKT cells upon activation. Int. Immunol. 2004; 16: 241 247. 24. McNab FW, Pellicci DG, Field K, Besra G, Smyth MJ, Godfrey DI, Berzins SP. Peripheral NK1.1 NKT cells are mature and functionally distinct from their thymic counterparts. J. Immunol. 2007; 179: 6630 6637. 25. Sakuishi K, Oki S, Araki M, Porcelli SA, Miyake S, Yamamura T. Invariant NKT cells biased for IL-5 production act as crucial regulators of inflammation. J. Immunol. 2007; 179: 3452 3462. 26. Leite-de-Moraes MC, Herbelin A, Gouarin C, et al. Fas/Fas ligand interactions promote activationinduced cell death of NK T lymphocytes. J Immunol. 2000; 165:4367-71. 7