(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1767221. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 05.07.2005 05761917.

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1767221 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 05.07.2005 05761917.3 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 47/48 (2006.01) A61P 25/36 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 21.08.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/34 EP 1767221 B1 (54) Tytuł wynalazku: Wytwarzanie i zastosowanie biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny (30) Pierwszeństwo: 07.07.2004 MX PA04006617 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 28.03.2007 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/13 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 28.02.2014 Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/02 (73) Uprawniony z patentu: INSTITUTO NACIONAL DE PSIQUIATRÍA RAMÓN DE LA FUENTE MUÑIZ, México, MX (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1767221 T3 BENITO ANTÓN PALMA, México, MX PHILIPPE LEFF GELMAN, México, MX (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

Opis [0001] Wynalazek otrzymał wsparcie i naukową pomoc od dr Gerardo Heinze Martin i Dr Ramon de la Fuente Muñiz. Praca finansowana przez Fundacion Gonzalo del Rio Arronte i Instituto Nacional de Psiquiatria Ramón de la Fuente Muñiz (Grant 2040). DZIEDZINA TECHNIKI [0002] Ujawniony jest sposób wytwarzania i zastosowania biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny, która, przez aktywną immunizację ssaków, w tym człowieka, jest zdolna do wywołania silnej humoralnej odpowiedzi odpornościowej przeciwko tym dwóm opiatowym narkotykom uzależniającym. Sposób wytwarzania takiej biwalentnej szczepionki składa się z zaprojektowania, syntezy, oczyszczania, stosowania i terapeutycznej walidacji. Formulacja strukturalna tej szczepionki obejmuje wstępną syntezę i haptenizację pośredniej pochodnej, morfino-6-hemibursztynianu, z toksoidem tężcowym stosowanym jako białko nośnikowe. Ten ostatni chemiczny etap jest przeprowadzany z zastosowaniem długiego ramienia linkera kolejno syntetyzowanego w procesie kondensacji kowalencyjnej homobifunkcyjnego odczynnika sieciującego, 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) i heterobifunkcyjnego odczynnika sieciującego estru N-(ε-trifluoroacetylokaproiloksy)-sukcynimidu (TFC). Humoralna odpowiedź odpornościowa indukowana przez aktywną immunizację taką szczepionką charakteryzowała sie bardzo wysokimi podtrzymywanymi mianami krążących przeciwciał poliklonalnych, które we krwi rozpoznają i wiążą się z taką samą specyficznością zarówno z morfiną jak i z heroiną, zapobiegając w ten sposób przenikaniu przez barierę krewmózg do mózgu. Zmieniona farmakokinetyka obu narkotyków prowadzi do znacznego zmniejszenia "wolnej", niezwiązanej frakcji morfiny i heroiny w osoczu, tym samym osłabiając wejście narkotyku do mózgu. Tak więc antagonizm przeciwciała na przenikanie przez opiaty bariery mózgowej zwiększa immunoochronny mechanizm, który osłabia efekt wzmacniający narkotyku opartego na tych dwóch substancjach opioidowych działających na mezokortykolimbicznym- szlaku nagrodzania u aktywnie szczepionych tym immunogenem gryzoni, wcześniej wyszkolonych do samopodawania tych dwóch farmakologicznych wzmacniaczy. Zatem,w niniejszym wynalazku opisano sposób wytwarzania biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny / heroiny, która stanowi nowy immunoreagent lub kompozycję farmaceutyczną lub formulację leczniczą, które mogą być stosowane, ocenione i zwalidowane jako nowa immunofarmakologiczna terapia antyuzależnieniowa przeciwko tym dwóm narkotykom opiatowym w protokołach szczepień aktywnych u ludzi. TŁO WYNALAZKU [0003] Nadużycie nielegalnych substancji o wzmacniających właściwościach uzależniających stanowi istotny problem zdrowia publicznego na całym świecie. Na przykład, w Stanach Zjednoczonych Ameryki, w ciągu jednego roku, prawie 48 mln ludzi zostało narażonych na nielegalne narkotyki (Neurobiological Adaptations to Psychostimulants and opiates as basis of treatment development. In: New Medications for Drug Abuse, K. Severino, A. Olivito and T. Kosten, 2000). Zatem, ten problem zdrowotny, ma poważne i progresywnie szko- 1

dliwe działanie społeczne, ekonomiczne i medyczne na obszarach państw nim dotkniętych. Epidemiologicznie, psychostymulanty takie jak kokaina i amfetamina, a także w mniejszym stopniu, substancje opiatowe, jak heroina i morfina, stanowią najbardziej rozpowszechnione narkotyki powodujące najwyższą zachorowalność na chorobę uzależnieniową na całym świecie. W krajach rozwijających się, takich jak Meksyk, dane epidemiologiczne z najnowszych Narodowych Badań Uzależnień (M. E. Medina-Mora and E. Rojas Guiot, Salud Mental, 26(2): 1-11, 2003) donosiły o alarmującym wzroscie spożycia takich substancji narkotycznych w centralnej części kraju oraz w miastach znajdujących się na granicy pomiędzy Meksykiem i USA. Na poziomie klinicznym jest kilka współistniejących schorzeń, związanych z nadużywaniem nielegalnych substancji, które należą do różnych kategorii. Po pierwsze, wysoki wskaźnik zgonów związanych z toksycznymi efektami wywołanymi przedawkowaniem tych substancji. Po drugie, indukcja działań teratogennych u noworodków, które są często związane z przewlekłym nadużywaniem nielegalnych substancji przez uzależnione ciężarne matki. Wreszcie, wysoka częstość występowania współistniejących chorób z grupy nabytych infekcji wirusowych, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności (HIV), często wykrywany u nadużywających heroiny, jak również wzrost wskaźników przestępstw, przemocy i przestępczości, często związanych z handlem narkotykami i spożyciem takich nielegalnych substancji narkotycznych. Tak więc, na poziomie terapeutycznym, istnieje nagląca potrzeba skoncentrowania się i ustalenia jasnych strategii rządowych, programów zdrowotnych i nowych leków, aby skutecznie walczyć z nadużywaniem nielegalnych substancji narkotycznych. [0004] Neurobiologia uzależnienia od narkotyków zaczęła się ponad trzy dekady temu i większość badań zajmowała się farmakokinetyką i farmakodynamiką narkotyków. Na poziomie farmakokinetycznym, nadużywane nielegalne substancje, takie jak kokaina, morfina i heroina, wykazują silne narkotyczne właściwości wzmacniające i konkretne profile farmakokinetyczne, które ostatecznie wywołują wysoce uzależniające efekty narkotyczne w mózgu. Morfina jest alkaloidem o strukturze chemicznej fenantrenu (patrz przykład 1) uzyskanym z ekstraktu mlecznego (guma opiumowa) Papaver somniferum i stanowi główny związek ( 10%) ekstrahowany razem z innymi związkami o podobnej strukturze, takimi jak kodeina, tebaina i papaweryna (C. P. O'Brien, Drug Abuse, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics. Pp. 621-642, 10th ed. J. G. Hardman and L. E. Limbird, eds. McGraw Hill, New York, 2001). Morfina posiada grupę hydroksylową w pozycji trzeciej i alkoholową grupę hydroksylową w pozycji szóstej umieszczone w strukturze pierścienia fenolowego. Heroina, półsyntetyczna pochodna morfiny, odwrotnie - ma dwie grupy acetylowe w wyżej wymienionych pozycjach skondensowane w strukturę opiatowego pierścienia fenantrenowego, (C. P. O'Brien, Drug Abuse, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics. Pp. 621-642, 10th ed. J. G. Hardman and L. E. Limbird, eds. McGraw Hill, New York, 2001). Zarówno morfina jak i heroina są wchłaniane z przewodu pokarmowego i dróg oddechowych, w tym śluzówki jamy ustnej, jak również z przestrzeni podskórnych, domięśniowych, wewnątrznaczyniowych i wewnątrzkanałowych. Te dwa związki opiatowe wykazują uderzająco podobne właściwości farmakokinetyczne, oparte na ich wysokiej zdolności przenikania bariery krew-mózg, głównie dzięki ich wysokim właściwościom lipofilnym (C. P. O'Brien, Drug Abuse, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics. pp. 621-642, 10th ed. J. G. Hardman and L. E. Limbird, eds. McGraw Hill, New York, 2001). W rzeczywistości heroina jest stosunkowo bardziej lipofilna niż morfina, a tym samym szybciej niż morfina przenika barierę krew-mózg. Główna ścieżka kataboliczna morfiny przebiega głównie w wątrobie i 2

zależy od enzymatyczno-zależnego sprzężenia z kwasem glukuronowym z obiema, w pozycji trzeciej i szóstej, grupami hydroksylowymi umieszczonymi w strukturze pierścienia fenantrenowego, co prowadzi do wytworzenia endogennych związków metabolicznych, takich jak morfino-3-, morfino-6-, i, w mniejszym stopniu, morfino-3-6-glukuronidu. Te kataboliczne związki pośrednie stanowią strukturalne postacie morfiny, które są wydzielane i / lub wydalane w moczu. Ponadto wykazano, że morfino-6-glukuronid wykazuje silne, wzmacniające działanie przeciwbólowe i psychotropowe w mózgu. Tak więc metabolity morfiny wytworzone w wątrobie do krwiobiegu szybko przenikają barierę krew-mózg i w mózgu aktywują podtyp receptora opioidowego mu związany ze szlakiem nagrody, który pośredniczy w działaniu wzmacniającym nadużywanego narkotyku (L. M. Kamendulis et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 279:713-717, 1996; C. W. Hutto Jr. y W. Crowder, Pharmacol. Biochem. Behav. 58(1):133-140, 1997; A. J. Halliday et al., Life Sci. 65(2)225-236, 1999 and D. E. Selley et al., Biochem. Pharmacol. 62:447-455, 2001). Faktycznie ostatnie badania farmakokinetyczne (patrz przegląd i zawarte referencje w J. Halliday et al., Life Sci. 65(2)225-236, 1999) popierają koncepcję, że przeciwbólowe i / lub uzależniające działanie morfiny na OUN nie jest bezpośrednie i w większości nie jest wynikiem działania samej morfiny, ale w dużej mierze jest wywoływane przez jej glukuronowe aktywne metabolity, takie jak morfino-6-glukuronid. Dotychczas kilka badań (L. M. Kamendulis et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 279:713-717, 1996 and A. J. Halliday et al., Life Sci. 65(2)225-236, 1999) wykazało podobne farmakokinetyczne i farmakodynamiczne mechanizmy dla heroiny. Tak więc, gdy podawana jest heroina, duża część narkotyku zostaje szybko katabolizowana w osoczu i / lub w wątrobie do 6-monoacetylomorfiny, a następnie katabolizowana w morfinę i, przed dotarciem do docelowych neuronów (np. receptor opioidowy mu), ostatecznie przekształcona w morfino-6-glukuronid (R. E. Aderjan and G. Skopp, Ther. Drug Monit., 20(5): 561-9, 1998). Ustalenia te potwierdzają obecną koncepcję, że farmakologiczny agonizm heroiny i jej metabolitów endogennych (np. 6-monoacetylomorfina i morfina) w stosunku do receptora opioidowego mu, obejmujący końcową biotransformację aktywnych metabolitów (np. morfino-6-glukuronidu), obrazuje farmakodynamiczny mechanizm działania tych substancji uzależniających, zwiększający ich wzmacniające działanie uzależniające w mózgu (a. J. Halliday et al., Life Sci. 65(2): 225-236, 1999, D. E. Selley et al., Biochem. Pharmacol. 62:447-455, 2001 and C. P. O'Brien, Drug Abuse, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics. pp. 621-642, 10th ed. J. G. Hardman and L. E. Limbird, eds. McGraw Hill, New York, 2001). [0005] Kilka badań farmakodynamicznych (patrz przegląd prac w E. J. Nestler, Nat. Neuroci. 5:1076-1079, 2002 and P. N. Deslandes et al., J. Pharmacy and Pharmacol. 54:885-895, 2002) wykazało, że przewlekłe nadużywanie zarówno heroiny jak i morfiny prowadzi do rozwoju i tworzenia konkretnych długotrwałych zmian na poziomie komórkowym i molekularnym, które ostatecznie wywołują biologiczną neuroadaptację do uzależnienia od opiatów. Co więcej, podczas długiego okresu (np. lat) te neuronalne zmiany generują istotne elektrofizjologiczne, neurochemiczne i genomowe zmiany, które są stopniowo tworzone i umacniane w mózgu podczas uzależnienia. Dlatego też zmiany behawioralne u osobnika, występujące podczas uzależnienia od tych odurzających opiatów, następujące z upływem czasu, są coraz bardziej złożone i coraz silniejsze w odniesieniu do objawów uzależnienia. Na przykład, powtarzalne podawanie sobie heroiny przez uzależnionego powoduje wzrost stereotypowych zachowań kompulsywnych prowadzących do niekontrolowanego przyjmowania narkotyków, powiązanego ze stereotypowymi rytuałami podawania, którym początkowo towarzyszy tolerancja farmakologiczna, a następnie fizyczne oznaki i objawy odstawienia leku po ostrej eliminacji 3

narkotyku opiatowego (K. Severino et al., Ann. NY Acad. Sci 909: 51-87, 2000).Tak więc, behawioralne przyjmowanie heroiny staje się najwyższym priorytetem i koniecznością u uzależnionego osobnika, co prowadzi do wznowienia kompulsywnego poszukiwania i przyęcia narkotyku, normalnie obserwowanego w czasie odstawienia lub braku narkotyku. Neuroadaptacyjne zmiany zachodzące w czasie uzależnienia od opiatów są głównie spowodowane powtarzającą się ekspozycją skupisk grup neuronów zlokalizowanych w różnych częściach mózgu na farmakologiczne działanie narkotyku (K. Severino in. Ann. NY Acad. Sci 909 : 51-87, 2000).Te obszary mózgu obejmują miejsce sinawe, hipokamp, część boczna podwzgórza, pole brzuszne nakrywki, kompleks ciała migdałowatego, jądro półleżące i korę przedczołową, których struktury zawierają neuroanatomiczny substrat i szlaki nerwowe, na które substancje opiatowe i inne nielegalne narkotyki (np. kokaina) mają wpływ przez system nagrody i wzmocnienie pozytywne (K. Severino et al., Ann. NY Acad. Sci 909: 51-87, 2000). W tym kontekście przewlekłe podawanie zarówno morfiny jak i heroiny indukuje rozwój szeregu homeostatycznych komórkowych i molekularnych adaptacyjnych odpowiedzi na neuronach w wyżej wymienionych strukturach mózgu wywołanych narkotykiem. Przed kompulsywnym przyjmowaniem narkotyku takie reakcje adaptacyjne obejmują kilka elektrofizjologicznych, biochemicznych i genomowych zmian widocznych podczas uzależnienia, które razem są generowane, aby przywrócić i utrzymać wcześniej istniejącą funkcjonalną homeostazę zaangażowanych obwodów neuronalnych i ich neuronów instrumentalnych zmienionych podczas nadużywania narkotyków (K. Severino et al., Ann. NY Acad. Sci 909: 51-87, 2000). Po wytworzeniu tych neuroadaptacji, nagłe zaprzestanie przyjmowania narkotyku wzmaga rozwój nowych serii neurobiologicznych zmian i komórkowych adaptacji w neuronach, na które działał narkotyk, prowadzących do zespołu odstawienia podczas uzależnienia, którego źródło ma podłoże neuropatologiczne. Zespół odstawienia, wytwarzany zarówno przez morfinę jak i heroinę u uzależnionych osobników, w przeciwieństwie do zespołu odstawienia wywołanego przez kokainę i amfetaminę, charakteryzuje się dużym stopniem nasilenia zmian fizycznych i psychicznych u uzależnionego osobnika (H. Ghodse, Drugs of abuse and dependence. In: Drugs and Addictive Behavior, a guide to treatment, Blackwell Science Ltd, ed., Oxford, UK, pp. 72-119, 1995; G. F. Koob, Ann. N. Y: Acad. Sci. Vol. 909:185 2000 and K. Severino et al., Ann. N. Y. Acad. Sci 909: 51-87, 2000). Klinicznie, zespół odstawienia charakteryzują cztery różne etapy progresywnie lub stopniowo rozwijane w czasie. W ciągu pierwszych 1-7 godzin, narkoman w warunkach abstynencji rozwija behawioralne objawy charakteryzujące się kompulsywną żądzą i skrajnym pragnieniem spożycia narkotyku. W czasie drugiego etapu (po 8-15 godzinach), do początkowych objawów narkotycznych dochodzą fizyczne zmiany, takie jak intensywne łzawienie, skrajne pocenie się, wyciek z nosa i ospałość. Dalej, po 16-24 godzinach nieprzerwanego odstawienia narkotykowego, oprócz bólu rozproszonego, anoreksji i rozdrażnienia, mogą wystąpić również objawy fizyczne, takie jak rozszerzenie źrenic, jeżenie włosków, skurcze mięśniowe i zmiany w temperaturze ciała (np. intensywne odczuwanie zimna i ciepła). Następnie, po długotrwałym odstawieniu (np. 2-6 dni), mogą pojawić się inne objawy fizyczne i behawioralne, w tym bezsenność, gorączka, spowolnienie ruchowe, bóle brzucha, wymioty i biegunka, a także zwiększone nienormalne oddychanie, w tym zmiany tętna i ciśnienia krwi. Tak więc, z punktu widzenia objawów występujących w uzależnieniu od narkotyków, czas trwania i dotkliwość odstawienia morfiny i heroiny zależy od kilku czynników farmakokinetycznych i farmakodynamicznych. Ponadto istnieją doniesienia, że nasilenie zespołu odstawienia opiatów zależy od kilku farmakologicznych i biologicznych aspektów, które obejmują dzienną ilość przyjmowanego narkoty- 4

ku (np. dawkę wstrzykiwaną przez osobnika), okres używania i / lub nadużywania narkotyku, oprócz fizycznego i personalnego stanu danego osobnika, który ma wpływ na odpowiedź związaną z przyjmowaniem narkotyku. [0006] Tak więc, biorąc pod uwagę złożoność historii naturalnej patologii uzależnienia of morfiny / heroiny, kilka obecnie dostępnych farmakologicznych metod leczenia przeznaczonych do modyfikowania mechanizmów farmakodynamicznych, przez które te substancje opiatowe wywołują działanie wzmacniające, gdy wiążą się do swoich specyficznych miejsc receptorowych docelowych neuronów (D. M. Grilly, Opioids (narcotics) and their antagonists. In: Drugs and human behavior, 4th wyd. str.. 238-262, Allyn and Bacon, eds. USA, 2002). W tym kontekście, ostre leczenie detoksykacyjne od opiatów przedstawia początkowe i obecnie najczęściej stosowane podejście farmakoterapeutyczne w leczeniu klinicznych przewlekłych uzależnień, które staje się medycznych priorytetem i nagłą potrzebą w łagodzeniu fizycznych oznak i objawów odstawienia narkotyku, które jest zwykle związane z fizjologicznymi, endokrynologicznymi i chemicznymi zaburzeniami wywołanymi przez uzależnienie od narkotyku. Na przykład, częściowi agoniści receptorów opioidowych mu, tacy jak metadon i buprenorfina, w kombinacji z benzodiazepinami i / lub uspokajającymi neuroleptykami, są powszechnie przepisywane i podawane w ostrym leczeniu detoksykacyjnym od opiatów. W przeciwieństwie do ostrych procedur detoksykacji stosowanych w leczeniu uzależnienia od opiatów, leczenie substytucyjne przy użyciu substancji opiatowych, takich jak metadon i / lub buprenorfiny, jak również antagonistów receptora opioidowego, takich jak nalokson i / lub naltrekson, nie są w pełni zalecane podczas odstawienia opiatów, ponieważ zaostrzają zachowanie żądania przyjęcia narkotyku występujące przy macierzystych związkach opiatowych, które wywołały lub doprowadziły do pierwotnego stanu uzależnienia u osobnika. W normalnych okolicznościach leczenie i utrzymywanie syndromu wycofania opiatów wymaga hospitalizacji i opieki klinicznej ze wsparciem wyspecjalizowanego personelu medycznego, której wyniki będą bardzo drogie. [0007] Podobnie jak w zespole odstawienia, ważną do zrealizowania kwestią zdrowotną jest pełna detoksykacja od morfiny i / lub heroiny (tłumienie chęci przyjecia narkotyku) u uzależnionych osobników. W oparciu o szeroki zakres nieprawidłowych zmian funkcjonalnych wytworzonych w mózgu po długim chronicznym nadużywaniu opioidów, łatwo jest zrozumieć trudności w przywróceniu, przez obecnie dostępne terapie detoksykacyjne, homeostazy funkcji mózgowych sprzed przyjmowania narkotyku.tak więc, mimo tych ograniczeń terapeutycznych, idealne leczenie detoksykacyjne musi być ustawione tak, aby spełniać określone kryteria medyczne opisane dalej. Po pierwsze, powinno bezpośrednio blokować lub osłabić fizjologiczne i psychologiczne uzależnienie od opiatów w celu przywrócenia homeostatycznej równowagi tych układów nerwowych przewlekle rozregulowanych przez substancje opiatowe. Po drugie, leczenie detoksykacyjne powinno hamować te istotne zmiany fizyczne i behawioralne, które wydają się być zaostrzone podczas odstawienia narkotyku wywołanego interwencją terapeutyczną, zapewniając w ten sposób znośne przeżycie/doznania i bezpieczeństwo leczenia. Dodatkowo, należy zapewnić kompletne stłumienie chęci przyjęcia narkotyku u osobnika, kierując uzależnionych osobników na inne dostępne alternatywne, niefarmakologiczne metody leczenia (np. psychoterapia i doradztwo). Następnie, po zakończeniu terapii detoksykacji od opiatów, ostatecznym medycznym celem do osiągnięcia jest zapobieganie kolejnym powrotom do nadużywania opiatów. Tak więc, z ogólnego medycznego punktu widzenia, terapeutyczne wyzwania mające na celu po- 5

wstrzymanie uzależnienia od morfiny / heroiny są ogromne i, w większości przypadków, trudne do zrealizowania. Główne przeszkody napotykane zarówno w leczeniu farmakologicznym jak i niefarmakologicznym to brak odpowiedniej liczby wyspecjalizowanych klinik lub szpitali, wysokie ekonomiczne koszty leczenia, którymi zazwyczaj obciążany jest pacjent i, co najważniejsze, brak programów kontroli pacjenta (tj. wieloletnich) lub ciągłości klinicznej oceny, jak również brak stosowania długoterminowego psychoterapeutycznego wsparcia, aby zapobiec nawrotom uzależnienia. Ponadto, kolejnym poważnym problemem większości obecnych anty-uzależnieniowych sposobów leczenia przeciwko nadużywaniu opiatów jest toksyczny efekt uboczny wynikający z długotrwałego dozowania pojedynczych lub połączonych środków farmakologicznych (K. Severino et al., Ann. NY Acad. Sci 909: 51-87, 2000). Na przykład, metadon i buprenorfina, dwaj częściowi agoniści opioidalnego receptora mu, są to najczęstsze terapeutyczne narkotyki substytucyjne stosowane obecnie do tłumienia syndromu odstawienia opiatów lub długotrwałej abstynencji od opiatów (M. J. Kreek, Ann. N. Y. Acad. Sci, 909: 186-216, 2000). Ponadto, agoniści receptorów α2-adrenergicznych, tacy jak klonidyna, guanfacyna i / lub lofeksydyna reprezentują inny zestaw związków stosowanych dość często w terapiach detoksykacji do łagodzenia oznak i objawów odstawienia spowodowanych gwałtownym odstawieniem narkotyków opiatowych (M. J. Kreek, Ann. N. Y. Acad. Sci, 909:186-216, 2000). Jednakże, oprócz ich szerokiego stosowania w długoterminowych terapiach detoksykacji i / lub w leczeniu podtrzymującym abstynencję, wykazano że leki te wywołują kilka toksycznych efektów ubocznych. Odnotowano na przykład, że metadon, buprenorfina i pentazocyna wywołują zaburzenia snu, niepokój i ciężkie zaburzenia poznawcze i emocjonalne. Dodatkowo odnotowno, że agoniści receptora α2-adrenergicznego podczas długotrwałego podawania wywołują sedację, niedociśnienie, silny niepokój i osłabienie. Ponadto, u pacjentów otrzymujących substytucyjny opiat metadon, co nie jest zaskoczeniem, wykazano rozwój oznak i objawów uzależnienia od opiatów z powodu tego, że ten częściowy agonista receptora opioidowego mu wytwarza te same neurochemiczne, komórkowe i molekularne zmiany neuroadaptacyjne w mózgu, jak te odnotowane podczas uzależnienia od opiatów zarówno w przypadku morfiny jak i heroiny (M. J. Kreek, Ann. N. Y. Acad. Sci, 909:186-216, 2000). Inne leki dostępne obecnie dla detoksykowanych pacjentów w celu przedłużenia abstynencji i zapobiegania nawrotom uzależnienia wobec morfiny / heroiny obejmują antagonistów receptora opioidowego mu, nalokson i naltrekson. Częste toksyczne skutki uboczne obserwowane podczas długotrwałego podawania tych związków wynikają przede wszystkim z blokowania w mózgu systemów przekazywania endogennych opioidów, co prowadzi, wśród wielu innych czynności fizjologicznych, do niewydolności zarówno funkcji poznawczych jak i emocjonalnych mózgu (M. J. Kreek, Ann. N.Y. acad. Sci, 909:186-216, 2000). [0008] Jak dotąd, jeden głównych wniosek, wynikający z powyżej opisanych terapii farmakologicznych obecnie stosowanych do detoksykacji przy nadużywaniu opiatów, w tym długoterminowych sposobów leczenia podtrzymujących odstawienie i zapobieganie nawrotom uzależnienia wobec morfiny / heroiny, jest taki, że żaden z tych farmakologicznych sposobów leczenia nie wykazał optymalnej skuteczności. Wniosek ten opiera się na fakcie, że u pacjentów, u których podtrzymuje się abstynencję i / lub zapobiegania nawrotom, leki te powodują poważne toksyczne skutki uboczne (T. Kosten and D. Biegel, Expert Rev. Vaccines, 1 (3) : 89-97, 2002). Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania i zatwierdzenia nowych anty-uzależnieniowych strategii terapeutycznych opartych na syntezie, aplikacji i walidacji wysoce skutecznych nowych formulacji leków, wykazujących minimalną toksyczność i niewykrywane skutki uboczne i nadających się do zastosowa- 6

nie w długoterminowych terapiach ostrej detoksykacji i długotrwałym podtrzymywaniu abstynencji od morfiny / heroiny. [0009] Pod tym kątem różne grupy zaprojektowały, zastosowały i zwalidowały alternatywne strategie terapeutyczne w eksperymentalnych modelach zwierzęcych, które mają wspólny mechanizm farmakokinetyczny. Tak więc, odwrotnie niż w klasycznej farmakologii anty-uzależnieniowej, ten ostatni mechanizm opiera się na zmianie farmakokinetyki narkotyku przez znaczne zmniejszenie lub stłumienie przenikania przez barierę krew-mózg "wolnego" narkotyku w postaci niezwiązanej w osoczu, która ostatecznie w osoczu stanowi frakcję narkotyku, która przenika do mózgu, powodując duże wzmocnienie i efekt nagrody u uzależnionych osobników. Wszystkie z tych eksperymentalnych podejść koncentrowały się na znacznym zmniejszeniu lub zapobieganiu przenikaniu nadużywanego narkotyku przez barierę krew-mózg, przez zwiększenie wiązania "wolnej" niezwiązanej frakcji narkotyku w osoczu przez specyficzne przeciwciała, które we krwi rozpoznają i wiążą się wysoce specyficznie i z dużym powinowactwem do tych narkotyków. Ponieważ immunoglobuliny (przeciwciała) zazwyczaj nie przenikają bariery krew-mózg, to osoczowa frakcja wolnego-niezwiązanego narkotyku, która jest dostępną pulą narkotyku, która przenika przez barierę krew-mózg, oddziałując z immunoglobulinami tworzy kompleksy narkotyk-przeciwciało, który ostatecznie znacznie zmniejsza w osoczu tę frakcję wolnego-niezwiązanego narkotyku. Ta zmiana farmakokinetyki narkotyku w osoczu prowadzi do zmian w farmakodynamice narkotyku w mózgu, osłabiając lub zmniejszając w ten sposób działanie uzależniających narkotyków na ich specyficzne neurony docelowe. Te ostatnie zmiany farmakodynamiczne ostatecznie prowadzą do stłumienia zarówno rozwoju działania wzmacniającego jak i efektu przyjemnej nagrody wywołanych w mózgu przez nadużywany narkotyk. Główną właściwością farmakokinetyczną, wspólną dla większości nadużywanych narkotyków, jest wysoka zdolność przenikania bariery krew-mózg, co stanowi podstawowy i kluczowy mechanizm, za pomocą którego większość silnych nadużywanych narkotyków generuje w mózgu swoje bardzo wysokie wzmacniające działanie, prowadząc do ciągłego poszukiwania i przyjmowania narkotyków przez osobniki wystawione na działanie tych związków chemicznych. W tym kontekście wytwarzanie specyficznych przeciwciał surowiczych przeciw nadużywanym narkotykom przedstawia alternatywne podejście terapeutyczne do tłumienia lub zapobiegania przenikaniu nadużywanych narkotyków przez barierę krew-mózg i osiągnięciu ich docelowych neuronów. Podejście z udziałem antagonizmu przeciwciała zapobiegającego przenikaniu narkotyku do mózgu wykazało zwiększony efekt immunoochronny przeciwko chęci poszukiwania i przyjmowania narkotyku, co wykazano dla kokainy, nikotyny, PCP i amfetaminy u gryzoni (patrz prace przeglądowe i zamieszczone tam odnośniki T. Kosten and D. Biegel, Expert Rev. Vaccines, 1(3): 89-97, 2002 and K. Kantak, Drugs, 63(4): 342-252, 2003). W odniesieniu do kokainy, kilka grup badawczych było w stanie opracować i zastosować różne eksperymentalne strategie w oparciu o projektowanie, syntezę, podawanie i walidację kilku immunogennych preparatów białek nośnikowych z kowalencyjnie haptenizowaną kokainą (Kantak et al., Psychopharmacology 148:251-262, 2000; Fox, B. S. et al., Nat. Medicine, 2:1129-1132, 1996; Sparenborg et al., Therapeutics 293(3): 952-961, 2000; Carrera et al. Nature, 378:727-730, 1995, Carrera, R. et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 97(11)6202-6206, 2000). Niektóre białka o wysokiej masie cząsteczkowej, takie jak BSA i KLH, stosowano jako nośniki do kowalencyjnego łączenia z kokainą przy użyciu standardowych procedur chemicznych sprzęgania kowalencyjnego. W ten sposób, po przeprowadzeniu protokołu aktywnej immunizacji gryzoni, niektóre z tych immunogenów wykazały zdolności do wy- 7

twarzania od niskiej do umiarkowanej odpowiedzi miana przeciwciał przeciwko nadużywanemu narkotykowi u aktywnie szczepionych zwierząt. Co więcej, inne eksperymentalne podejścia dające efekt immunoochronny wobec uzależnienia od kokainy zostały zbadane przez zwiększenie generacji tradycyjnych i / lub katalitycznych przeciwciał monoklonalnych podawanych gryzoniom podczas protokołów biernej immunizacji przeciwko temu psychoaktywnemu narkotykowi (Metz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10176-10180, 1998; Fox et al., Nat. Med. 2:1129-1132, 1996 and Landry et al., Science, 239:1899-1901, 1993). Efekty immunoochronne przeciwko uzależnieniu od kokainy wykorzystujące te immunologiczne strategie eksperymentalne zostały zbadane przez wykrywanie zniesienia narkotykowych zachowań wzmacniających u gryzoni w połączonych modelach farmakologicznych i paradygmatów instrumentalno-behawioralnych. Te strategie eksperymentalne mają wspólny anty-uzależnieniowy mechanizm, który polega na znacznej redukcji i / lub całkowitym zahamowaniu przenikania przez barierę krew-mózg znajdującej się w osoczu "wolnej" frakcji niezwiązanej kokainy. Tak więc, u aktywnie zaszczepionych hiperimmunizowanych zwierząt frakcja znajdującego się w osoczu "wolnego" niezwiązanego narkotyku jest znacznie zmniejszona, gdy specyficzne przeciwciała surowicze wiążą się we krwi z psychoaktywnym narkotykiem (Kantak et al., Psychopharmacology, 148:251-262, 2000; Carrera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(11):6202-6206; Carrera et al., Nature, 378:727-730, 1995). Alternatywnie, przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko kokainie mogą wiązać się z "wolną" niezwiązaną frakcją kokainy po pasywnym przeniesieniu do krwi (Metz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10176-10180, 1998; Fox et al., Nat. Med. 2:1129-1132, 1996, Benowitz, Pharmacol. Toxicol. 72:3-12, 1993). W obu przypadkach wspólny mechanizm immunologicznej neutralizacji, który promuje zmiany farmakokinetyki kokainy, prowadzi do znacznego zmniejszenia lub całkowitego zahamowania wejścia narkotyku do mózgu, zmniejszając w ten sposób lub tłumiąc ukierunkowanie kokainy na specyficzny neuronowy membranowy transporter wychwytu zwrotnego dopaminy. Ten ostatni mechanizm z użyciem przeciwciała indukujący zmiany farmakodynamiki kokainy w mózgu, prowadzi do zmian synaptycznego poziomu neuroprzekaźników aminowych i zniesienia pobudzenia centralnego sygnału katecholaminergicznego zależnego od wywołania, które zwykle obserwuje się po wejściu kokainy do mózgu osobników uzależnionych. Końcowym scenariuszem behawioralnym, który wynika z tych zmian farmakokinetyki kokainy i neurochemicznych zdarzeń, jest brak intensyfikacji efektu nagradzania indukowanego w mózgu ssaków przez silnie wzmocniający narkotyk. Zatem, gdy efekty wzmocnienia i nagradzania powodowane przez kokainę zostały zneutralizowane u hiperimmunizowanych zwierząt, wzmacniające właściwości tego narkotyku zostaną utracone po kolejnej ekspozycji na narkotyk, o czym świadczy stłumienie chęci poszukiwania i przyjmowania narkotyku u takich hyperimmunizowanych zaszczepionych zwierząt (gryzoni) obserwowane po zastosowaniu niektórych immunogennych koniugatów kokainy. [0010] Podsumowując, większość wyżej wymienionych badań przedklinicznych wykazało możliwość wykorzystania podejścia opartego na antagonizmie przeciwciał do tłumienia u gryzoni chęci poszukiwania i przyjmowania narkotyku. Jednakże, rodzaje białek nośnikowych (np. BSA i KLH) stosowane do wytwarzania immunogennych koniugatów (szczepionek) stosowanych w tych badaniach wykluczają potencjalne zastosowanie tych nośników w formulacjach szczepionek do stosowania w protokołach immunizacji ludzi (Carrera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; Carrera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000; Carrera et al., Nature, 378:727-730, 1995; Kantak et al., Psychopharmacology, 148:251-262, 2000; Ettinger et al., Pharmacol. 8

Biochem. Behav. 58:215-220, 1997 and Fox, Drug and Alcohol Depend. 48:153-158, 1997). Ponadto, synteza konwencjonalnych i/lub katalitycznych mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko kokainie stosowanych jako potencjalna bierna immunoterapia uzupełniająca u zwierząt doświadczalnych (gryzoni) ma główne ograniczenie w postaci krótkoterminowego działania immunoochronnego po biernym podaniu. Wynika to głównie z szybkiego klirensu metabolicznego tych mysich immunoglobulin z surowicy zwierząt biernie uodpornionych innych niż myszy (Goldsby et al., Vaccines, In: Kuby Immunology, 4th ed. Freeman and Co. New Cork, NY, str. 449-466, 2000). Co więcej, potencjalne zastosowanie dostępnych mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko kokainie jako immunologicznych terapeutycznych środków przeciwko uzależnieniu od kokainy u ludzi, wymaga zastosowania technik rekombinacji DNA, w celu "humanizacji" regionu Fc mysich immunoglobulin. [0011] Wreszcie, potencjalne zastosowanie tego antagonizmu opartego na przeciwciałach przeciwko uzależnieniu od kokainy u człowieka jest aktualnie badanym problemem jako terapeutyczne podejście. Tę immunofarmakologiczną strategię zapoczątkowano syntezą formulacji szczepionki przeciwko kokainie, strukturalnie zaprojektowanej do stosowania u ludzi, w której kokaina została kowalencyjnie sprzężona z rekombinowaną β-podjednostką toksyny cholery (jako białkiem nośnikowym). Na poziomie przedklinicznym koniugat ten wykazał umiarkowaną skuteczność w wywoływaniu odpowiedzi przeciwciała u aktywnie zaszczepionych szczurów i wywoływania immunoochronnego efektu zapobiegania u zwierząt nawrotów chęci spożycia kokainy (Kantak et al., Psychopharmacology, 148:251-262, 2000). Dodatkowo, aktywne szczepienie tym immunogenem ludzkich ochotników, wykorzystywanych do badania bezpieczeństwa i immunogenności tej formulacji szczepionki, wykazało niestety mało obiecujące efekty terapeutyczne, w tym pojedynczym badaniu klinicznym I fazy j (T. Kosten et al., Vaccine 2559:1-9, 2001), ponieważ ta formulacja szczepionki wykazała słabą zdolność immunoogenną wytwarzając niskie miano przeciwciał odpowiedzi [np. mały zakres stężenia (µg) specyficznej immunoglobuliny / ml surowicy] u większości szczepionych osobników. Oprócz wyżej wymienionych ograniczeń eksperymentalnych nowe szczepionki przeciw kokainie opracowane przez różne grupy badawcze, są obecnie przedmiotem badań, będących w fazie zarówno przedklinicznej jak i I fazie badań klinicznych, pod kątem zastosowania różnych białek nośnikowych w celu poprawienia immunogenności przeciwko temu psychoaktywnemu narkotykowi. Po walidowaniu właściwości immunogennych tych formulacji szczepionek u ludzi w badaniach klinicznych I fazy, mogą być dostępne dla późniejszej oceny w badaniach klinicznych II fazy oceniających immunoochronne możliwości tych formulacji szczepionkowych przeciwko uzależnieniu od kokainy. Na przykład, mogą być wykorzystane w badaniach klinicznych fazy II, oceniających zwiększoną długotrwałą zdolność immunoochronną przeciwko uzależnieniu od kokainy bazującą na odpowiedzi humoralnej u byłych narkomanów, którzy wykazują długotrwałą i kontrolowaną abstynencję, ale czują silną farmakologiczną chęć zakupu i przyjęcia kokainy. [0012] W przypadku uzależnienia od tytoniu, co najmniej dwa preparaty immunogenne (szczepionki) ze wmocniającą substancją psychoaktywną, a mianowicie nikotyną, zostały zaprojektowane do stosowania u ludzi (patrz T. Kosten and D. Biegel, Expert Rev. Vaccines, 1(3): 89-97, 2002; K. Kantak, Drugs, 63(4): 341-352,2003). Badania przedkliniczne wykazały, że te dwie szczepionki były w stanie wygenerować niskie do umiarkowanych miana swoistych przeciwciał w surowicy (tj. 0,05-0,2 mg / ml surowicy) przeciwko nikotynie u aktywnie szczepionych gryzoni. Ponadto, aktywne szczepienie tymi immunogennymi preparatami nikotyny 9

pokazuje nadawanie immunoochrony przeciwko chęci nabycia i przyjęcia nikotyny w paradygmatach dożylnego samo-podawania narkotyku u gryzoni. Mechanizm immunoochronny wobec uzależnienia od nikotyny stosuje ten sam mechanizm farmakokinetyczny opisany dla uzależnienia od kokainy, czyli przez wiązanie "wolnej" niezwiązanej frakcji nikotyny w osoczu przez specyficzne przeciwciała surowicze, co zapobiega przenikaniu tego narkotyku przez barierę krew-mózg. Niezależnie badania fazy klinicznej przeprowadzone przez Nabi Pharmaceuticals (szczepionka antynikotynowa NicVAX) i Xenova Pharmaceutical Group z Belgii, wykazały pozytywne wyniki dotyczące oceny toksycznych i immunogennych właściwości tych dwóch formulacji szczepionek. Sprawozdania z badań klinicznych II fazy dotyczące oceny możliwości immunoochronnej tych dwóch formulacji szczepionek przeciwko uzależnieniu od nikotyny u ochotników będących byłymi narkomanami mają być gotowe w ciągu dwóch najbliższych lat. [0013] W rzeczywistości rozwój eksperymentalnych strategii skoncentrowanych na projektowaniu i syntezie immunogennych preparatów i późniejszej walidacji protokołów szczepień do leczenia konkretnych form uzależnienia od narkotyków, były pionierskimi badaniami dla opiatów takich jak morfina i heroina, ale nie dla uzależnienia od kokainy i nikotyny. Patrząc wstecz, na początku lat 70-tych różne grupy badawcze wykazały możliwości zwiększania odpornościowej odpowiedzi humoralnej wobec tych dwóch substancji opiatowych używając protokołów szczepień w eksperymentalnych modelach zwierzęcych, takich jak szczur i królik (S. Spector and C. W. Parker, Science, 168:1347-1348, 1970; S. Spector, J. Pharmacol. Exp. Ther. 178:253-258, 1971; E. L. Adler and C. Liu, J. Immunol, 106:1684-1685, 1971; H. Van Vunakis et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 180:514-521, 1972; B. H. Wainer et al., Science, 176-1143-1145, 1972; B. H. Wainer et al., Science, 178:647-648, 1972 and B. H. Wainer et al., J. Immunol. 110:667-673, 1973). Te eksperymentalne podejścia skoncentrowane były na tworzeniu przeciwciał poliklonalnych przeciwko morfinie, które wykazują wyraźne immunologiczne rozpoznanie krzyżowe przeciwko heroinie i pokrewnym strukturalnie analogom opiatowym (np. kodeina, meperydyna i hydromorfina). Przeciwciała te zostały wygenerowane za pomocą specyficznie zaprojektowanych testów immunologicznych (tj. test radioimmunologiczny i testy immunoenzymatyczne t ELISA) do wykrywania i pomiaru morfiny oraz pokrewnych substancji opiatowych w ludzkich płynach biologicznych. Badania te po raz pierwszy odniosły sukces w konstruowaniu i walidacji kowalencyjnej kondensacji eksponowanych wolnych grup 3 - i 6-hydroksylowych w pierścieniu fenantrenowym cząsteczki morfiny z białkami nośnikowymi takimi jak BSA, z zastosowaniem standardowych procedur chemii organicznej (procedury, które są nadal stosowane w chemicznej syntezie takich immunogennych koniugatów). Ponadto warto wspomnieć, że żadna z tych procedur chemicznych nie została zgłoszona i zastrzeżona w zarejestrowanych patentach i są one najczęściej opisywane w podręcznikach chemii organicznej jako klasyczne procedury chemiczne, gdy opisuje się kowalencyjne wiązanie wolnych grup 3 - i 6 - hydroksylowych w fenantrenowym pierścieniu morfiny z białkami nośnikowymi. W takim kontekście, dwa strukturalne produkty pośrednie z morfiny zostały z powodzeniem zsyntetyzowane przez różne grupy badawcze i użyte do opracowania formulacji szczepionek, a mianowicie produkt 3-orto-morfinokarboksymetylo-eter (3-O-karboksymetylomorfina, patrz przykład 2 ) i morfino-6-hemibursztynian (patrz przykład 3) ((S. Spector and C. W. Parker, Science, 168:1347, 1970; S. J. Spector, J. Pharmacol. Exp. Ther. 178:253, 1971; H. Van Vunakis et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 180:514, 1972; and S. Gross et al., Immunochemistry, 11:453-456, 1974). W odniesieniu do wyżej wymienionych pośrednich pochodnych morfi- 10

ny wykorzystywanych do opracowania formulacji szczepionkowych, dwa identyczne zgłoszenia patentowe opublikowane 13 września 1991 r. (CH678394 A5) i 15 maja 1996 ( EP0496839 B1) przez Ericha Hugo Cerny zastrzegają wynalazek dotyczący strukturalnej syntezy nowych formulacji szczepionek przeciwko morfinie. Jednak warto wspomnieć, że oba te zarejestrowane jako patenty nie ujawniają prawdziwej nowości ani wynalazku w zakresie syntezy zastrzeżonych formulacji szczepionek terapeutycznych. Argument ten jest oparty na tym, że oba zarejestrowane patenty opisują te same standardowe procedury syntetyczne, o których uprzednio donoszono, do wytworzenia pochodnej pośredniej 3-O-karboksy-metylo-morfiny, stosowanej do kowalencyjnego sprzęgania z białkiem nośnikowym - KLH. W obu przypadkach stosuje się morfinę i beta-chlorooctan sodu i alkohol absolutny jako reagenty w mieszaninie reakcyjnej. Inną syntetyczną pośrednią pochodną, użytą do aktywowania kowalencyjnego wiązania między morfiną i białkami nośnikowymi, jest ester sukcynylowy morfiny związany z wolną grupą 6-hydroksylową struktury fenantrenowego pierścienia cząsteczki morfiny, mianowicie morfino-6-hemibursztynian (patrz przykład 3) (oryginalne doniesienie B. H. Wainer et al., Science, 176:1143, 1972, A. Akbarzadeh et al., Biotechnol. Appl. Biochem, 30:139-145, 1999). W tym samym kontekście wyżej wymienionych procedur syntetycznych używanych do wytwarzania pochodnej, 3-O-karboksymetylomorfiny, do syntezowania formulacji szczepionek, patent na szczepionkę przeciw morfinie, zgłoszony z Chin (CN1196955), z naszego punktu widzenia został przyznany niezasadnie na rzecz Han Ying i wsp. w dniu 28 października 1998 roku. Autorzy ci zastrzegają innowacyjną i nową metodę syntezy i strukturalne formulacje szczepionek przygotowanych dla różnych narkotyków opioidowych, oprócz morfiny, używając tych samych standardowych metod do syntezy pochodnej - morfino-6-hemibursztynianu, o których donoszono wcześniej (patrz w B. H. Wainer et al., Science, 176:1143, 1972, A. Akbarzadeh et al., Biotechnol. Appl. Biochem, 30:139-145, 1999). Autorzy ci użyli tej pośredniej pochodnej do heptanizacji morfiny z BSA jako białkiem nośnikowym. [0014] Projekt struktury i syntezę różnych formulacji immunogennych, w których morfina ulega haptenizacji z białkiem nośnikowym, takim jak KLH i BSA, stanowiły podstawę, od której autorzy zawsze zaczynali procedury chemiczne, aby połączyć kowalencyjnie pośrednie pochodne morfiny 3-O-karboksymetylomorfinę i morfino-6-hemibursztynian, z tym białkiem nośnikowym (jak przedstawiono we wcześniejszych badaniach doświadczalnych opisanych powyżej, w tym wyżej wymienionych zarejestrowanych jako patenty), przy użyciu jako homobifunkcyjnego chemicznego reagenta sieciującego, 1-etylo-3-(3- dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC ). EDC reaguje z dostępnymi wolnymi grupami karboksylowymi pochodnych 3-O-karboksymetylomorfiny lub morfino-6-hemibursztynianu, tworząc w ten sposób odpowiednie dwa produkty uboczne O-acylomocznik, które są chemicznie zdolne do wytwarzaniaa amidowych wiązań kowalencyjnych z grupami epsilon (ε)-aminowymi w łańcuchu bocznym reszt lizynowych BSA lub KLH (patrz przykład 4). [0015] Powyższe badania pokazujące możliwość generowania humoralnej odpowiedzi odpornościowej przeciwko morfinie i jej strukturalnie pokrewnemu połsyntetycznemu opiatowi - heroinie, doprowadziły do pionierskich badań opisanych prawie 30 lat temu przez Bonese (K. F. Bonese et al. Nature, 252:708-710, 1974). Badania te były w rzeczywistości pionierskim doniesieniem wykazującym, że aktywne szczepienie jednego doświadczalnego zwierzęcia naczelnego nie będącego człowiekiem, Macacus rhesus, immunogennym koniugatem morfiny było w stanie wygenerować ochronną humoralną odpowiedź odpornościową, 11

która tłumiła uzależnieniowe zachowanie samopodawania heroiny. Synteza tego immunogennego koniugatu została osiągnięta przez kowalencyjną haptanizację morfiny z BSA przez stabilne wiązanie estrowe utworzone przez kondensację bezwodnika bursztynowego i grupy 6-hydroksylowej w strukturze fenantrenowej cząsteczki morfiny. Zsyntetyzowana pośrednia pochodna, morfino-6-hemisukcynyl, była następnie kowalencyjnie wiązana z reagentem 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidem (EDC ) i w ten sposób powstawał kompletny immunogenny koniugat. Powtarzane podskórne wstrzyknięcia tego immunogenu naczelnym wywołało humoralną odpowiedź odpornościową ze specyficznymi przeciwciałami przeciwko morfinie, które wykazywały także krzyżowe rozpoznanie heroiny. Dodatkowo, metoda aktywnego szczepienia tym koniugatem okazała się być skuteczną procedurą tłumiącą chęć ponownego dożylnego samopodawania heroiny u tego pojedynczego naczelnego, wcześniej przeszkolonego do samopodawania różnych dawek tego opiatu. Mimo że ten pionierski raport pokazał pierwszą udaną procedurę opartą na antagonizmie przeciwciał, która tłumiła chęć przyjmowania heroiny u naczelnego, nigdy nie została opatentowana i opracowana do stosowania klinicznego. Podobnie, żadne dalsze badania eksperymentalne związane z projektowaniem, syntezą i walidacją dalszych nowych formulacji szczepionek strukturalnych przeciwko morfinie / heroinie wykorzystujących białka nośnikowe, odpowiednich do szczepienia ludzi, nie zostały opracowane, głównie ze względu na fakt, że BSA nie jest licencjonowanym białkiem nośnikowym przeznaczonym do takich celów doświadczalnych. Głównym powodem, dla którego te immunofarmakologiczne badania z odpowiednimi immunogenami dla morfiny i heroiny, nigdy nie zostały przeprowadzone na ludziach, może być, przynajmniej w części, jednoczesny i ciągły rozwój innych czynników neurofarmakologicznych stosowanych w leczeniu uzależnienia od morfiny - heroiny. Na przykład, syntetyczne narkotyki, które mają słabą i częściową aktywność agonisty receptora opioidowego mu (np. metadon i buprenorfina) i inne leki, które wykazują działania antagonistyczne na receptory opioidowe (np. naltrekson i nalokson). Wszystkie te leki są obecnie stosowane w celu zapobiegania nawrotom uzależnienia od opiatów. [0016] Opracowane na podstawie wyżej wymienionych doniesień o eksperymentalnych szczepionkach przeciwko uzależnieniu od morfiny / heroiny, które nigdy nie osiągnęły etapu szczepienia ludzi, wstępne badania doświadczalne prowadzone przez naszą grupę badawczą stanowią podstawę opracowania niniejszego wynalazku biwalentnej formulacji szczepionki przeciwko uzależnieniu od heroiny - morfiny. Eksperymenty te opisują projekt, syntezę i ocenę immunogenności wywołanej przez różne syntetyczne modele strukturalne nowej generacji szczepionek przeciwko morfinie/heroinie (B. Anton and P. Leff., 31st Annual meeting of the Society for Neuroscience. San Diego, CA. November 10-16, 2001). Takie strukturalne formulacje szczepionek początkowo były zsyntetyzowane przez połączenie kowalencyjnie pośredniej pochodnej, morfino-6-hemibursztynianu (M-6-H) z kilkoma białkami nośnikowymi, takimi jak BSA i KLH i rekombinowanym białkiem - β-podjednostką toksyny cholery. Do tych reakcji sprzęgania wykorzystano standardowe procedury sieciowania wiążące pośrednią pochodną morfino-6-hemibursztynian (M-6-H) z reagentem 1-etylo-3- (3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimidem (EDC). Te wstępne dane doświadczalne zebrane z takich badań dają możliwość identyfikacji białek nośnikowych będących kandydatami do kowalencyjnej haptenizacji morfiny. Warto wspomnieć, że ta praca była prezentowana tylko w sesji prezentacji slajdowych na wyżej wymienionym International Neuroscience Meeting. [0017] Co więcej, nie ujawniono żadnych informacji dotyczących danych doświadczalnych związanych z 12

projektowaniem molekularnych modeli strukturalnych immunogenów, metodologii opisującej syntezę, oczyszczanie, procedur zastosowania i dozowania tych nowych szczepionek. Ponadto nie zrobiono żadnego odniesienia lub opisu do walidacji anty-uzależnieniowych efektów przeciwko morfinie - heroinie, które są ujawnione w niniejszym wynalazku terapeutycznej biwalentnej formulacji szczepionki morfina-heroina przeciwko uzależnieniu od tych dwóch substancji opiatowych. [0018] Oprócz pionierskich badań, o których donosił Bonese i współpracownicy, które wykazały skuteczność aktywnego szczepienia BSA-morfiną w celu tłumienia uzależnieniowej chęci samoprzyjęcia heroiny u pojedynczego naczelnego, inne grupy badawcze zbadały immunoochronny efekt biernej immunizacji wobec morfiny, stosując paradygmat behawioralny dożylnego samopodawania heroiny u gryzoni (P. R. Pentel et al., Pharmacol. Biochem. and Behavior, 9:347-352, 1991). Z potencjalnego terapeutycznego punktu widzenia, procedura biernej immunoochrony przed uzależnieniem od morfiny i heroiny ma praktyczne ograniczenia w długoterminowym przedłużaniu i utrzymaniu abstynencji od narkotyków opiatowych u ludzi jako przeciwieństwo do procedur aktywnych szczepień. Ograniczenia te są oparte na niektórych praktycznych obserwacjach pochodzących z wyników doświadczalnych paradygmatów biernej immunoochrony (R. A. Goldsby, Vaccines. Kuby Immunology, 4th ed. Freeman and Co, New Cork, N. Y., pp. 449-466, 2001). Dane te wykazują, po podaniu in vivo różnym zwierzętom doświadczalnym, stosunkowo krótki biologiczny okres półtrwania mysich przeciwciał monoklonalnych (3-23 dni, w zależności od klasy immunoglobuliny i izotypu). Zatem immunoochrona nadana przez bierne podawanie mysich przeciwciał monoklonalnych niemysim gospodarzom jest zwykle krótkotrwała. Ponadto, ponieważ oba przeciwciała, monoklonalne i poliklonalne, stosowane w terapii biernej immunizacji są powszechnie wytwarzane z różnych gatunków zwierząt (np. myszy, królika, itd.), takie immunoglobuliny, gdy wstrzykuje się je osobnikom ludzkim, są zwykle uznawane za obce cząsteczki antygenowe. W tym kontekście, immunizacja bierna pacjentów takimi immunoglobulinami spowodowałaby wyzwolenie szybkiej humoralnej odpowiedzi odpornościowej wobec tych cząsteczek, co ostatecznie daje stłumienie odpowiedzi neutralizacyjnej z wykorzystaniem przeciwciał, zmniejszony okres półtrwania tych typów immunoglobin w osoczu. W ten sposób, po pierwszej takiej odpowiedzi antygenowej wobec heterologicznych przeciwciał u biernie immunizowanych osobników, dalsze podawanie tych typów immunoglobulin prowadziłoby, przy wielokrotnym biernym podawaniu takich cząsteczek, do rozwoju nieprawidłowych odpowiedzi odpornościowych - nadwrażliwości. CELE I ZALETY WYNALAZKU [0019] Na podstawie wyżej wymienionego tła dotyczącego antyuzależnieniowych terapii przeciwko nadużywaniu opiatów, a konkretnie przeciwko uzależnieniu od morfiny i heroiny, możemy stwierdzić, że żadne skuteczne i nietoksyczne leki, do leczenia i utrzymania przedłużonej abstynencji i zapobiegania nawrotom uzależnieniowej chęci przyjęcia opiatu, nie są jeszcze dostępne dla ludzi. Do tej pory istnieją powody uzasadniające bieżącą potrzebę rozwoju, stosowania i walidacji skojarzonych nowych leków i strategii terapeutycznych do utrzymania długotrwałej abstynencji i skutecznego zapobiegania nawrotom do uzależnieniowej chęci 13

przyjęcia wysoce uzależniających opiatów,takich jak heroina i morfina u ludzi. [0020] Jak wcześniej wspomniano, wcześniejsze badania eksperymentalne pokazują przedkliniczną ocenę różnych strategii immunologicznych przeciwko uzależnieniu od narkotyków w modelach zwierzęcych, wspierając potencjalne terapeutyczne zastosowanie różnych strategii immunologicznych wobec uzależnienia od kokainy, nikotyny i opiatów (konkretnie zarówno do morfiny jak i heroiny). Te strategie obejmują nowe leczenie farmakologiczne oparte na antagonizmie przeciwciała dla utrzymania przedłużonej abstynencji i / lub zapobiegania nawrotom przyjmowania i uzależnienia narkotykowego od wyżej wymienionych substancji u ludzi. W rzeczywistości najważniejszym dziedzictwem tych immunoochronnych badań przeciwko uzależnieniu od narkotyków jest identyfikacja kluczowych osiągnięć eksperymentalnych zarówno z doświadczeń przedklinicznych jak i klinicznych fazy I, co ostatecznie może doprowadzić do potencjalnego zastosowania i walidacji tych strategii immunologicznych do utrzymania przedłużonej abstynencji i / lub zapobiegania nawrotom u ludzi podczas uzależnienia od nielegalnych nadużywanych narkotyków. [0021] W związku z tym, można wymienić następujące warunki eksperymentalne które muszą zostać spełnione: a) projektowanie i synteza strukturalnych formulacji szczepionek przeciw uzależnieniu, gdzie haptenowy narkotyk jest strukturalnie połączony bardzo stabilnym wiązaniem kowalencyjnym (tj. amidowym), za pomocą dwufunkcyjnych związków chemicznych o niskiej strukturalnej złożoności i immunogenności, które wzmacniają kowalencyjne usieciowanie haptenizowanego narkotyku, z licencjonowanymi białkami nośnikowymi stosowanymi w protokołach szczepień u ludzi; b) jeśli koniugat narkotyk-białko jest podawany według protokołów aktywnej immunizacji, białka takie powinny mieć udowodnioną nietoksyczność i powinny być w stanie nadawać bardzo wysoką immunogenność haptenowemu narkotykowi; c) systematyczna ocena humoralnej odpowiedzi odpornościowej na haptenowy narkotyk sprzężony z białkiem nośnikowym, aby parametry funkcjonalne, wywoływanych specyficznych przeciwciał, takie jak ich miano, specyficzność i powinowactwo, mogły zostać odpowiednio scharakteryzowane po zastosowaniu immunokoniugatu w doraźnych protokołach aktywnego szczepienia; d) systematyczne monitorowanie humoralnej odpowiedzi odpornościowej podczas protokołów aktywnego szczepienia immunogennym koniugatem zawierającym haptenizowany uzależniający narkotyk, w celu zidentyfikowania i oszacowania ustanowionej długoterminowej i stabilnej pamięciowej odpowiedzi humoralnej na antygenowy narkotyk po zakończeniu protokołów aktywnej immunizacji; e) ocena zdolności i skuteczności tych nowych terapeutycznych formulacji szczepionek przeciw uzależnieniom od narkotyków (tj. morfiny-heroiny), którym udowodniono zdolności do nadawania długoterminowej immunoochrony przeciwko uzależniającym narkotykom. Szczepionki te powinny wykazywać dobry indeks terapeutyczny zapobiegający ponownemu nabyciu zachowań uzależniających u osobników detoksykowanych i w stanie abstynencji. [0022] Niniejszy wynalazek odnosi się do projektowania, syntezy, oczyszczania, zastosowania i walidacji modelu strukturalnego szczepionki zarówno przeciw uzależnieniu od morfiny jak i od heroiny, który spełnia wszystkie wyżej wymienione wymagania strukturalne i funkcjonalne. Szczegółowy opis procedur syntezy i struktury nośnika tego koniugatu białko-morfina, są ujawnione w niniejszym ujawnieniu. Inne informacje również tu ujawnione dotyczą jego wykorzystania w paradygmatach aktywnej immunizacji gryzoni, w celu monitorowania i charakteryzacji rozwoju humoralnej odpowiedzi immunologicznej po pobudzeniu, a także miana i specyficzności wytwarzanego przeciwciała przeciwko haptenizowanemu narkotykowi. Dodatkowo, ujawnione 14

dane eksperymentalne pokazują również udowodnioną skuteczność niniejszej ujawnionej leczniczej formulacji nowej biwalentnej szczepionki przeciw heroinie / morfinie, wywołującej solidną humoralną odpowiedź odpornościową o wysokim i trwałym, w surowicy, mianie przeciwciał przeciwko morfinie i o równoważnej specyficzności względem heroiny, u osobników uzależnionych od tych substancji opioidowych, którzy są detoksykowani i w stanie abstynencji. Takie przeciwciała, oprócz przedłużenia stanu abstynencji wobec tych dwóch substancji opiatowych, mogą skutecznie antagonizować (blokować) ponowne nabycie uzależniającego zachowania poszukiwania i przyjmowania narkotykówu hiperimmunizowanych osobników szczurzych sprowokowanych do nabycia narkotyku w standardowym uzależniającym paradygmacie dożylnego samopodawania tych dwóch substancji opiatowych. [0023] Pierwszym celem niniejszego wynalazku jest ujawnienie metody syntezy i strukturalnej formulacji nowego immunogenu morfiny według zastrzeżeń, który ma następujące zalety funkcjonalne i strukturalne nie przedstawione w innych uprzednio zsyntetyzowanych formulacjach szczepionek morfiny / heroiny: a) kowalencyjna haptenizacja morfiny z toksoidem tężcowym, białkiem nośnikowym licencjonowanym do wykorzystania w protokołach aktywnych szczepień u człowieka z udowodnioną zdolnością do nadawania bardzo wysokiej immunogenności cząsteczkom haptenowym o niskiej masie cząsteczkowej; b) kowalencyjna haptenizacja morfiny z toksoidem tężcowym, przez sekwencyjne użycie i kowalencyjne połączenie z dwoma różnymi reagentami sieciującymi, co zwiększa syntezę długich i krótkich immunogennych ramion linkera umieszczonych pomiędzy białkiem nośnikowym i haptenizowanym narkotykiem; c ) ten nowy immunogen morfiny został dostarczony osobnikom w protokołach aktywnych szczepień i wykazał udowodnioną skuteczność do generowania silnej i trwałej humoralnej odpowiedzi odpornościowej charakteryzującej się wysoką specyficznością przeciwciał surowiczych o równoważnej specyficzności względem morfiny i jej strukturalnie pokrewnego i silnie uzależniającego analogu opiatowego, heroiny. [0024] Innym celem niniejszego ujawnienia jest ujawnienie i walidacja paradygmatu aktywnej immunizacji za pomocą wyżej wymienionego koniugatu białko nośnikowe-morfina w celu optymalizacji silnej i trwałej humoralnej odpowiedzi odpornościowej z bardzo wysokimi mianami przeciwciał anty-haptenowych i o uregulowanej długotrwałej pamięci odpowiedzi odpornościowej. [0025] Innym celem niniejszego ujawnienia jest wykazanie optymalnego miana i specyficzności przeciwciał, w celu wykazania ich funkcjonalnej zdolności do rozpoznania krzyżowego heroiny, ale nie innych leków opiatowych strukturalnie podobnych do morfiny i / lub kilku endogennych peptydów opioidowych produkowanych w mózgu. [0026] Inny cel niniejszego ujawnienia dotyczy walidacji użycia tego immunogenu jako kompozycji farmaceutycznej lub formulacji terapeutycznej do nadawania immunoochronności wobec ponownego uzyskania uzależniającej chęci przyjmowania morfiny-heroiny i utrzymania długotrwałej abstynencji u osobników doświadczalnych uprzednio detoksykowanychh z uzależnienia od morfiny lub heroiny. [0027] Dodatkowym celem niniejszego ujawnienia jest ujawnienie syntezy i struktury molekularnej terapeutycznej formulacji szczepionki przeciwko morfinie/heroinie, zwalidowanej w badaniach przedklinicznych na gryzoniach, gdzie ta formulacja szczepionki zawierającej toksoid tężcowy jako immunogenne białko nośnikowe, kowalencyjnie zhaptenizowane z morfiną, zapewnia potencjalne jej zastosowanie do oceny jej efektów terapeutycznych w fazach badań klinicznych, przez zapewnienie długoterminowej immunoochrony, 15

utrzymania długotrwałej abstynencji i zapobiegania nawrotom u osobników detoksykowanych z uzależnienia od morfiny lub heroiny. [0028] Ostatecznym celem niniejszego ujawnienia jest ujawnienie ogólnej metodologii zastosowanej do projektowania, opracowania, zastosowania i walidacji skutecznej i nietoksycznej terapii, której mechanizm działania różni się od dostępnych obecnie klasycznych związków terapeutycznych, przez wzmacnianie farmakokinetycznych zmian wyżej wspomnianych opiatów, co prowadzi do efektywnego zmniejszenia ich przenikania przez barierę krew-mózg, po podawaniu ich osobnikom hiperimmunizowanym wcześniej szczepionym przeciwko obu nadużywanym narkotykom opiatowym. [0029] Łącznie, niniejsze ujawnienie ujawnia i dostarcza pełnego opisu metodologii i procesów koniecznych do wytworzenia pośrednich pochodnych do syntezy szczepionki przeciw morfinie/heroinie, kompozycji farmaceutycznych lub formulacji terapeutycznych, w tym metod i zastosowań terapeutycznych wobec uzależnienia od morfiny- heroiny. KRÓTKI OPIS FIGUR [0030] Figura 1 przedstawia reprezentatywny immunoenzymatyczny test wychwytywania przeciwciała ELISA pokazując silną humoralną odpowiedź odpornościową wywołaną przez nowy immunogen toksoid tężcowymorfina charakteryzujący się wysokim mianem przeciwciał w surowicy wytworzonych przeciw tym narkotykom opiatowym; Figura 2 pokazuje reprezentatywny wykres, który przedstawia monitorowanie humoralnej odpowiedzi odpornościowej mian surowiczych przeciwciał morfiny / heroiny u szczurów, oznaczonych ilościowo za pomocą testu wychwytywania przeciwciał ELISA, po czterech kolejnych pobudzeniach nowym immunogenem toksoid tężcowy-morfina podczas harmonogramu aktywnego szczepienia u szczurów; Figura 3 przedstawia reprezentatywny wykres immunoenzymatycznego testu wychwytywania przeciwciała ELISA zastosowanego do monitorowania zachowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej po ostatniej ponownej immunizacji (czwartej) nowym immunogenem toksoid tężcowy-morfina; Figura 4 przedstawia reprezentatywny wykres immunoenzymatycznego testu wychwytywania przeciwciała ELISA zastosowanego do monitorowania odzyskiwania mian specyficznych przeciwciał morfiny / heroiny indukowanych po kolejnym piątym pobudzeniu nowym immunogenem toksoid tężcowy-morfina; Figura 5 przedstawia kompetycyjny test immunoenzymatyczny ELISA zastosowany do oceny potencjalnego krzyżowego rozpoznawania przez surowicze przeciwciała przeciw morfinie / heroinie różnych strukturalnych analogów morfiny i heroiny, stosowanych w klasycznej terapii przeciwuzależnieniowej wobec tych dwóch związków opiatowych, w tym metabolitów biotransformacyjnych tych dwóch narkotyków, jak również różnych endogennych neuropeptydów opioidowych zaangażowanych w regulację różnych fizjologicznych i neurobiologicznych aktywności w OUN u ssaków; Figura 6 pokazuje immunoochronny efekt wywołany przez aktywne szczepienie szczura immunogenem toksoid tężcowy-morfina w celu tłumienia zachowania dożylnego samopodawania heroiny u tego samego zwierzęcia; i w końcu 16

Figura 7 pokazuje immunoochronny efekt wywołany przez aktywne szczepienie szczura immunogenem toksoid tężcowy-morfina w celu tłumienia zachowania dożylnego samopodawania morfiny u tego samego zwierzęcia; SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0031] Literatura naukowa, o której mowa w tej części, w szczegółach opisuje dostępne informacje dla specjalisty w dziedzinie. Niniejsze ujawnienie ujawnia i dostarcza terapeutycznego leczenia uzależnienia od morfiny i heroiny. Terapia ta oparta jest na farmakologicznej zasadzie, która opisuje aktywne szczepienie osobników, wcześniej uzależnionych i następnie detoksykowanych, za pomocą nowej kompozycji strukturalnego koniugatu białko nośnikowe-narkotyk haptenowy przeciwko tym obu opiatom. Skład chemiczny tego terapeutycznego koniugatu według niniejszego wynalazku składa się z morfiny jako haptenowego narkotyku i toksoidu tężcowego jako wysoce immunogennego białka nośnikowego, przy czym to ostatnie jest białkiem nośnikowym będącym wysoce immunogennym licencjonowanym białkiem stosowanym w protokołach szczepień ludzi. Ten wysoce immunogenny koniugat morfiny jest w stanie stymulować generowanie wysokich i trwałych mian surowiczych przeciwciał przeciwko haptenizowanej morfinie, gdy detoksykowani osobnicy, pod kątem uzależnienia od opiatów, otrzymują tę terapeutyczną formulację. Tak więc, zastosowanie oraz aplikowanie odpowiednich protokołów aktywnej immunizacji, wywołujących syntezę i zwiększenie generowania wysokiego miana surowiczych przeciwciał przeciwko morfinie, które, po kolejnej ekspozycji na narkotyk, rozpoznają i wiążą się wybiórczo i z dużym powinowactwem do "wolnej" niezwiązanej frakcji narkotyku w osoczu. Proces ten prowadzi ostatecznie do znaczącej neutralizacji i / lub zapobieżenia przenikaniu bariery krew-mózg narkotyku opiatowego, w ten sposób zmniejszając lub zapobiegając znacząco właściwościom wzmacniającym opiatów w mózgu. Tak więc, morfina i / lub heroina są neutralizowane przed dotarciem do tkanki mózgowej, a tym samym, detoksykowany uzależniony osobnik nie jest wynagradzany przez wzmacniające właściwości farmakologiczne tych dwóch narkotyków, które ostatecznie stanowią podstawowy "farmakologiczny układ napędzający", przez który te dwa opiaty zwiększają swoją narkotyczną aktywność wzmacniającą systemów nagradzania w mózgu. Paradygmat aktywnej immunizacji wyzwalający neutralizującą aktywność tych opiatów pojawia się u zaszczepionych osobników leczonych biwalentną szczepionką przeciw uzależnieniu od morfiny-heroiny według wynalazku, po długoterminowym okresie (np. 3-6 miesięcy). Jest to głównie spowodowane długoterminową aktywnością humoralnej odpowiedzi odpornościowej odpowiedzialnej za neutralizowanie tych narkotyków opiatowych w osoczu, w którą zaangażowane są specyficzne surowicze przeciwciała przeciwko haptenizowanemu narkotykowi. W związku z tym, oczekuje się, że ustalona długoterminowa stabilność odpowiedzi odpornościowej, która generuje wysokie miana przeciwciał przeciwko haptenowemu narkotykowi, indukowane przez terapeutyczną kompozycję według niniejszego wynalazku, stanowi skuteczny mechanizm immunogenny do utrzymywania długotrwałej abstynencji i / lub zapobiegania nawrotom uzależnienia od morfiny i heroiny u uprzednio detoksykowanych osobników. Ponadto, podejście polegające na terapeutycznym szczepieniu przeciwko uzależnieniu od morfiny / heroiny według niniejszego ujawnienia jest kompatybilne z innymi terapiami stosowanymi obecnie do utrzymywania długotrwałej abstynencji i / lub zapobiegania nawrotom uzależnienia od opiatów. W związku z tym wiele 17

środków farmakologicznych używanych do tych celów terapeutycznych, takich jak metadon, buprenorfina, nalokson, naltrekson, łącznie z wieloma innymi wymienionymi, najbardziej selektywnymi związkami terapeutycznymi stosowanymi w klinikach, może być stosowanych jednocześnie z terapią szczepienia ujawnioną w niniejszym ujawnieniu. PRZYKŁADY [0032] 1. SCHEMATYCZNE PRZEDSTAWIENIE STRUKTURY MOLEKULARNEJ CHEMICZNEJ KOMERCYJ- NEGO FORMULACJI MORFINY STOSOWANEJ JAKO HAPTEN DO SPORZĄDZENIA BIWALENTNEJ SZCZEPIONKI PRZECIWKO UZALEŻNIENIU OD MORFINY-HEROINY. Chemiczny komercyjny preparat (Sigma-Aldrich) pięciowodnego siarczanu morfiny (MW 758,8, C 34 H 40 N 2 O 10 S) użyto jako (patrz poniżej, punkt (a), zgodnie z opisem w rozdziale "PROCES REAKCJI WYTWARZANIA POCHODNYCH PRODUK- TÓW POŚREDNICH UŻYWANYCH DO SYNTEZY BIWALENTNEJ SZCZEPIONKI PRZECIWKO UZA- LEŻNIENIU OD MORFINY-HEROINY") został użyty jako związek wyjściowyo do syntezy zasady morfiny, a następnie do syntezy pośredniej pochodnej morfino -6-hemibursztynianu. Ta pośrednia pochodna następnie została haptenizowana przez wolne grupy epsilon aminowe łańcucha bocznego eksponowanych reszt lizynowych z toksoidem tężcowym przez sekwencyjne kowalencyjne sieciowanie z homo-i heterodwufunkcyjnymi odczynnikami sieciującymi, odpowiednio EDC i TFCS. 2. SCHEMATYCZNE PRZEDSTAWIENIE STRUKTURALNEJ FORMULACJI POŚREDNIEJ PO- CHODNEJ - 3-O-KARBOKSYMETYLO-MORFINY Ta pośrednia pochodna morfiny została zsyntetyzowana i zastosowana przez wiele grup naukowców i była również stosowana w niniejszym wynalazku do kowalencyjnej haptenizacji morfiny z toksoidem tężcowym, jako alternatywna biwalentna szczepionka 18

przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny; 3. SCHEMATYCZNE PRZEDSTAWIENIE STRUKTURALNEJ FORMULACJI POŚREDNIEJ PO- CHODNEJ - MORFINO-6- HEMIBURSZTYNIANU. Ta pośrednia pochodna morfiny została zsyntetyzowane i stosowana przez wiele grup naukowców i zastosowana w niniejszym wynalazku biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny do kowalencyjnej haptenizacji tej opiatowej substancji z toksoidem tężcowym; 4. SCHEMATYCZNE PRZEDSTAWIENIE STRUKTURALNEJ FORMULACJI POŚREDNICH PO- CHODNYCH - 3-O-KARBOKSY-METYLO-MORFINY I MORFINO-6-HEMIBURSZTYNIANU KOWA- LENCYJNIE SKONDENSOWANYCH Z 1-ETYLO-3-(3- DIMETYLOAMINOPROPYLO)KARBODIIMIDEM (EDC). Reagent chemiczny 1-etylo-3-(3- dimetyloaminopropylo)karbodiimid (EDC), jest stosowany przez kilku badaczy do przeprowadzenia reakcji kowalencyjnej haptenizacji pośredniej pochodnej 3-O-karboksymetylo-morfiny z białkami nośnikowymi, takimi jak KLH i BSA. EDC zostało również użyte do kowalencyjnej haptenizacji pośredniej pochodnej morfino-6-hemibursztynianu z pośrednim produktem kompleksem toksoid tężcowy-tfsc w niniejszym wynalazku biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny (patrz schematy re- 19

akcji syntezy chemicznej w przykładach 5 (a-c) i 7 (a i b). Synteza biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny. [0033] Synteza immunogennego koniugatu morfiny według niniejszego wynalazku wymaga początkowej chemicznej modyfikacji cząsteczki morfiny do wytworzania wysokoreaktywnej strukturalnej pochodnej tego opiatu, która dostarcza wolnych reaktywnych grup karboksylowych, wykorzystywanych do kowalencyjnego sieciowienia dwóch heterobifunkcyjnych reagentów potrzebnych do wytworzenia chemicznej struktury ramion linkera, który wiąże się z grupami epsilon aminowymi łańcucha bocznego eksponowanych reszt lizynowych w toksoidzie tężcowym, białku nośnikowym stosowanym w niniejszym wynalazku (patrz przykład 6). Niewiele jest procedur chemicznego sprzęgania stosowanych do modyfikacji struktury i aktywacji zarówno 3 jak i 6 reaktywnej grupy hydroksylowej pierścienia fenantrenowego w cząsteczce morfiny w celu sieciowania z heterobifunkcyjnymi reagentami (Robert T. Morrison and Robert N. Boyd, Organic Chemistry, 7th Ed., 2003) i tylko nieliczne metody syntezy chemicznej z zastosowaniem tego podejścia zostały opisane. W tym kontekście, od początku lat 70-tych, różne grupy badawcze (B. Wainer et al., Science 176: 1143-1145, 1972; B. Wainer et al., Science 178: 647. 1972; B. Wainer et al., J. Immunol. 110(3):667-673, 1973; Wainer et al., Nature, 241:537-538, 1973 and B. Hill et al., J. Immunol. 114:1363-1368, 1975) donieśli o nieopatentowanej, opartej na klasycznej chemii metodyce, którą obecnie można znaleźć w podręcznikach chemii organicznej, w której stosuje się bezwodnik bursztynianowy jako reagent do modyfikowania reaktywnej grupy 6- hydroksylowej fenantrenowej struktury pierścieniowej w cząsteczce morfiny. Ten pierwotny pośredni związek morfiny, zwany morfino- 6-hemibursztynianem (patrz przykład 3, i struktura (b) w przykładzie 5), różni się od morfiny wysoko reaktywną wolną grupą kwasu karboksylowego w estrze sukcynylowym (wcześniej związanym z cząsteczką morfiny), który może zostać kowalencyjnie związany (patrz struktura (a) w przykładzie 5) z homobifunkcyjnymi reagentami sieciującymi, takimi jak 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimid (EDC) (patrz przykład 3 i struktura w przykładzie 5). Reagent ten jest szeroko stosowany w chemicznych reakcjach kowalencyjnego sieciowiania do kowalencyjnej kondensacji wolnych funkcyjnych grup aminowych 20

i karboksylowych w cząsteczkach donora (S. Hockfield et al., Molecular Probes of the Nervous System: Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes, Vol. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Cork, 1993). [0034] Ponieważ morfina sama w sobie nie jest cząsteczką immunogenną, wytwarzanie humoralnej odpowiedzi odpornościowej z wysokim mianem swoistych przeciwciał wobec cząsteczek o stosunkowo niskiej złożoności strukturalnej, takich jak te opiaty, stanowi poważne wyzwanie metodologiczne. W niniejszym ujawnieniu struktura koniugatu morfiny najpierw została zaprojektowana, a następnie przeprowadzono syntezę pośredniej pochodnej morfino-6-hemibursztynianu (struktura (b) w przykładzie 5), którą z kolei haptenizowano kowalencyjnie z resztami lizynowymi toksoidu tężcowego, użytego jako białko nośnikowe, przez sekwencyjną syntezę ramienia linkera, strukturalnie ukształtowanego przez chemiczną kondensację 1-etylo- 3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (określanego nazwą handlową związku EDC, patrz przykład 5) i estru N-(ε-trifluoracetylkaproiloksy)-sukcyimidu określanego (nazwą handlową związku TFCS, patrz przykład 6). Procedura ta, oparta na kowalencyjnej kondensacji morfiny heptanizowanej z toksoidem tężcowym przez to długie ramię linkera, utworzonego przez kowalencyjną kondensację reagentów EDC i TFC, daje cząsteczce morfiny trwałość strukturalną po haptenizacji z toksoidem tężcowym. W tym kontekście strukturalnym, oczekuje się, że morfina pozostanie przymocowana do białka nośnikowego w taki sposób, że zachowa swoją oryginalną przestrzenną konfigurację. W zasadzie może to ułatwić dostęp do innych wolnych domen i / lub reaktywnych grup w cząsteczce morfiny, innych niż aktywne domeny narkotyku opiatowego biorące udział w kowalencyjnej haptenizacji z białkiem nośnikowym, i w ten sposób domeny te mogą brać udział, jako dominujące domeny antygenowe lub determinanty antygenowe, w rozpoznawaniu natywnej cząsteczki narkotyku rozpoznawanej przez humoralną odpowiedź odpornościową. Ponadto, natura chemiczna węglowodorowej struktury ramienia linkera (patrz przykład 6) nadaje temu szkieletowi węglowemu strukturę w pełni obojętną wobec jakiejkolwiek reaktywności chemicznej, a w ten sposób, bardzo niską immunogenność per se. Te strukturalne i funkcjonalne właściwości nadawane przez węglowodorowe ramię linkera mogą przyczynić się do epitogennej immuno-dominującej roli morfiny w strukturalnyej formulacji biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny według niniejszego wynalazku. Wskazane powyżej możliwości, strukturalne i funkcjonalne zalety niniejszego wynalazku są poparte wynikami doświadczalnymi pokazującymi wysoką skuteczność w wytwarzaniu silnej humoralnej odpowiedzi odpornościowej (patrz figury 1 i 2) o wysokim i trwałym mianie specyficznych surowiczych przeciwciał (patrz figury 3 i 4), które krzyżowo rozpoznają z równoważną swoistością niehaptenizowaną morfinę, włączając analogi strukturalne opiatów, heroinę i metabolity opiatów endogennych, takie jak 6-monoacetylomorfina, i ich aktywne (uzależniające) glukuronidowe produkty uboczne (np. morfino-3-6-glukuronidy) (patrz figura 5). Najbardziej prawdopodobne wyjaśnienie specyficzności tej humoralnej odpowiedzi odpornościowej wywołanej przez nasz model nowej szczepionki przeciw tym związkom opiatowym opiera się na antygenowej prezentacji różnych domen strukturalnych morfiny układowi odpornościowemu. Wydaje się, że jest to spowodowane strukturalną długością ramienia linkera, który oddziela morfinę od toksoidu tężcowego w taki sposób, który umożliwia reakcję układu odpornościowego z konkretnymi determinantami antygenowymi fenantrenowej struktury morfiny wspólnej dla innych analogów strukturalnych opiatów i ich endogennych metabolitów (czyli heroino- i morfino-3-6-glukuronidów). 21

5. PROCEDURY I REAKCJE STOSOWANE DO WYTWARZANIA POŚREDNIEJ POCHODNEJ MORFINY WYMAGANEJ DO SYNTEZY BIWALENTNEJ SZCZEPIONKI PRZECIWKO UZALEŻNIENIU OD MORFI- NY-HEROINY [0035] a) Wstępne wytworzenie morfiny zasady z soli pięciowodnego siarczanu morfiny. ( komercyjnie dostępnej chemicznej formulacji morfiny.). Morfinę zasadę (struktura (a) z przykładu 5) zsyntetyzowano z komercyjnej soli siarczanowej tej substancji opiatowej (Sigma-Aldrich), zgodnie z klasyczną procedurą chemiczną, o której doniesiono w 1972 by E. J. Simon (E. J. Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 1835-1837, 1972). Reakcję tę prowadzono w następujący sposób; 64 mg siarczanu morfiny/ml rozpuszczono w wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu. ph tego roztworu doprowadzono do 8,0 stosując NH 4 OH. Przy ph 8,0 morfinę zasadę krystalizowano przez wytrącenie, następnie przesączono i suszono przez odparowanie w 60 C w warunkach próżniowych. b) Wytwarzanie pośredniej pochodnej - morfino-6-hemibursztynianu (M-6-H). Związek M-6-H otrzymano z morfiny zasady, zgodnie z następującym protokołem i poddano modyfikacjom według standardowych pionierskich procedur opisanych w latach 70-tych przez B. Wainer et al., Science, 176-1143- 1145, 1972; B. H. Wainer et al., Science, 178:647, 1972, B. Wainer et al., J. Immunol. 110 (3):667-673, 1973; Wainer et al., Nature, 241:537-538,1973 and B. Hill et al., J. Immunol. 114:1363-1368, 1975. Procedurę reakcji chemicznej przeprowadzono w następujący sposób; na każdy gram morfiny zasady do mieszaniny reakcyjnej dodano 2 gramy bezwodnika bursztynowego (Sigma-Aldrich), a następnie inkubowano z 20 ml pirydyny lub suchego benzenu w kolbie szklanej utrzymując ciągłe wrzenie. Po ogrzewaniu mieszaniny reakcyjnej do 6 godzin w temperaturze wrzenia (70-80 C), mieszaninę reakcyjną powoli schłodzono do temperatury pokojowej, a nadmiar pirydyny lub benzenu zdekantowano. Resztę tych ostatnich składników organicznych odparowano za pomocą ciągłego strumienia azotu pod obniżonym ciśnieniem, tworząc suchy pozostałościowy produkt, którym jest M-6-H. Produkt został przemyty 10- krotnie 60% roztworem etanolu w wodzie destylowanej w celu osiągnięcia rekrystalizacji pozostałości M- 6-H (przykład 5 (b)).procentowy uzysk produktu został obliczony ilościowo przy użyciu standardowej metody analitycznej, przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej (TLC - inicjały skróconej oryginalnej nomenklatury tej procedury) (B. Wainer et al., Science 176:1143-1145, 1972). Metoda ta została przeprowadzona następująco; 100 µg syntetycznego produktu M-6-H i równoważną ilość morfiny zasady (związek zastosowano jako kontrolę referencyjną) rozpuszczono w układzie rozpuszczalników octan etylu: metanol: wodorotlenek amonu (85 :10 : 5, obj. : obj. : obj.), a następnie próbkowano 1 ml / ścieżkę, suszono w temperaturze pokojowej i przeprowadzono chromatografię cienkowarstwową z matrycą krzemionkową w wyżej wymienionym układzie rozpuszczalników. Po chromatograficznym rozdziale związków, krzemionkowa cienka warstwa jest wystawiona na działanie lampy UV przy 285 nm (ta długość fali jest zwykle wykorzystywana do pobudzenia chromoforu reprezentowanego przez pierścień fenolowy w fenantrenowej strukturze wolnej morfiny i M-6-H odpowiednio. W tym przypadku profil TLC syntetycznego produktu M-6-H wykazywał względny współczynnik mobilności (Rf, konwencjonalny skrót w języku angielskim Retention factor [współczynnik retencji]) około 0,1-0,15, a dla morfiny wolnej zasady Rf był 22

większy i wynosił około 0,3-0,4. Średnia wydajność standardowej reakcji syntezy produktu M-6-H wynosiła zawsze około 95% lub więcej. c) Wytwarzanie pośredniej pochodnej EDC-morfino-6-hemibursztynianu. W celu osiągnięcia kowalencyjnej haptenizacji M-6-H z białkiem nośnikowym, pośrednia pochodna M-6-H została kowalencyjnie sprzężono przez wolne grupy sukcynylokarboksylowe z homobifunkcyjnym kowalencyjnym reagentem sieciującym EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidem (Pierce)) (patrz rysunek (c) w przykładzie 5), zgodnie ze standardowym protokołem opisanym przez producenta (Pierce). Podczas tej reakcji kondensacji, nadmiar EDC, który nie przereagował z grupą sukcynylokarboksylową jest szybko hydrolizowany do niereaktywnej pośredniej pochodnej, ze względu na dużą nietrwałość tego reagenta po umieszczeniu w roztworze wodnym. Tak więc, standardowa reakcja sprzęgania polega na zmieszaniu 100 mg EDC na każde 100 mg M-6-H rozpuszczonego w 100 ml destylowanej H 2 O, przy ph 5,5, ustawionym 1N roztworem HCl. Mieszaninę reakcyjną następnie inkubowano w 37 C przez 2 godziny przy ciągłym mieszaniu. W tych warunkach wydajność otrzymywania produktu EDC-(M-6-H) wynosi, w tych warunkach sprzęgania, regularnie około 98%. To oszacowanie otrzymano przez miareczkowanie 1N roztworem NaOH wolnych grup karboksylowych równoważnych próbek zarówno produktu M-6-H, stosowanego jako kontrola, jak i produktu EDC-(M-6-H) z, co jest standardową biochemiczną procedurą zwykle stosowaną do potwierdzenia obecności wolnych grup karboksylowych przy wartości pk około 4,2. W tej procedurze reakcji uzyskuje się optymalną wydajność syntetycznego produktu EDC-(M-6-H), który jest zazwyczaj niestabilny w roztworach wodnych i dlatego wymaga natychmiastowej reakcji z grupami aminowymi pośredniej pochodnej toksoid tężcowy -TFCS, której syntezę ujawniono w niniejszym wynalazku biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny, i służy jako białko nośnikowe w tym samym wynalazku. 23

bursztynowy 6. PROCES REAKCYJNY STOSOWANY DO WYTWARZANIA TOKSOIDU TĘŻCOWEGO - POŚREDNIEJ POCHODNEJ STOSOWANEJ JAKO BIAŁKO NOŚNIKOWE (CP) KOWALENCYJNIE SKONDENSOWA- NE Z ESTREM N-(ε-TRIFLUORACETYLOKAPROILOKSY)-SUKCYIMIDU (TFC): KOMPLEKS CP-TFCS [0036] Preparat toksoidu tężcowego jako białka nośnikowego ( CP) w niniejszym wynalazku biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny, miał certyfikowany stopień czystości ( 98% ) i całkowity brak toksyczności. Ten preparat białkowy jest utworzony przez podjednostkę H-polipeptydu, która zawiera około 858 reszt aminokwasowych, o masie cząsteczkowej około 100 kda. Ta białkowa podjednostka uzyskana standardowymi technikami rekombinacji DNA, jest kodowana przez gen Clostridium tetani, 24

który wytwarza natywną bakteryjną toksynę tężcową i zawiera tylko 68 kopii reszt lizynowych w jego pierwotnej sekwencji aminokwasowej H-polipeptydu białka toksoidu, podczas gdy natywna toksyna tężcowa składa się z 1313 aminokwasów, co daje jej wysoką masę cząsteczkową 150700 daltonów (150,7 kd). W celu syntezy reaktywnego związku pośredniego toksoid tężcowy - TFCS, ε - aminowe miejsca w eksponowanych resztach lizynowych w tym białku są kowalencyjnie sprzęgane z estrem N-(εtrifluoracetylokaproiloksy)-sukcyimidu ( TFC, Pierce ) ( patrz figury (a), (b), (c) w przykładzie 6 ). TFCS jest heterobifunkcyjnym kowalencyjnym reagentem sieciującym stosowanym do sprzęgania, przy ph 7-7,5, wolnych grup ε - aminowych łańcucha bocznego eksponowanych reszt lizynowych z białek o dużej masie cząsteczkowej przez miejsce aktywne jego esteru N - hydroksysukcyimidu. Tak więc, reakcja ta zwiększa syntezę pośredniej pochodnej toksoid tężcowy- TFCS przez tworzenie stabilnych wiązań amidowych. Procedura reakcji stosowanej do syntezy koniugatu toksoid tężcowy-tfcs, jako pośredni etap niezbędny do syntezy według niniejszego wynalazku biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny, jest opisana na figurze ( b ) w przykładzie 6. Procedury sprzęgania i warunki doświadczalne stosowane do przeprowadzania typowej syntezy tego kompleksu białko nośnikowe - TFCS polegają na początkowym przygotowaniu 40 mg / ml roztworu zapasowego TFC S(134 mm ) (zawsze świeżo przygotowany bezpośrednio przed użyciem) przy czym roztwór zawiera 10-20% DMSO / 90-80% dejonizowanej H 2 O (obj. : obj.). Reagent TFCS jest natychmiast mieszany z białkiem toksoidem tężcowym, w stosunku molowym 10-20- krotnego nadmiaru TFCS w stosunku do samego toksoidu tężcowego. Tak więc, na przykład, typowa reakcja obejmuje mieszaninę 100 mg (0,5 mm) toksoidu tężcowego rozpuszczonego w 4 ml roztworu zawierającego roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS = 0,1 M PB/0,15 mm NaCl, ph 7,2) z 50 ml zapasowego roztworu TFCS (końcowe stężenie TFCS i DMSO osiągnięte w roztworze mieszaniny toksoid tężcowy - roztwor TFCS wynosi odpowiednio 6,7 mm i 0,5-1%,). Godny uwagi jest fakt, że początkowe stężenie DM- SO w reakcji kowalencyjnej kondensacji białka nośnikowego z odczynnikiem TFCS powinno osiągnąć końcowe rozcieńczenie 1:10-20 (obj. : obj.), w celu zapobiegania tworzeniu się osadów białka w mieszaninie. Reakcja kondensacji zachodząca między toksoidem tężcowym i TFCS powinna odbywać się w temperaturze pokojowej przez 60-90 minut, aby osiągnąć pełną syntezę produktu toksoid tężcowy-tfcs. Ta pośrednia pochodna wciąż zachowuje reaktywną grupę aminową chronioną chemicznie przez grupę trifluoroacetylową (patrz figua (b) w przykładzie 6), która po dodatkowej 2-3 godzinnej inkubacji produktu w temperaturze pokojowej w roztworze PBS przy ph 8-8,5 jest następnie hydrolizowana. ph tego ostatniego roztworu buforowanego fosforanem powinno być nastawione za pomocą 10 N roztworu NaOH. W tych warunkach eksperymentalnych, wolne reaktywne grupy aminowe w sprzężonym związku TFCS są wytwarzane na odblokowanym końcu kompleksu toksoid tężcowy -TFCS ( patrz figura (b) w przykładzie 6). Ten końcowy produkt pośrednia pochodna toksoid tężcowy - TFCS jest następnie poddawany procedurom oczyszczania przy użyciu standardowych protokołów dializy. W skrócie ta metoda polega na inkubacji koniugatu toksoid tężcowy - TFCS umieszczonego wewnątrz membrany dializacyjnej odcinającej 10 kda (Sigma - Aldrich ) w warunkach 25

6 litrów 0,1 M roztworu buforu fosforanowego, ph 7,2, w 4 C, zmienianego co 8 godzin w czasie 24 godzin. Usunięcie grupy trifluorooctanowej Inkubacja przy ph8,1 0,1M bufor fosforanowy 7. POŚREDNIE POCHODNE TOKSOID TĘŻCOWY-TFCS: SYNTEZA KOŃCOWEJ STRUKTURALNEJ FORMULACJI BIWALENTNEJ SZCZEPIONKI PRZECIWKO UZALEŻNIENIU OD MORFINY-HEROINY [0037] Kowalencyjną kondensację produktu pośredniego morfiny, EDC - (M-6-H), z kompleksem toksoid tężcowy-tfc (patrz figura (a) w przykładzie 7) uzyskuje się poprzez stabilne kowalencyjne wiązanie amidowe, utworzone po reakcji między wolnymi grupami karboksylowymi eksponowanymi na końcu koniugatu EDC- (M-6-H) i niechronionymi wolnymi grupami aminowymi reagentu TFCS związanego z toksoidem tężcowym (kompleks molekularny TFCS toksoid tężcowy, patrz figura (b) na przykład 7). [0038] Ponieważ procedury pełnej syntezy i oczyszczania pochodnej toksoid tężcowy -TFCS wymagająa co najmniej 24 godzin, synteza koniugatu EDC-(M-6-H) powinna zostać przeprowadzona zaraz po zakończeniu etapów reakcji oczyszczania koniugatu toksoid tężcowy -TFCS. Jest to spowodowane przede wszystkim faktem, że EDC-(M-6-H) jest produktem bardzo niestabilnym i łatwo ulega hydrolizie pod wpływem przedłużonego przechowywania (tj. więcej niż dwie godziny), nawet w temperaturze poniżej 10 C. Inne ważne za- 26

gadnienia, które wymagają znacznej uwagi przy optymalizacji kowalencyjnej kondensacji koniugatu EDC-(M- 6-H) z produktem toksoid tężcowy TFCS, dotyczą stężenia reagentów dodawanych w reakcji chemicznej. Toksoid tężcowy jako białko nośnikowe ma masę cząsteczkową wynoszącą około 100 kda i zawiera w przybliżeniu 68 reszt lizynowych. Eksponowane grupy ε-aminowe (centra aktywne) w łańcuchu bocznym tych reszt aminokwasowych pozwalają na kowalencyjną kondensację TFCS podczas syntezy niniejszego wynalazku biwalentnej szczepionki przeciwko morfinie - heroinie. W związku z tym, każdy µmol toksoidu tężcowego (100 mg) zawiera w przybliżeniu do 0,07 µmola dostępnych miejsc aktywnych (niechronione wolne grupy aminowe), które mogą być połączone kowalencyjnie z reagentem TFCS. Ponadto, nasza reakcja kondensacji pośredniej pochodnej EDC-(M-6-H) z koniugatem toksoid tężcowy - TFCS wykorzystuje stechiometryczny stosunek mol : mol 100 µmol EDC-(M-6-H) na każde 0,07 µmola grup aminowych koniugatu toksoid tężcowy -TFCS. [0039] W typowej formulacji kowalencyjnej kondensacji pośredniej pochodnej EDC-(M-6-H) z koniugatem toksoid tężcowy-tfcs, stężenie reagentów i warunki reakcji wymagają mieszaniny 100 mg kompleksu toksoid tężcowy-tfcs (1 µmol toksoid tężcowy -TFCS = 0,07 µmol awolnych grup aminowych / miejsc aktywnych) oraz 30 mg pośredniej pochodnej EDC-(M-6-H) ( 70 µmol miejsc aktywnych dla kowalencyjnej kondensacji), rozpuszczonej w 100 ml roztworu buforowego 0,1M fosforan / 0,15 M NaCl doprowadzającego ph do 7-7,5 (obliczona masa cząsteczkowa ostatniego związku EDC (M-6-H) 426,37 daltonów). Mieszaninę reakcyjną inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 2-3 godziny przy ciągłym mieszaniu. Otrzymany syntetyczny produkt, szczepionkę, morfino-6-hemisukcynyl-toksoid tężcowy, oczyszcza się następnie za pomocą standardowych procedur dializy używając membrany dializacyjnej o odcięciu 10 kda (Sigma - Aldrich ) wobec 6 litrów 0,1 M roztworu buforu fosforanowego, ph 7,2, w 4 C, w czasie 48 godzin, w celu usunięcia produktów ubocznych powstałych w czasie reakcji, takich jak mocznik i niezhaptenizowana pośrednia pochodna EDC-(M-H-6). [0040] Po zakończeniu oczyszczania szczepionki morfino-6-hemisukcynyl-toksoid tężcowy, przedializowany roztwór następnie wyjaławia się przez filtrację przy użyciu filtrów membranowych o wielkości porów 0,45 µm (Gelman Sci) w warunkach nadciśnienia. Wreszcie, porcję 1 ml przefiltrowanego roztworu sąt suszone w warunkach zamrożenia, liofilizowane w sterylnych szklanych fiolkach, zamykane próżniowo i przechowywane w 4 C. Do terapeutycznej formulacji biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny według niniejszego wynalazku można dodać kilka środków stosowanych zwykle do stabilizacji i zapobiegania degradacji koniugatów podczas procedury suszenia w warunkach zamrożenia i przechowywania (E. Harlow and D. Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1988). Przykłady wybranych środków, wśród wielu innych obejmują substancję żelującą, pepton, dekstrynę, metylocelulozę, sacharozę, laktozę, maltozę, glukozę, fruktozę, sorbitol, mannitol, glicerol, inozytol, kwas cytrynowy, kwas winowy, glikol polietylenowy, poliwinylopirolidon. Każda fiolka z biwalentną szczepionką przeciw uzależnieniu od heroiny-morfiny zawiera średnią dawkę około 1 mg liofilizowanego produktu toksoidu tężcowego używanego jako " referencyjna jednostka dawkowania". Stężenie białka w każdej jednostce dawki biwalentnej szczepionki określono standardową metodą ilościowego oznaczania białka za pomocą zestawu reakcja kwasu bis-cynchoninowego, zgodnie z procedurami zalecanymi przez producenta (Pierce Chemical). Ilościowy pomiar procentowy włączenia pośredniej pochodnej EDC-(M-6-H) kowalencyjnie skondenso- 27

wanej z wolnymi grupami aminowymi kompleksu toksoid tężcowy-tfcs przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami miareczkowania, stosując jako reagent odczynnik O-ftalaldehyd do miareczkowania ilości wolnych grup aminowych w pośredniej pochodnej toksoid tężcowy -TFCS (J. Cashman et al, J. Pharmacol. Exper. Ther. 293: 952-961, 2000). W niniejszej formulacji biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny uzyskuje się zwykle wydajność procentową do 75-85 % haptenowej koniugacji (morfiny) z nośnikiem białkowym (toksoidem tężcowym). [0041] Uzyskany produkt końcowy może być następnie stosowany w eksperymentach aktywnej immunizacji przeciwko morfinie-heroinie i/lub jako antygen adsorbowany w fazie stałeja w testach immunologicznych (np. ELISA). [0042] W niniejszym ujawnieniu koniugat morfino-6-hemisukcynyl-bsa został zsyntetyzowany równolegle z biwalentną szczepionką przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny według niniejszego wynalazku z zastosowaniem podobnych protokołów do syntezy tej ostatniej szczepionki. Racjonalnym uzasadnieniem dla zsyntetyzowania tego dodatkowego koniugatu morfiny było wykorzystanie go jako antygenu morfiny adsorbowanego w fazie stałej naszych immunoenzymatycznych testach wychwytu przeciwciała ELISA. Te ostatnie testy były stosowane do identyfikacji, monitorowania, oznaczania ilościowego (figury 1, 2, 3 i 4) i walidowania specyficzności (figura 5) humoralnej odpowiedzi odpornościowej indukowanej przez aktywne szczepienie formulacją terapeutyczną niniejszej biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny- heroiny. 28

EDC-(morfino-6-hemibursztynian) Synteza szczepionki Anty-morfina/heroina 2h w temperaturze pokojowej z 0,1M buforem fosforanowym ph 7,2-7,4 8. MOLEKULARNA STRUKTURA BIWALENTNEJ DWUWARTOŚCIOWEJ SZCZEPIONKI PRZECIWKO UZALEŻNIENIU OD MORFINY-HEROINY [0043] Strukturalna formulacja według niniejszego wynalazku biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny pokazuje po raz pierwszy zastosowanie reagenta chemicznego TFCS do syntezy długiego ramienia linkera do haptenizacji morfiny i / lub heroiny z toksoidem tężcowym. [0044] Całkowita wielkość molekularna 20,15 Å jest obliczana dla ramienia linkera, który oddziela zheptanizowaną morfinę kowalencyjnie związaną przez 6 atom węgla w jej strukturze pierścienia fenantrenowego. Wielkość tego linkera jest znacznie większa (patrz figura z przykładu 8) od tych stosowanych do syntezy immunogenów morfiny, o których donoszono. Przy tych ostatnich immunogenach stosowano reagent EDC jako homobifunkcyjny linker sieciujący EDC do kowalencyjnego połączenia 3-O-karboksymetylomorfiny i/lub M-6-H z grupami ε-aminowymi eksponowanych reszt lizynowych w cząsteczkach albo BSA albo KLH, stosowanych jako referencyjne białka nośnikowe. Na przykład immunogenny koniugat morfino-6-29

hemisukcynyl-bsa lub morfino-6- hemisukcynyl -KLH zawierają ramię linkera o wielkości około 12,4 Å, ponieważ brakuje w nim 6 atomów węgla przedłużenia wytwarzanego przez łańcuch węglowodorowy reagenta TFCS. Dodanie tego wodorowęglowego łańcucha z TFCS w naszej formulacji szczepionki zwiększa długość całego ramienia linkera o około 7,74 Å (patrz figura w przykładzie 8). Jak wspomniano powyżej, ta strukturalna innowacja polegająca na zwiększonej długości ramienia linkera w naszym nowym modelu szczepionki anty morfina - heroina, modelu ujawnionym w niniejszym wynalazku, wykazuje ważne zdolności funkcjonalne. Pokazują to następujące wnioski doświadczalne: a) wysoka immunogenność wywoływana przeciw haptenizowanej morfinie i/lub heroinie; i b) doskonała zdolność wyzwalania silnej humoralnej odpowiedzi odpornościowej z wysokimi i trwałymi mianami surowiczych specyficznych przeciwciał anty-morfinowych (figury 1, 2, 3, 4), które wykazują równoważne krzyżowe rozpoznawanie tego opiatu i jego strukturalnego analogu, heroiny (figura 5). Ponadto, prawdopodobna jest hipoteza, że większa długość tego nowego ramienia linkera wprowadzonego do formulacji strukturalnej naszego modelu biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny, przekłada się na strukturalne i funkcjonalne zalety, oparte na humoralnej odpowiedzi odpornościowej wytworzorzonej przez ten immunogen, w której surowicze przeciwciała rozpoznają krzyżowo, z równoważną specyficznością, immunogenne epitopy eksponowane układowi odpornościowemu szczepionych zwierząt przez haptenizowaną cząsteczkę morfiny, które są wspólne dla heroiny i jej metabolitów endogennych 3-monoacetylo-morfiny i 3- i 6- morfino-glukuronidu (figura 5). Dodatkowo, ujawnione w niniejszym wynalazku, aktywne szczepienie naszym nowym dwuwartościowym immunogenem morfinaheroina może być stosowane jako skuteczna procedura terapeutyczna do wywołania silnej humoralnej odpowiedzi odpornościowej zdolnej do immunoochrony przed przyjęciem uzależnieniowych zachowań, w stosunku do tych dwóch związków opiatowych u aktywnie zaszczepionego gospodarza. Wreszcie, ta humoralna odpowiedź odpornościowa wywołana przez aktywne szczepienie gospodarza, może dawać immunoochronę przeciwko endogennej aktywności wspomnianych metabolitów endogennych zarówno morfiny jak i heroiny, dla których wykazano wzmacniające uzależniające właściwości u osobników detoksykowanych i w stanie abstynencji od uzależnienia od tych związków opiatowych (figury 6 i 7). [0045] W skrócie, ramię linkera wykazuje wielkość cząsteczkową 20,15 Å, gdzie 7,74 Å środkowy segment odpowiada węglowodorowemu szkieletowi wprowadzonemu przez reagent TFCS, który został kowalencyjnie sprzężony z grupami ε-aminowymi eksponowanych reszt lizynowych toksoidu tężcowego będącego białkiem nośnikowym; 7,44 Å końcowy segment obejmuje atom węgla α i cztery następne atomy węgla łańcucha bocznego reszt lizynowych, a 4,97 Å skondensowany segment obejmuje resztę hemisukcynylu, która została kowalencyjnie związana przez grupę estrową z 6 atomem węgla struktury pierścienia fenantrenowego w cząsteczce morfiny, jak pokazano w następującym wzorze: 30

[0046] Oprócz syntetycznej strukturalnej formulacji, procedur oczyszczania i terapeutycznych zastosowań ujawnionego wynalazku biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny, ujawniono również uzupełniające procedury syntezy i oczyszczania innej strukturalnej formulacji tej biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny. Ta dodatkowa strukturalna formulacja biwalentnej szczepionki anty-morfina-heroina opiera się na alternatywnej syntezie pochodnej EDC-3-O-karboksymetylomorfiny przy użyciu tych samych, wcześniej opisanych w literaturze, protokołołów i procedur syntezy (S. Spector and C. W. Parker, Science, 168:1347, 1970; S.J. Spector, J. Pharmacol. Exp. Ther, 178:253, 1971; H. Van Vunakis et al., J. Pharmacol. Exp. Ther, 180:514, 1972 and S. Gross et al., Immunochemistry 11:453-456, 1974). Ta pochodna EDC-3-O-karboksymetylomorfina była również kowalencyjnie związana z koniugatem toksoid tężcowy-tfcs zgodnie z procedurami syntezy stosowanymi do syntezy strukturalnej formulacji biwalentnej szczepionki anty morfina-heroina według niniejszego wynalazku, z zastosowaniem następującej procedury: syntezy: 31

Synteza szczepionki anty-morfina/heroina 2h w temperaturze pokojowej z 0,1M buforem fosforanowym ph 7,2-7,4 Związek pośredni EDC-(3-O-karboksymetylomorfina) [0047] Ten alternatywny model biwalentnej szczepionki anty-morfina-heroina pokazuje inną strukturę ramienia łącznika o łącznej wielkości cząsteczkowej 16,47 Å, gdzie 9,03 Å segment obejmuje z prawej strony węglowodorowy szkielet wprowadzony przez reagent TFCS, połączony kowalencyjnie wiązaniem amidowym z resztą EDC-3-O-karboksymetylową w fenantrenowej strukturze pierścieniowej cząsteczki morfiny. 7,44 Å segment z lewej strony zawiera atom węgla α i cztery atomy węgla łańcucha bocznego reszt lizynowych toksoidu tężcowego, który został kowalencyjnie przyłączony przez grupę ε-aminową do końcowego segmentu z lewej strony reagenta TFCS, jak to przedstawiono w następującym wzorze: 32

ADIUWANTY [0048] Pomimo wysokiej masy cząsteczkowej i mnogości immunogennych epitopów wykazywanych przez immunokoniugaty zawierające kowalencyjnie przyłączone hapteny o małej złożoności strukturalnej, jak pokazano na naszym modelu nowej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny i heroiny, podawanie go osobnikowi wymaga dodatku związków adiuwantowych, znanych ze wzmacniania początkowej odpowiedzi odpornościowej E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp 96-97, 1988). W tym kontekście, adiuwanty są w stanie indukować silną humoralną i/lub komórkową odpowiedź odpornościową wobec licznych typów antygenów, które obejmują węglowodany, peptydy i białka. Zatem, wiele chemicznych preparatów adiuwantów jest zwalidowanych i stosowanych w protokołach aktywnych szczepień u gatunków zwierząt, które obejmują komercyjnie dostępne formulacje, takie jak emulsje woda-olej, które mogą ale nie muszą zawierać Mycobacterium tuberculosum inaktywowane przez ekspozycję na ciepło (Sigma - Aldrich ), RIBI (Ribi Immunochem Research, Inc ), a także inne formulacje zawierające biodegradowalne polimery i liposomy (patrz przegląd w J. Kohn et al., J. Immunol. Methods, vol. 95, str. 31-38, 1986). [0049] Po dekadach intensywnych badań eksperymentalnych bardzo nieliczne zatwierdzone i dopuszczone adiuwanty stosowane do szczepienia ludzi obejmowały formulacje zawierające wodorotlenek glinu. Wytworzenie kompozycji farmaceutycznej lub formulacji terapeutycznej, która zawiera "biwalentna szczepionką przeciwko uzależnieniu od morfiny i heroiny" według niniejszego wynalazku, można przeprowadzić przy użyciu standardowych dla specjalisty technik, razem z dowolnym z przyjętych nośników, środków pomocniczych i / lub farmaceutycznych zaróbek opisanych w staniee techniki, w tym różnych substancji adiuwantowych. Typowa formulacja dawkowania biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny i heroiny z adiuwantem, używanym w protokołach aktywnych szczepień zarówno zwierząt jak i ludzi, polega na przygotowaniu mieszaniny w stosunku 1:2 (objętościowo) biwalentneja szczepionki:wodorotlenku glinu przez zmieszanie 1 ml szczepionki zawieszonej w sterylnej dejonizowanej H 2 O z 2 ml roztworu wyjściowego 45 mg/ml wodorotlenku glinu (Imject-R-Alum Pierce) dodawanymi przez powolne wkraplanie (nie mniej niż 3 minuty). Mieszaninę reagentów inkubuje się w temperaturze pokojowej przy powolnym i ciągłym mieszaniu przez 1-2 godziny. Końcowe stężenie wodorotlenku glinu w reakcji nie powinno przekraczać 1,12-2,25 mg /100 µl pod- 33

czas procesu mieszania z biwalentną szczepionką przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny. Po całkowitym wymieszaniu mieszaniny, formulacja biwalentnej szczepionki anty morfina-heroina/adiuwant - wodorotlenek glinu powininna być wprowadzona do sterylnych plastikowych strzykawek do pozajelitowej drogi podawania (np. podskórnie, domięśniowo i dootrzewnowo) jako korzystnej drogi podawania gospodarzowi formulacji szczepionki, z wyjątkiem drogi dożylnej. [0050] Inne dostępne immunogenne adiuwanty, które mogą być łączone i podawane z biwalentną szczepionką przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny według niniejszego wynalazku obejmują dużą grupę związków,takich jak fosforan glinu, interferony, interleukiny, poliestry kwasu mlekowego, biodegradowalne kopolimery składające się z poliestrów kwasu glikolowego, liposomy, bakteryjne błonowe lipopolisacharydy, bakteryjne muramylopeptydy i RIBI. Formulacje te i/lub kompozycje przyjmują farmaceutyczne postacie wtrzykiwalnych roztworów, zawiesin, proszków i podobnych związków. AKTYWNA IMMUNIZACJA [0051] Korzystną drogą podawania pozajelitowego jest podawanie domięśniowe, za pomocą której powinien być podawany osobnikom niniejszy wynalazek biwalentnej szczepionki anty morfina-heroina zmieszanej z adiuwantem - wodorotlenkiem glinu, chociaż inne drogi pozajelitowe, takie jak. podskórna i dootrzewnowa, mogą być również wykorzystywane w protokołach szczepień. Niniejszy wynalazek biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny lub kompozycja farmaceutyczna, lub formulacja terapeutyczna, zawierająca ten preparat immunogennej szczepionki, powinny być podawane z zastosowaniem terapeutycznie skutecznej dawki i ustalonego protokołu/schematu podawania dawki tylko dla osobników będących w stanie abstynencji i detoksykowanych od uprzednich uzależnieniowych zachowań w stosunku do morfiny i / lub heroiny. Protokół ten powinien zawsze być dostosowany do stopnia zarówno zarówno dolegliwości jak i uzależnienia. osobnika Typowy aktywny schemat immunizacji wykorzystuje domięśniową drogę wszczepienia tej formulacji szczepionkowej w jednostkowej dawce koniugatu haptenowy narkotyk białko nośnikowe do 1-2 mg/kg masy ciała osobnika (tj. samce szczurów o masie 250-350 mg, rasy Wistar lub Sprague - Dawley). To pierwsze zaszczepienie musi być następnie powtórzone, jako ponowne pobudzenie, 3-6 razy przez podawanie w 14-dniowych odstępach, tej samej dawki jednostkowej tej formulacji szczepionki podczas ponownego pobudzania. Aktywną immunizację osobników kontrolnych przeprowadza się tylko adiuwantem (wodorotlenek glinu) lub adiuwantem wraz z białkiem nośnikowym (wodorotlenek glinu + toksoid tężcowy). Surowicę uzyskaną od zaszczepionych osobników należy pobrać po 10-12 dniach po każdym ponownym pobudzeniu stosując standardowe protokoły i procedury opisane wcześniej (E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988) w celu monitorowania humoralnej odpowiedzi odpornościowej przeciwko morfinie i heroinie, w tym przeciwko ich endogennym metabolitom. W celu osiągnięcia tych warunków eksperymentalnych, pobierano krew od różnych zaszczepionych zwierzęt doświadczalnych (100 µl/zwierzę), i uzyskano frakcje surowicy po zebraniu próbek i poddano je procesowi wykrzepiania krwi przez 24 godziny w 4 C, z późniejszym odwirowaniem w 14.000 x g frakcji skrzep/supernatant. Uzyskane frakcje surowicy natychmiast zamrażano w 20 C do czasu użycia. 34

[0052] Immunoenzymatyczne testy wychwytu przeciwciał ELISA zastosowano do identyfikacji i monitorowania humoralnej odpowiedzi odpornościowej przeciwko obu substancjom opiatowym po każdym ponownym pobudzeniu, zgodnie z procedurą aktywnej immunizacji opisaną powyżej. Wyniki te pozwoliły potwierdzić skuteczność naszej nowej szczepionki anty-morfina-heroina do wywołania silnej humoralnej odpowiedzi odpornościowej przeciwko tym związkom opiatowym. Co więcej, wyniki te doprowadziły do określenia liczby ponownych pobudzeń wymaganych do wywołania odpowiedzi humoralnej z maksymalnymi i stabilnymi poziomami surowiczych przeciwciał przeciw tym substancjom opiatowym. Podsumowując, te dane eksperymentalne zastosowano do wybrania i scharakteryzowania hiperimmunizowanych zwierząt, które zostały następnie poddane immunoochronnemu protokołowi przeciwko tym substancjom opiatowym z zastosowaniem szczurzego modelu behawioralnego paradygmatu uzależniającego dożylnego samopodawania opiatów (patrz poniżej figury 6 i 7). [0053] Typowa procedura immunoenzymatycznego testu wychwytu przeciwciał ELISA, stosowana do monitorowania humoralnej odpowiedzi odpornościowej przeciwko morfinie i heroinie w surowicy aktywnie szczepionych osobników naszą terapeutyczną formulacją szczepionki anty-morfina-heroina, polega najpierw na syntezie fazy stałej testu przez zwiększenie adsorpcji 3-4 µg preparatu antygenowego morfino-6- hemisukcynyl-bsa / studzienkę w 96-studzienkowych płytkach (I Inmunolon, Corning). Wychwytywanie przeciwciał anty-morfina/anty-heroina przez frakcję antygenową zaabsorbowaną na fazie stałej, przeprowadza się po 6 godz, inkubacji w temperaturze pokojowej porcji (50 µl / studzienkę) zawierających progresywne, seryjne rozcieńczenia przeciwciał (tj. 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 i 1:1000000) uzyskanych od immunizowanych zwierząt. Następnie studzienki przemywa się intensywnie roztworem zawierającym 1 % BSA / 0,3 % Tween-20/PBS, ph 7,4, następnie inkubuje się 2-3 godziny w temperaturze pokojowej z drugorzędowym szczurzym przeciwciałem anty-igg (H+L) (Vector Laboratories) sprzężonym z peroksydazą chrzanową. Po tym okresie inkubacji studzienki przemywa się intensywnie, aby usunąć nadmiar niezwiązanego drugorzędowego przeciwciała, a następnie wykrywa się immunopozytywne sygnały/studzienkę przy użyciu chromogennego substratu (OPD, Sigma). Studzienki testowe są poddawane spektrometrycznej detekcji wartości absorbancji przy 490 nm frakcji przeciwciała wychwyconego przez antygenową fazę stałą z zastosowaniem systemu mikropłytka ELISA-detektor. Uzyskane spektrometrycznie wartości absorbancji odzwierciedlają ilość przeciwciała wychwyconego przez antygenową fazę stałą. Następnie końcowe wartości miana przeciwciał oblicza się i wyraża jako wartość odwrotną rozcieńczonej frakcji badanych surowic odpornościowych, która daje 50% maksymalnej odpowiedzi absorbancji, przy użyciu komputerowych procedur standaryzacji. [0054] Figura 1 przedstawia reprezentatywny wynik testu wychwytywania przeciwciał ELISA zastosowanego do początkowej identyfikacji skutecznościi naszej nowej biwalentnej szczepionki przeciw uzależnieniu od morfiny-heroiny do wywoływania humoralnej odpowiedzi odpornościowej z wysokimi mianami przeciwciał (tj. wytwarzanie średniej wartość miana 1: 100000) w stosunku do morfiny, krótko po drugim pobudzeniu w grupie 10 immunizowanych zwierząt objętych próbą. Jak pokazano na figurze, stężenie reaktywnych przeciwciał wykrytych przez pomiar absorbancji przy 490 nm w teście zmniejsza się proporcjonalnie do seryjnego rozcieńczenia surowicy odpornościowej. [0055] Figura 2 przedstawia reprezentatywny wynik testu wychwytu przeciwciał ELISA w celu monitorowania w czasie miana przeciwciał surowiczych dla morfiny-heroiny po powtórnym okresowym pobudzeniu zwie- 35

rząt (1-7 powtórnych pobudzeń) preparatem biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfinyheroiny. Po napiętnowaniu szczurów (pierwsze zaszczepienie) nową formulacją terapeutyczną biwalentnej szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny, miana surowiczych przeciwciał przeciw tym substancjom opiatowym monitorowano 10-12 dni po każdym ponownym pobudzeniu (od 4-7). Jak pokazano na figurze,stopniowy wzrost stężenia przeciwciał przeciwko tym substancjom opiatowym otrzymano w okresie do czwartej ponownej immunizacji, gdzie 10 aktywnie szczepionych zwierząt wykazywało średnie wartości miana w zakresie 1:800000-1:1000000. Jednak późniejsze ponowne immunizacje immunogenem morfinaheroina (od 5 do 7) nie były skuteczne w indukowaniu znaczącego zwiększenia miana przeciwciał u zwierząt uważanych za hiperimmunizowane wobec tych opiatów (dane nie pokazane na figurze). Ten ostatni wynik zakłada stosowanie krótkoterminowych protokołów aktywnej immunizacji naszą nową terapeutyczną formulacją szczepionki anty-morfina-heroina, w celu osiągnięcia maksymalnej humoralnej odpowiedzi odpornościowej przeciwko obu substancjom opatowym. [0056] Jednym z głównych celów do osiągnięcia przez każdy nowy model szczepionek terapeutycznych stosowanych w protokołach aktywnej immunizacji, jest ich zdolność do indukowania silnej i stabilnej w czasie humoralnej i/lub komórkowej odpowiedzi odpornościowej z ustaloną długotrwałą pamięcią immunologiczną. W tym kontekście, figura 3 jest wykresem reprezentatywnych danych pokazujących chwilowy spadek humoralnej odpowiedzi odpornościowej przeciwciał przeciwko morfinie-heroinie widoczny po czwartej powtórnej immunizacji u osobników aktywnie szczepionych (n = 10), za pomocą naszej nowej terapeutycznej formulacji szczepionki. Na uwagę zasługuje fakt, że hiperimmunizowane zwierzęta, które nie były ponownie pobudzane, wykazują stopniowy spadek miana przeciwciał w czasie do 120 dni. Początkowe miano przeciwciał uzyskane po ostatniej ponownej immunizacji (średnio między 1:800000-1:1000000) wykazało istotne zmniejszenie o około 40-50 razy, osiągając wartość średnią miana minimalnego 1:20000 na koniec tego okresu. Dane te pokazują i wspierają hipotezę, że aktywna immunizacja naszą nową terapeutyczną formulacją szczepionki anty morfina-heroina jest w stanie indukować klasyczną humoralną odpowiedź odpornościową osiągającą stabilne miana przeciwciał, co najmniej po czwartej ponownej immunizacji. Dowód ten jest silnie wspierany danymi eksperymentalnymi uzyskanymi z wychwytu przeciwciał ELISA, jak to przedstawiono na figurze 4, która pokazuje, że długotrwała pamięć immunologiczna przeciw tych dwóm substancjom opiatowym ustalona zostaje po czwartym ponownym pobudzeniu. Figura ta przedstawia średnie wartości mian przeciwciał w surowicy dziesięciu eksperymentalnych osobników eksponowanych na kolejne ponowne pobudzenia biwalentną szczepionką po zakończeniu długotrwałego, sześciomiesięcznego okresu niepobudzania, licząc od ostatniej ponownej immunizacji (4-tej). Jak pokazano na figurze, aktywna ponowna immunizacja niniejszym wynalazkiem terapeutycznej formulacji szczepionki anty morfina-heroina powodowała szybkie i stabilne odzyskanie wcześniej istniejących poziomów maksymalnych mian przeciwciał przeciw tym substancjom opiatowym (tj. zazwyczaj w ciągu pierwszych 5-10 dni po ponownym pobudzeniu) u nieimmunizowanych ponownie hiperimmunizowanych zwierząt. Warto zwrócić uwagę na podobny w czasie ubytek miana przeciwciał pokazanych po czwartym ponownym pobudzeniu (patrz figura 3) u nieszczepionych hiperimmunizowanych zwierząt (tj. po sprowokowaniu zwierząt ostatnim ponownym pobudzeniem szczepionką, maksymalne poziomy miana osiągnięto 15-20 dni po ponownym pobudzeniu, a następnie nastąpił powolny i stopniowy liniowy spadek w ciągu kolejnych 30 dni, osiągając najniższy poziom wykrytego miana przeciwciał 36

do 120 dnia, dane nie pokazane na figurze). [0057] Po ocenie skutecznościi naszej nowej terapeutycznej formulacji szczepionki przeciwciała antymorfina-heroina i walidacji w protokołach aktywnych szczepień, przez pokazanie jej zdolności do wytwarzania silnej humoralnej odpowiedzi odpornościowejj charakteryzującej się wysokim i trwałym mianem surowiczych przeciwciał przeciw tym substancjom opiatowym, dodatkowe immunoenzymatyczne testy kom petycyjne ELISA zostały zaprojektowane i opracowane, aby ocenić i określić specyficzność przeciwciał antymorfina-heroina. [0058] Ten kompetycyjny test ELISA, stosowany do oceny swoistości przeciwciał, opiera się na tym samym eksperymentalnym projekcie co wspomniany wyżej niekompetycyjny test ELISA. Różnica w stosunku do kompetycyjnych testów ELISA polega na etapie preadsorpcji specyficznej surowicy odpornościowej od zwierząt hiperimmunizowanych z zastosowaniem różnych stężeń (tj. w zakresie nm-µm) potencjalnych konkurencyjnych antygenów potencjalnie rozpoznanych krzyżowo przez przeciwciała anty-morfina. Te konkurencyjne antygeny, obejmowałye morfinę jako substancję kontroli pozytywnej, oprócz trzech głównych endogennych metabolitów morfiny i heroiny (np. 6-monoacetylomorfiny, morfino-3-glukuronidu i morfino-6- glukuronidu), aby pokazać właściwości wzmacniające opiatów, a heroinę, jako syntetyczny analog strukturalny morfiny, przedstawiono, aby wykazać, że właściwości wzmacniające opiatów przy równoważnych dawkach są co najmniej o rząd wielkości większe niż naturalny ortolog opiatowy, morfina. Dwa inne reprezentatywne endogenne peptydy opioidowe produkowane w OUN ssaków, takie jak leucyna-enkefalina i β- endorfina, zostały również uwzględnione w tym teście jako konkurencyjne antygeny. Ponadtoj, test ten obejmował również farmakologicznie aktywne konkurencyjne antagonistyczne związki dla receptorów opioidowych, takie jak naltrekson, powszechnie stosowana substancja do utrzymywania abstynencji od uzależnienia od heroiny u ludzi. [0059] Ponieważ ten test opiera się na wykrywaniu pozytywnych sygnałów pochodzących od absorbancji emitowanej ze studzienek reakcyjnych po ekspozycji na system mikropłytka ELISA-detektor przy 490 nm, dla studzienek wykazujących absorbancję istotnych sygnałów przy tej długości fali (490 nm) sugerowano brak wychwytu swoistych przeciwciał przez antygen zaadsorbowany na fazie stałej (którym w naszym przypadku był morfino-6-hemisukcynyl-bsa). Jeśli nastapiłby w tych ostatnich warunkach eksperymentalnych, wskazywałby na to, że surowicze przeciwciała wytworzone przez aktywne szczepienie naszą nową formulacjąszczepionki anty-morfina-heroina wykazują potencjalne krzyżowe rozpoznawanie dla niektórych konkurencyjnych antygenów stosowanych w teście. [0060] Reprezentatywne dane przedstawione na figurze 5 ilustrują kompetycyjny test immunoenzymatyczny ELISA, który pokazuje równoważną swoistość przeciwciał surowiczych do krzyżowego rozpoznawania morfiny i heroiny (zauważ, że obie krzywe kompetycji pokazują podobne konkurencyjne dawki morfiny i heroiny w zakresie do 0,6-0,8 µm przy wartości referencyjnej IC 50 ). Dodatkowo, testy te pokazują również zdolność takich surowiczych przeciwciał anty-morfina-heroina do krzyżowego rozpoznawania różnych metabolitów biotransformacyjnych tych substancji opiatowych (tj. 6-monoacetylo-morfiny, morfino-3-glukuronidu i morfino-6-glukuronidu ). Ponadto zaobserwowano w tych samych testach, brak krzyżowego rozpoznawania innych substancji, takich jak endogenne peptydy opiatowe i antagonista receptora opioidowego - naltrekson. Łącznie, te wyniki, sprawiają, że możliwe jest zaproponowanie potencjalnego braku immunologicznych za- 37

kłóceń tego immunogenu w protokołach aktywnych szczepień, i może on być stosowany u ludzi leczonych klasycznymi anty-uzależnieniowymi terapiami wykorzystującymi strukturalnie odmienne od morfiny leki opiatowe, takie jak naltrekson, nalokson, metadon i buprenorfina. Ponadto, można założyć, że nasza nowa formulacja terapeutycznaszczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny nie jest w stanie wygenerować odpowiedzi autoimmunologicznej, ponieważ przeciwciała wytworzone przez tę szczepionkę nie są w stanie krzyżowo rozpoznawać endogennych peptydów opioidowych ( tj. leucyny-enkefaliny i β-endorfiny), które poza tym, że są syntetyzowane w mózgu u zwierząt szczepionych hiperimmunologicznie, w tym ludzi, uczestniczą w regulacji licznych układów aktywności fizjologicznych i procesach szerokiego zakresu funkcji mózgu w OUN u ssaków. OCENA I WALIDACJA SKUTECZNOŚCI NINIEJSZEGO WYNALAZKU TERAPEUTYCZNEJ FORMU- LACJI BIWALENTNEJ SZCZEPIONKI PRZECIWKO UZALEŻNIENIU OD MORFINY-HEROINY [0061] Po wykazaniu przez walidację skuteczności niniejszej terapeutycznej formulacjiu biwalentnej szczepionki anty-morfina- heroina do nadawania hiperimmunogenności przeciwmorfinie i heroinie, z długoterminową wzmocnioną pamięcią odpowiedzi odpornościowejj, przez wytwarzanie wysokiego i trwałego miana swoistych reagujących przeciwciał surowiczych przeciwko tym narkotykom opiatowym i ich metabolitom endogennym u immunizowanych osobników, postanowiliśmy zbadać immunoochronne efekty niniejszej terapeutycznej formulacji szczepionki przeciwko ponownemu przyjęciu uzależnieniowego zachowania chęci zażycia u hiperimmunizowanych zwierząt detoksykowanych i w stanie abstynencji od uzależnienia od tych opiatów. W tym kontekście badane hiperimmunizowane wobec morfiny / heroiny zwierzęta eksponowano na instrumentalne testy behawioralne za pomocą paradygmatu dożylnego samopodawania narkotyku zarówno morfiny jak i heroiny. Te farmakologiczne paradygmaty stosowane w szczurzym modelu zwierzęcym były oparte na pokrewnych farmakologicznych paradygmatach wcześniej opisanych przez kilka grup badawczych (J. M. Van Ree et al., J. Pharm. Exp. Ther., 204 (3): 547-557, 1978; J.M. Van Ree and D. de Wied, Life Sci. 21:315-320, 1977; T.J. Martin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 272:1135-1140, 1995; P. Hyytiä et al., Psychopharmacology, 125:248-254, 1996; T. J. Martin et al., Brain Res. 755 :313-318, 1997 ; C.W. Hutto, Jr. and W. F. Crowder, Pharmacol. Biochem. Behav. 58(1):133-140, 1997; R. Ranaldi and E. Munn, Neuroreport, 9:2463-2466, 1998; S. Martin et al., Brain Res. 821:350-355, 1999; I.M. Maisonneuve and S. D. Glick, Eur. J. Pharmacol, 383:15-21. 1999; S.D. Comer et al., Psychopharmacology, 143327-338, 1999; S. Semenova et al., Eur. J. Pharmacol. 378:1-8, 1999; M.R.A. Carrera et al., Psychopharmacology, 144:111-120, 1999 ; Z-X. Xi and E. A. Stein, J. Pharm. Exp. Ther. 290 :1369-1374, 1999 and L. J. Sim-Selley et al., J. Neurosci. 20(12):4555-4562, 2000). [0062] Farmakologiczne modele paradygmatów dożylnego samopodawania zarówno morfiny jak i heroiny u gryzoni były szeroko stosowane w celu zbadania neurobiologicznych mechanizmów, dzięki którym te opiaty wytwarzały narkotyczne właściwości wzmacniające. Dodatkowo, te modele były również stosowane do oceny anty-uzależnieniowych działań związków terapeutycznych, takich jak metadon, nalokson i naltrekson. Ponadto, te farmakologiczne paradygmaty są bardzo przydatne do oceny motywacyjnych i narkotycznych odpowiedzi wzmacniających, niezależnie od bezpośrednich efektów farmakologicznych wytwarzanych przez 38

te narkotyki opiatowe w układzie nerwowym (tj. aktywacja psychomotoryczna), gdy stosowane są odpowiednie protokoły podczas farmakologicznego samopodawania tych substancji. Zatem, w celu oceny i walidacji efektów immunoochronnych wobec uzależnienia od morfiny-heroiny nadawanych przez niniejszy wynalazek terapeutycznej formulacji biwalentnej szczepionki anty morfina- heroina, w naszym laboratorium zaprojektowano, opracowano i zwalidowano paradygmat dożylnego samopodawania narkotyków dla tych dwóch substancji opiatowych w szczurzym modelu zwierzęcym. a).- Opracowanie, wdrożenie i walidacja paradygmatu dożylnego samopodawania morfiny i heroiny w szczurzym modelu zwierzęcym [0063] Farmakologiczny model paradygmatu dożylnego samopodawania morfiny/heroiny u szczura był standaryzowany w kilku protokołach wcześniej opisanych przez różne grupy (J. M. Van Ree et al, J. Pharm Exp. Ther., 204 (3):547-557, 1978; J. M. Van Ree and D. of Wied, Life Sci. 21:315-320, 1977; T. J. Martin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 272:1135-1140, 1995; P. Hyytiä et al., Psychopharmacology, 125:248-254, 1996; T. J. Martin et al., Brain Res. 755:313-318, 1997 ; C. W. Hutto, Jr. and W. F. Crowder, Pharmacol. Biochem. Behav. 58(1):133-140, 1997; R. Ranaldi and E. Munn, Neuroreport, 9:2463-2466, 1998; S. Martin et al., Brain Res. 821:350-355, 1999; I. M. Maisonneuve and S. D. Glick, Eur. J. Pharmacol, 383:15-21. 1999; S.D. Comer et al., Psychopharmacology, 143327-338, 1999; S. Semenova et al., Eur. J. Pharmacol. 378:1-8, 1999; M. R. A. Carrera et al, Psychopharmacology, 144:111-120, 1999; Z-X. Xi and E. A. Stein, J. Pharm. Exp. Ther. 290:1369-1374, 1999 and L. J. Sim-Selley et al., J. Neurosci. 20(12):4555-4562, 2000). Zasadniczo, ten farmakologiczny model polega na wykorzystaniu chirurgicznie wszczepionych zwierzętom teflonowych sterylnych cewników wprowadzanych do prawej lub lewej żyły szyjnej zewnętrznej w celu zastosowania opiatowego paradygmatu dożylnego samopodawania, wykorzystując morfinę i heroinę jako narkotyki- wzmacniacze podczas 4h /dziennych sesji wewnątrz klatek Skinnera zapewniających instrumentalne warunkowanie i kontrolowanych przez obserwatora za pomocą komputerowych sygnałów. W tym kontekście, infuzja dożylna całkowitej dawki jednostkowej" każdej z tych dwóch substancji opiatowych jest ustalona przez określoną liczbę instrumentalnych odpowiedzi naciskania dźwigni wykonanych przez zwierzę na cofającej się dźwigni (umieszczonej na przedniej ściance skrzynki Skinnera) w określonych odstępach czasu. Na przykład, infuzję dawki jednostkowej morfiny (tj. 1900 μg/0,2 ml / kg masy ciała) i heroiny (60 μg/0,2 ml/kg) przeprowadza się, gdy zwierzę wykonuje określoną liczbę ruchów dżwignią (tj. 1, 3, 5,10) w określonych odstępach czasu (tj. 20, 40, 80 sekund), czasu, w którym cofająca się dźwignia jest nieaktywna. Zatem, w tych farmakologicznych warunkach można ocenić odpowiedzi behawioralne chęci zażycia narkotyku, szacując w 4 godzinnych / dziennych sesjach całkowitą liczbę infuzji opiatów dokonanych przez zwierzę. W analizach są również zawarte pomiary odpowiedzi behawioralnej chęci poszukiwania narkotyków przez oszacowanie całkowitej liczby cofnięć dźwigni występujących w odstępach czasowych, gdy cofająca się dźwignia jest nieaktywna. W tych warunkach doświadczalnych, wyszkolone zwierzęta, ustanowiły ilość narkotyku opiatowego wymaganą do samopodawania. Jak dotąd, paradygmat farmakologiczny umożliwia przeprowadzenie ilościowych i powtarzalnych procedur stosowanych do oceny skumulowanych dawek dożylnie samopodawanego narkotyku/zwierzę/sesja/dzień, w tym skumulowanych samopodawanych dawek narko- 39

tyk/zwierzę w całym schemacie trenowania (tj. zgromadzone dane ponad 15, 30, 60 dni). Zdolności morfiny i heroiny do wywołania instrumentalnej odpowiedzi behawioralnej ( tj. manipulacji cofającą się dźwignią w celu zdobycia i/lub poszukiwania narkotyków) są zdefiniowane jako właściwości wzmacniające każdego narkotyku do rozróżnienia bodźców związanych z narkotykiem. W związku z tym, hiperimmunogenne zwierzęta zaszczepione biwalentną szczepionką, według niniejszego wynalazku, z wysoką humoralną odpowiedzią odpornościową o wysokim i trwałym mianie surowiczych przeciwciał anty morfina-heroina, powinny tłumić lub neutralizować narkotyczne właściwości wzmacniające wywołane przez te substancje opiatowe w mózgu po ekspozycji na uzależnieniowe zachowanie dożylnego samopodawania morfiny lub heroiny. Zwierzęta te powinny wykazać znaczący spadek odpowiedzi behawioralnej narkotycznej chęci zażywania opiatów i poszukiwania narkotyków z powodu braku wzmocnienia bodźców związanych z narkotykami. [0064] Podsumowując, ten model farmakologiczny oparty na paradygmacie dożylnego samopodawania opiatów, umożliwił nam uzyskanie i zbudowanie określonych poziomów w zachowaniu instrumentalnej chęci zażywania narkotyku u zwierząt, które łączą uzależnieniową odpowiedź zarówno dla morfiny jak i heroiny. Farmakologiczny parametr dotyczący behawioralnej odpowiedzi w postaci chęci przyjmowania narkotyków, zarówno morfiny jak i heroiny, uzyskano po porównaniu samowstrzykiwania tych narkotyków u hiperimmunizowanych zwierząt immunizowanych terapeutyczną formulacją biwalentnej szczepionki anty-morfina-heroina według niniejszego wynalazku i w grupach kontrolnychj (nieimmunizowanych lub immunizowanychj tylko adiuwantem i adiuwantem z białkiem nośnikowym, patrz reprezentatywne wyniki na figurze 6 i 7). 1. Funkcjonalne opracowanie i wdrażanie instrumentalnych klatek Skinnera [0065] Instalacja i działanie ośmiu instrumentalnych klatek Skinnera (aluminium i przezroczysty akryl) zaprojektowanych do samopodawania dożylnego płynów i narkotyków w szczurzym modelu zwierzęcym zostały opracowane według standardów operacyjnych zalecanych przez producenta (Operant Behavior Conditioning Systems for lab animals, TSE Systems, Hamburg, Niemcy). 2.- Opracowanie paradygmatów kondycjonujących szkoleniowo-treningowych naciskania dźwigni i pożywienie jako nagroda [0066] Samce szczurów Wistar (260-320 g) zostały przeszkolone do umiejscawiania i naciskania cofającej się dźwigni w instrumentalnych klatkach Skinnera, przy czym każde naciśnięcie dźwigni przez zwierzęta nagrodzano maksymalnie 200 granulkami karmy (45 mg) (Noyes Traditional Food Precision Pellets; Research Diets, Inc., Lancaster, NH) przez 5-7 dni, w 4-godzinnych sesjach treningowych. W tych warunkach eksperymentalnych każdorazowe naciśnięcie cofającej się dźwigni przez zwierzęta było warunkiem otrzymania pożywienia - nagrody (bodziec wzmacniający [ustalony protokół wzmocnienia1(fr1)], po ekspozycji na wskazówkę - bodziec świetlny (bodziec warunkowy), kontrolowany on-line przez oprogramowanie (TSE, OBS System ) podczas codziennych 4-godzinnych sesji przez okres 5-7 dni. Po tym okresie treningowym, czas trwania sesji skrócono do 30 minut, zwiększając przerwy od 5 (TO-5) do 20 sekund (TO- 20), czasu, w którym cofające się dźwignie zostały unieruchomione, podczas następnych 3-5 dni. Zwierzęta były szkolo- 40

ne, aby zakończyć ich odpowiedzi w postaci naciskania dźwigni po otrzymaniu tylko 50 granulek według ustalonego harmonogramu wzmocnienia ( FR1, T0-20 sek ) w codziennych 30-minutowych sesjach. Zwierzęta, które odniosły sukces w tym szkoleniu, wracały do swoich indywidualnych klatek, w warunkach ograniczonej diety (16-20gr granulek karmy /dzień), a następnie były poddane na chirurgicznej implantacji dożylnych cewników teflonowych do żyły szyjnej zewnętrznej, aby rozpocząć eksperymentalne procedury immunoochronne przeciwko uzależnieniu od morfiny / heroiny, gdy są one eksponowane na paradygmaty dożylnego samopodawania opiatów. 3. Chirurgiczne wszczepienie sterylnych cewników do żył szyjnych zewnętrznych [0067] Zwierzęta doświadczalne przeszkolone do naciskania dźwigni i nagrody-pożywieniaia, przez wykorzystanie metody warunkowania instrumentalnego opisanej powyżej, poddano znieczuleniu ogólnemu w warunkach aseptycznych i chirurgicznemu wszczepieniu teflonowych sterylnych cewników w prawą lub w lewą zewnętrzną żyłę szyjną. Cały zabieg chirurgiczny przeprowadzono zgodnie ze standardowymi protokołami chirurgicznymi opisanymi przez K.M. Kantak et al. (Psychopharmacology, 148:251-262, 2000). Po zabiegu zwierzęta wróciły do swoich mieszkalnych klatek i sprawność funkcjonalną wszczepionych cewników sprawdzano codziennie przez wlewanie roztworu soli fizjologicznej i antybiotyków [5% Enrofloxacyny (0,50 mg / kg); Gentamicyny-Super 5mg/kg). Po siedmiu dniach powrotu do zdrowia po operacji zwierzęta poddano farmakologicznym paradygmatom dożylnego samopodawania zarówno morfiny jak i heroiny. 4. Opracowanie i ustalenie na określonym poziomie odpowiedzi przez dożylne samopodawanie morfiny i heroiny [0068] Funkcjonalność wszczepionych cewników u zwierząt, które wyzdrowiały po zabiegu chirurgicznym została zweryfikowana przed ekspozycją zwierząt na sesje 4 godzinne/dzień naszego paradygmatu dożylnego samopodawania morfiny i heroiny. Początkowo oddzielne grupy zwierząt były eksponowane na zależne samopodawanie stałej dawki morfiny (1900 μg/kg/0,2 ml soli fizjologicznej) w czasie 10 sekund iniekcji) lub heroiny (60 μg/ kg /0,2 ml soli fizjologicznej/10 sekund iniekcji), według ustalonego harmonogramu wzmocnienia (FR1) TO-20 sekund, w trakcie 4-godzinnych dziennych sesji przez 5-7 kolejnych dni. Różnica między wielkościami wzmacniających dawek jednostkowych morfiny i heroiny została oparta na danych uprzednio opisanych w literaturze (J. M. Van Ree et al, J. Phar. Exp. Ther. 204(3):547-557, 1977 and C. W. Hutto, Hr. and W. F. Crowder, Phar. Biochem. Behav. 58(1):133-140, 1997), które wykazały, że stosunek dawek morfina : heroina, który wynosi 32 : 1, daje równy wybór samowstrzykiwania, tych substancji opiatowych, gdy są samopodawane przez szczura w tych warunkach eksperymentalnych. Ten okres szkolenia prowadzi zwierzęta do nabycia stabilnych na określonym poziomie reakcji odpowiedzi na zależne samopodawanie tych opiatów, w dodatkowym okresie treningowym przez 7-10 dni. W tych warunkach protokołu, wyszkolone zwierzęta wytwarzały średnio odpowiedzi przez infuzje na poziomie z 25 ± 3 i 20 ± 5 podczas samopodawania ustalonych dawek jednostkowych odpowiednio zarówno morfiny jak i heroiny. Odpowiedzi przez samoinfuzję tych dwóch narkotyków na określonym poziomie uznano za ustalone i utrwalone,gdy war- 41

tości współczynnika zmienności zmieniały się nie więcej niż o 10 % dla każdego narkotyku podczas sesji samoinfuzji przez co najmniej pięć kolejnych dni doświadczalnych. Po osiągnięciu początkowych odpowiedzi przez samoinfuzję zarówno morfiny jak i heroiny na określonym poziomie, przeprowadzono początkową fazę wygaszania, zastępując substancje opiatowe roztworem nośnika (tj. roztwór nośnika = sól fizjologiczna 0,9 % NaCl w sterylnej dejonizowanej H 2 O ) podczas następnych 3-5 dni, tuż po ustaleniu na określonym poziomie odpowiedzi przez samoinfuzję obu opiatów. Związane z wygaszaniem reakcje na samoinfuzję zarówno morfiny jak i heroiny osiągnięte u chirurgicznie zaimplantowanych zwierząt określono po osiągnięciu średniej liczby reakcji wygaszenia / sesja / dzień wynoszącej 3 ± 2 na samopodawany roztwór nośnika, w grupach zwierząt wyszkolonych do samopodawania morfiny lub heroiny, które utrawalały początkową fazę odpowiedzi na określonym poziomie, jak wspomniano powyżej. Aby utrwalić reakcję samopodawania opiatów zarówno morfiny jak i heroiny przeprowadzono dwa kolejne ponowne cykle nabywanie-wygaszanie samopodawania opiatów. W tym eksperymentalnym kontekście, piętnaście dni po uzyskaniu średnich odpowiedzi na ustalonym poziomie w fazie wygaszania na paradygmat samopodawania opiatów, oceniliśmy antagonistyczne działanie surowiczych przeciwciał anty-morfina-heroina na ponowne nabycie reakcji zachowania uzależnieniowego samoinfuzji obu substancji opiatowych u hiperimmunizowanych zwierząt (wytrenowanych do samopodawania tych substancji opiatowych) po aktywnym immunizowaniu terapeutyczną biwalentną formulacją szczepionki przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny, z zastosowaniem protokołu szczepienia/ immunizacji ujawnionego w niniejszym wynalazku. 5. Charakterystyka efektu immunoochronnego przeciwko uzależnieniu od morfiny- heroiny wywołanego aktywną immunizacją szczepionką anty-morfina-heroina według niniejszego wynalazku [0069] Różne grupy zwierząt wytrenowanych do samopodawania morfiny i heroiny, wykorzystanych do ustalenia określonych poziomów samoinfuzji tych opiatów, aktywnie zaszczepiono albo terapeutyczną formulacją biwalentnej szczepionki morfina-heroina według niniejszego wynalazku albo kontrolnymi związkami ( tj. wodorotlenekiem glinu użytym jako ko-adiuwant i ten ko-adiuwant wraz z toksoidem tężcowym jako białkiem nośnikowym), postępując według tego samego protokołu immunizacji ujawnionego w niniejszym wynalazku. Gdy humoralna odpowiedź odpornościowa wobec tych dwóch narkotyków ( patrz figury 1, 2, 3 i 4) została ustalona u hiperimmunizowanych zaszczepionych zwierząt, zostały one ponownie eksponowane na paradygmat dożylnego samopodawania zarówno morfiny jak i heroiny, aby ocenić odpowiedź immunochronną przeciw tym narkotykom opiatowym za pomocą pomiaru liczby reakcji pełnych samoinfuzji (zachowanie samopobierania narkotyku) w 15-20 kolejnych 4- godzinnych sesjach. Te same badania przeprowadzono w grupie zwierząt kontrolnych, które otrzymywały albo sam adiuwant lub adiuwant wraz z białkiem nośnikowym. [0070] Otrzymane dane przedstawiono jako średnią z zebranej liczby reakcji pełnych samoinfuzji / dzień / w zaszczepionej grupie eksperymentalnej przez 15-20 codziennych sesji i badano w celu oceny efektu immunoochronnego. Analizę statystyczną danych przeprowadzono za pomocą analizy wariancji (ANOVA), a następnie zastosowano test Newmana-Keulsa dla analizy porównawczej post hoc. [0071] W tym kontekście eksperymentalnym, włączono grupy badane, hiperimmunizowanych przeciw mor- 42

finie-heroinie zwierząt (CP-MORFINA, n = 8) oraz grupy kontrolne immunizowane albo adiuwantem wodorotlenkiem glinu (ALUM n = 8) albo białkiem nośnikowym i adiuwantem (CP + ALUM, n = 8). Wszystkie z nich otrzymały takie same dawki jednostkowe heroiny lub morfiny w czasie paradygmatu dożylnego samo- podawania, jak ujawniono wcześniej w niniejszym wynalazku. Wyniki pokazujące średnie ustalone odpowiedzi w postaci liczby samo infuzji osiągniętych dla samopodanych substancji opiatowych, jak również samo podanego kontrolnego nośnika (tj. soli fizjologicznej) przez kolejne 15-20, 4-godzinne, codzienne sesje, przedstawione zostały na figurach 6 i 7. [0072] Figura 6 przedstawia efekt immunoochronny wywołany przez aktywne szczepienie terapeutyczną formulacją biwalentnej szczepionki anty morfina-heroina według niniejszego wynalazku przeciwko zachowaniu dożylnego samopodawania w szczurzym modelu zwierzęcym. Grupę szczurów immunizowanych szczepionką według wynalazku i grupy kontrolne immunizowane adiuwantem lub adiuwantem wraz z białkiem nośnikowym eksponowano na paradygmat samopodawania morfiny. Zwierzęta kontrolne, które otrzymały tylko wodorotlenek glinu (ALUM) jako immunogen, nie wykazały istotnych zmian w odniesieniu do średnich odpowiedzi przez samoinfuzję morfiny / sesja (17 ± 4, SEM) w porównaniu do średnich reakcji sprzed immunizacji u zwierząt kontrolnych (18 ± 5, SEM). Przeciwnie, zwierzęta zaszczepione immunogennym preparatem morfiny (CP- morfina) wykazały istotne zmniejszenie średniej liczby samoinfuzji heroiny/sesja (4 ± 3, SEM, p <0,005 ) w porównaniu ze zwierzętami immunizowanymi adiuwantem ( ALUM ) lub adiuwantem z białkiem nośnikowym ( CP sam + ALUM). Warto zwrócić uwagę na podobny wzór średniej reakcji samoinfuzji otrzymanej dla zwierząt immunizowanych roztworem soli (kontrolny nośnik) i tymi trzema różnymi preparatami szczepionkowymi (3 ± 2 z ALUM, 3 ± 2 z ALUM + CP, i 3 ± 2 z biwalentną szczepionką anty morfina-heroina według niniejszego wynalazku). [0073] Figura 7 przedstawia immunoloochronny efekt aktywnego szczepienia terapeutyczną formulacją biwalentnej szczepionki anty morfina-heroina według niniejszego wynalazku przeciwko zachowaniu dożylnego samopodawania heroiny w zwierzęcym modelu gryzonia. Grupę szczurów immunizowanych niniejszą szczepionką oraz grupy kontrolne immunizowane adiuwantem i/lub białkiem nośnikowym, eksponowano na farmakologiczne paradygmaty samopodawania heroiny. Zwierzęta kontrolne, które otrzymały tylko wodorotlenek glinu ( ALUM ) jako immunogen, nie wykazały istotnych różnic w odniesieniu do średnich reakcji samoinfuzji heroiny / sesja (24 ± 4, SEM) w porównaniu do średniej sprzed immunizacji (21 ± 3, S.E.M.). Odwrotnie, zwierzęta szczepione immunogennym preparatem morfiny (CP-morfina ) wykazywały znaczące zmniejszenie średniej liczby samoinfuzji heroiny / sesja ( 6 ± 2, SEM, p <0,005 ) w porównaniu ze zwierzętami immunizowanymi adiuwantem ( ALUM ) lub adiuwantem wraz z białkiem nośnikowym (samo CP - ALUM +). Ponadto, średnie liczby samoinfuzji soli fizjologicznej (nośnik kontrolny) u zwierząt immunizowanych tymi trzema preparatami szczepionki (3 ± 2 w grupie zwierząt immunizowanych ALUM, 2 ± 3 w grupie zwierząt immunizowanych ALUM + CP; i 3 ± 1 w grupie zwierząt immunizowanych biwalentną szczepionką anty-morfinia-heroina według niniejszego wynalazku) były bardzo podobne. [0074] Na koniec, zastosowanie tego rodzaju strategii terapeutycznych jest obecnie oceniane pod kątem ich przyszłego zastosowania u ludzi, którzy wykazują poważne problemy uzależnieniowe zarówno od morfiny jak i od heroiny. 43

Zastrzeżenia 1. Sposób wytwarzania biwalentnej immunogennej kompozycji przeciwko uzależnieniu od morfiny, heroiny, obejmujący reakcję między białkiem nośnikowym ("CP") i produktem morfinowym, w którym białkiem nośnikowym jest toksoid tężcowy, a produktem morfinowym jest EDC-(morfino-6-hemibursztynian), w którym morfinowy produkt w kompozycji jest połączony z pośrednim koniugatem ("CP-TFCS"), przy czym kompozycję otrzymuje się według następujących etapów: a) przereagowanie 100 mg (0,5 mm) toksoidu tężcowego rozpuszczonego w 4 ml roztworu buforu fosforanowego / 0,15 mm NaCl, ph 7,2 z 50 µl 40 mg/ml roztworu podstawowego estru kwasu N-(εtrifluoracetylkaproiloksy)-sukcynimidu ("TFCS" ) zawierającego 10-20% DMSO i 90-80% dejonizowanej H 2 O (obj.: obj.), w celu rozpoczęcia wytwarzania pośredniego koniugatu; b) uzyskanie końcowego stężenia toksoidu tężcowego 6,7 µm i 0,5-1% DMSO; c) uzyskanie końcowego rozcieńczenia początkowego stężenia DMSO 1:10-20 (objętościowo) między toksoidem tężcowym i TFCS; d) inkubacja zawartości z etapu c) przez około 60-90 minut w temperaturze pokojowej, podczas której zachodzi synteza CP-TFCS, i gdzie TFCS wciąż zachowuje reaktywną chronioną grupę aminową zabezpieczoną przez ochronną chemiczną grupę trifluoroacetylową; e) inkubacja CP-TFCS przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej i doprowadzenie ph do 8-8,5 stężonym 10 N roztworemr NaOH w celu zwiększenia podatności ochronnej grupy trifluoroacetylowej w TFCS na hydrolizę, aby w CP-TFCS wytworzyły się wolne reaktywne grupy aminowe; f) oczyszczanie CP-TFCS przy użyciu standardowych procedur dializacyjnych; g) reakcja produktu mofinowego, EDC-(morfino-6-hemibursztynian), z CP-TFCS, przy czym reakcję prowadzi się w stosunku stechiometrycznym mol:mol, 100 µmol EDC-(M-H-6) na każde 0,07 mmola aktywnych wolnych grup aminowych w CP-TFCS; h) inkubowanie reagentów otrzymanych w etapie g) przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej, przy powolnym i stałym mieszaniu w celu wytworzenia kompozycji immunogennej; i) oczyszczanie kompozycji immunogennej przez zastosowanie standardowych procedur dializacyjnych; j) sterylizacja kompozycji immunogennej procedurami filtracji przy nadciśnienieniu z zastosowaniem filtrów membranowych o wielkości porów 0,45 µm; k) liofilizacja, 1 ml porcji kompozycji immunogennej w sterylnych, szklanych fiolkach zamkniętych próżniowo i przechowywanie ich w temperaturze 4 C dla konserwacji. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym etap f) oczyszczania CP-TFCS obejmuje dializę CP-TFCS z użyciem membrany dializacyjnej z odcięciem ciężaru cząsteczkowego 10 kda przez 24 godziny w 4 o C wobec trzech 6-litrowych zmian 0,1 M roztworu buforu fosforanowego, ph 7,2, co 8 godzin. 3. Sposób według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym etap oczyszczania i) kompozycji immunogennej obejmuje dializę kompozycji immunogennej z użyciem membrany dializacyjnej z odcięciem ciężaru cząsteczkowego 10 kda przez 24 godziny w 4 o C wobec trzech 6-litrowych zmian 0,1 M roztworu buforu fosforanowego, ph 7,2, co 8 godzin 44

4. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 3, w którym CP-TFCS ma następujący wzór strukturalny: 5. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 4, w którym toksoid tężcowy w CP-TFCS jest kowalencyjnie związany przez swoje grupy epsilon aminowe w łańcuchu bocznym eksponowanych reszt lizynowych. 6. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 5, w którym etap g) przebiega przez kowalencyjne wiązanie amidowe, utworzone przez reakcję eksponowanych grup imidowych na wolnym końcu EDC-(M-6-H) i niechronionych eksponowanych wolnych-grup aminowych w sprzężonym TFCS z CK-TFCS. 7. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 6, w którym immunogenna kompozycja ma strukturę, jak przedstawiona następującym wzorem: 8. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 7, obejmujący ponadto etap formułowania kompozycji immunogennej z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnymi adiuwantami i / lub jednym lub więcej środkami farmakologicznymi. 9. Sposób według zastrzeżenia 8, w którym farmaceutycznie dopuszczalnym adiuwantem jest wodorotlenek glinu. 10. Sposób według zastrzeżenia 8 albo 9, w którym środkiem farmakologicznym jest naltrekson. 11. Biwalentna kompozycja immunogenna przeciwko uzależnieniu od morfiny-heroiny majaca jeden z następujących wzorów strukturalnych: 45

Or w którym białkiem nośnikowym (CP) jest toksoid tężcowy. 12. Kompozycja immunogenna według zastrzeżenia 11, zawierająca ponadto jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych adiuwantów lub środków farmakologicznych. 13. Kompozycja immunogenna według zastrzeżenia 12, w której farmaceutycznie dopuszczalnym adiuwantem jest wodorotlenek glinu, a środkiem farmakologicznym jest maltrekson. 46

47

48

MIANO SUROWIC ODPORNOŚCIOWYCH (rozcieńczenie 1 X 1000) EP 1767221 B1 49

50

51

określony poziom 52

określony poziom 53

ODNOŚNIKI CYTOWANE W OPISIE Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Cytowana w opisie literatura niepatentowa 54

55