FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α Klon EP1 Gotowy do uŝycia (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS084 Przeznaczenie Synonimy antygenu Podsumowanie i wyjaśnienie Odczynnik dostarczony Do badań diagnostycznych in vitro. FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, klon EP1, Gotowy do uŝycia (Dako Autostainer/ Autostainer Plus) to przeciwciała przeznaczone do stosowania w immunohistochemii razem z aparatami Dako Autostainer/Autostainer Plus do półilościowego wykrywania ludzkiego receptora estrogenowego w utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawkach tkankowych ludzkiego raka sutka. Przeciwciała znakują komórki z ekspresją receptora estrogenowego α i są przydatne przy określaniu obecności receptora estrogenowego w przypadkach ludzkiego raka sutka. Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez wykwalifikowanego patologa z uwzględnieniem historii klinicznej pacjenta i innych badań diagnostycznych. ER α Receptory steroidowe wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla ligandów. Ludzki receptor estrogenowy (ER) jest białkiem dimerycznym o masie 65 kda, zlokalizowanym najczęściej w błonie jądrowej. NaleŜy do klasy białek o działaniu trans pobudzających transkrypcję przez wiązanie z określonymi elementami DNA, określanymi równieŝ jako elementy odpowiedzi hormonalnej. PoniewaŜ po związaniu białka następuje indukcja receptora ER i stymulacja transkrypcji genu, receptor estrogenowy określa się mianem indukowalnego czynnika pobudzającego (1, 2). W badaniach z ubiegłych lat wykazano pozytywną korelację stanu receptora estrogenowego ER z wynikami przypadków nieleczonych (np. prognozowanie dobrze zróŝnicowanego inwazyjnego raka sutka) i odpowiedzią na leczenie antyhormonalne, np. leczenie tamoksifenem (2). Stwierdzono, Ŝe estrogeny przede wszystkim koncentrowały się w narządach docelowych estrogenu zwierząt i ludzkim raku sutka oraz udokumentowano w stopniu dobrym mitogenny wpływ estrogenu za pośrednictwem receptora estrogenowego ER. Na podstawie badań mechanizmu biologicznego wzrostu raka sutka stwierdzono, Ŝe szybkość wzrostu zaleŝy od obecności estrogenu lub progesteronu oddzielnie lub razem w większości wystąpień raka sutka (2). Tak więc stan receptora estrogenowego w przypadku raka sutka jest uwaŝany za potwierdzony czynnik prognostyczny i predykcyjny podczas postępowania z pacjentami w leczeniu antyhormonalnym (2 4). Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Procedura barwienia, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Gotowe do uŝycia monoklonalne przeciwciało królicze dostarczane w postaci płynnej w buforze zawierającym białko stabilizujące i azydek sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. Klon: EP1. Immunogen Rekombinowana proteina zawierająca aminokwasy ER α 1 300. Swoistość W testach Western blot lizatów komórkowych MCF7 przeciwciało barwi główny prąŝek o masie cząsteczkowej ok. 67 kd odpowiadający oczekiwanej masie cząsteczkowej ER α. Nie stwierdzono reaktywności krzyŝowej z ER β. Środki ostroŝności 1. Do badań diagnostycznych in vitro. 2. Do stosowania przez wyszkolony personel. 3. Produkt zawiera azydek sodu (NaN 3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŝeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŝe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŝą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 4. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŝy stosować właściwe procedury postępowania. 5. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŝy nosić odpowiednie osobiste wyposaŝenie ochronne. 6. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami. (121921-002) P01470PL_003_IS084/2015.11 s. 1/5
Przechowywanie Przygotowanie próbek oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Procedura barwienia oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie stosować po upływie terminu waŝności podanego na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane powyŝej, uŝytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŝy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŝy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŝy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm. Wymagane jest poddanie preparatów cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) przy uŝyciu aparatu Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101/PT200). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŝytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje się po wstępnej obróbce tkanek poprzez 20-minutową inkubację w odczynniku EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (nr kat. K8010/K8004) w temperaturze 97 C, a następnie 5-minutowe zanurzenie w buforze EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007). Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej skrawków tkankowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie zalecana jest procedura 3 w 1 z uŝyciem urządzenia Dako PT Link. Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą zostać odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek Dako Silanized Slides (nr kat. S3003). Zalecanym systemem wizualizacji jest system odczynników EnVision FLEX, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010), który powinien być stosowany zgodnie z poniŝszym protokołem. Przed uŝyciem odczynniki naleŝy odpowiednio rozcieńczyć. Wszystkie kroki naleŝy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (20 25 C). 1. Inkubować skrawki tkankowe z 200 µl odczynnika EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (DM821) przez 5 (±1) minut. 2. Płukać w buforze EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 1 5 minut. 3. Inkubować skrawki tkankowe z 200 µl odczynnika primary antibody (nr kat. IS084) przez 20 (±1) minut. 4. Płukać w buforze EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 1 5 minut. 5. Inkubować skrawki tkankowe z 200 µl odczynnika EnVision FLEX/HRP (nr kat. DM822) przez 20 (±1) minut. 6. Płukać w buforze EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 1 5 minut. 7. Inkubować skrawki tkankowe z 200 µl odczynnika EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 5 (±1) minut. 8. Płukać w buforze EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 1 5 minut. 9. Inkubować skrawki tkankowe z 400 µl odczynnika EnVision FLEX Substrate Working Solution (nr kat. DM823 i DM827) przez 10 (±1) minut. 10. Płukać w buforze EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 1 5 minut. 11. Prowadzić barwienie kontrastowe preparatów za pomocą odczynnika EnVision FLEX Hematoxylin (nr kat. K8018) przez 5 (±1) minut. 12. Płukać w wodzie dejonizowanej przez 1 5 minut. 13. Inkubować skrawki tkankowe z 200 µl odczynnika EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 5 (±1) minut. 14. Płukać w wodzie dejonizowanej przez 1 5 minut. 15. Zatopić preparaty za pomocą środka do trwałego zatapiania. (121921-002) P01470PL_003_IS084/2015.11 s. 2/5
Tabela programowania zalecanego odczynu: Wszystkie procedury inkubacji naleŝy równieŝ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Dla etapu Auxiliary (Pomocniczy) naleŝy ustawić opcję rinse buffer (płukanie buforu) w programach barwienia 10 szkiełek. W przypadku programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary (Pomocniczy) naleŝy ustawić na none (brak). Zapewnia to porównywalne czasy płukania. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŝności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w kaŝdym laboratorium (5). NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe w tym celu naleŝy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części Charakterystyka działania. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną za pomocą odczynnika EnVision FLEX Hematoxylin (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego środka do trwałego zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów zaleca się wykonywanie dodatnich i ujemnych prób kontrolnych z uŝyciem identycznego protokołu. W optymalnym przypadku kontrole dodatnie powinny zawierać tkankę raka sutka o niskiej ekspresji ER. MoŜna równieŝ uŝywać łagodnych nowotworów szyjki macicy. We wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki, jak opisany dla tej tkanki w części Charakterystyka działania. Zalecany odczynnik do kontroli ujemnej to FLEX Universal Negative Control, Rabbit, Gotowy do uŝycia (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS600). Interpretacja wybarwienia Ograniczenia swoiste dla opisywanego produktu Charakterystyka działania Przeciwciała dają odczyn jądrowy. Ewentualny zaobserwowany odczyn cytoplazmatyczny naleŝy uznać za nieswoisty. Dodatni wynik badania definiuje się jako odczyn jądrowy w 1% komórek nowotworowych (6). Zasada ta jest zgodna z rekomendowanym przez ASCO/CAP poziomem granicznym wyniku dodatniego określonym jako 1% dodatnich komórek nowotworowych (3). 1. Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w tkankach. JeŜeli próbki przechowywano w temperaturze pokojowej, powinny być poddane barwieniu w ciągu 2 miesięcy od osadzenia preparatów tkankowych na szkiełkach (7). 2. W celu uzyskania optymalnych, powtarzalnych wyników, w preparatach utrwalanych standardowo (w obojętnej buforowanej formalinie) i zatapianych w parafinie naleŝy zastosować odmaskowanie antygenu białka ER. 3. Nie przeprowadzono weryfikacji stosowania Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1 na tkankach utrwalanych środkami innymi niŝ formalina. Precyzja: Do badania przeznaczono seryjne skrawki pochodzące z trzech róŝnych bloczków raka sutka, utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie. Badanie wykonano w następujący sposób: Precyzja w jednej serii odczynów: Zgodnie ze standardowym protokołem uŝycia odczynników EnVision FLEX, High ph trzy skrawki z kaŝdego bloku wybarwiono za pomocą przeciwciał Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1. Jednocześnie wykonano odczyn na pojedynczych skrawkach z kaŝdego bloczka, stosując odczynnik do kontroli ujemnej. (121921-002) P01470PL_003_IS084/2015.11 s. 3/5
Precyzja między seriami odczynów: PowyŜszą procedurę powtarzano przez dwa dodatkowe dni, wykonując odczyn jednego skrawka z kaŝdego bloczka. Jednocześnie wykonano odczyn na pojedynczych skrawkach z kaŝdego bloczka, stosując odczynnik do kontroli ujemnej. Precyzja między aparatami: PowyŜszą procedurę powtarzano na trzech osobnych aparatach Autostainer, wykonując odczyn trzech skrawków z kaŝdego bloczka. Jednocześnie wykonano odczyn na pojedynczych preparatach z kaŝdego bloczka, stosując odczynnik do kontroli ujemnej. W wyniku eksperymentów z przeciwciałami Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, w badaniach w obrębie jednej, kilku serii i między aparatami uzyskano zgodność wyników. W przebiegu badania uzyskano stale zgodne wyniki pomiędzy seriami odczynów, odczynniki przechowywano w temperaturze 2 8 ºC. Tkanki normalne: W tabeli 1. przedstawiono podsumowanie immunoreaktywności Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, w zalecanym panelu prawidłowych tkanek. Wszystkie preparaty utrwalano w formalinie i zatapiano w parafinie. Następnie wykonywano odczyn przy uŝyciu Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, zgodnie z zaleceniami przedstawionymi w ulotce dołączonej do opakowania. Tabela 1: Podsumowanie reaktywności Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, w tkankach prawidłowych (8) Rodzaj tkanki (liczba Składniki komórkowe dające dodatni odczyn testowanych przypadków) Grasica (3) 0/3 Gruczoł krokowy (3) 3/3 Komórki podścieliska (<5 30%), jądrowy Gruczoły sutkowe (2) 2/2 Komórki nabłonka gruczołowego (20%), jądrowy Jajniki (3) 3/3 Nabłonek pęcherzykowy (20 40%), jądrowy 2/3 Komórki podścieliska (10 30%), jądrowy Jądra (3) 0/3 Jelito cienkie (3) 0/3 Jelito grube (3) 0/3 Komórki międzybłonka (3) 0/3 Macica (3) Mięsień sercowy (3) 0/3 Mięśnie szkieletowe (3) 0/3 Migdałki (3) Mózgowie (3) 0/3 MóŜdŜek (3) 0/3 Nadnercza (3) 0/3 Nerki (3) 0/3 Nerwy obwodowe (3) 0/3 Płuca (3) 0/3 Przełyk (3) Przysadka mózgowa (3) 0/3 Przytarczyce (3) 0/3 Skóra (3) 0/3 Szpik kostny (3) 0/3 Szyjka macicy (3) Śledziona (3) 0/3 Ślinianki (3) 0/3 Tarczyca (3) 0/3 Trzustka (3) 0/3 Wątroba (3) 0/3 śołądek (3) 0/3 3/3 Warstwa mięśniowa (<1 40%), jądrowy 3/3 Nabłonek gruczołowy (50 80%), jądrowy 3/3 Komórki podścieliska (30 80%), jądrowy 2/3 Komórki nabłonka ( 1%), jądrowy 1/3 Limfocyty ośrodka rozmnaŝania (<1%), jądrowy 1/3 Komórki nabłonka (<1%), jądrowy 3/3 Komórki nabłonka (30%), jądrowy 3/3 Komórki podścieliska (30%), jądrowy Porównanie metod: Przeprowadzono testy przeciwciał Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, z zastosowaniem odczynnika EnVision FLEX. Wyniki poddano ocenie zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP (próg 1%) (3). Przeprowadzono równieŝ testy koktajlu przeciwciał anty-er α (klony 1D5 i ER-2-123) przy uŝyciu zestawu Dako ER/PR pharmdx Kit. Wyniki tych testów oceniono zgodnie z wytycznymi Allred zamieszczonymi w ulotce dołączonej do opakowania. Dane z porównania metod przedstawiono w Tabeli 2. Wyniki ocen dokonanych zgodnie z odpowiednimi wytycznymi wykazują duŝą zgodność pomiędzy przeciwciałami Monoclonal Rabbit Anti- Human ER α, klon EP1, a przeciwciałami anty-er α wchodzącymi w skład zestawu Dako ER/PR pharmdx Kit. Zgodność ogólna, zgodność wyników dodatnich i zgodność wyników ujemnych wynoszą odpowiednio: 96,2%, 98,9% i 92,2%. (121921-002) P01470PL_003_IS084/2015.11 s. 4/5
Tabela 2: Zgodność między Anti-ER α, klon EP1, a składnikiem anty-er α zestawu ER/PR pharmdx Kit Monoclonal Rabbit Anti- Human ER α, klon EP1 Składnik anty-er α zestawu ER/PR pharmdx Kit Dodatnie Ujemne Razem Dodatnie 183 10 193 Ujemne 2 119 121 Razem 185 129 314 Zgodność wyników dodatnich wyraŝona procentowo = 183/185 = 98,9% Zgodność wyników ujemnych wyraŝona procentowo = 119/129 = 92,2% Zgodność ogólna wyraŝona procentowo = 302/314 = 96,2% Kappa= 0,9203 95-procentowy przedział ufności = 0,8761 0,9645 Piśmiennictwo 1. Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin J-R, Chambon P. Functional domains of the human estrogen receptor. Cell 1987;51:941-51. 2. Elledge RM, Fuqua SAW. Ch. 31: Estrogen and Progesterone Receptors. Diseases of the Breast. Harris et al. eds., Lippincott Williams & Wilkins 2000; 471-85. 3. Hammond MEH, Hayes DF, Dowsett M, Allred C, Hagerty KL, Badve S, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2010;134:907 22. 4. Fitzgibbons FK, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer: College of American Pathologists Consensus Statement 1999. Arch Pathol Lab Med 2000;124:966-78. 5. Fitzgibbons PL, Murphy DA, Hammond EH, Allred C, Valenstein PN. Recommendations for Validating Estrogen and Progesterone Receptor Immunohistochemistry Assays. Arch Pathol Lab Med 2010:134;930-35. 6. Diaz LK, Sneige N. Estrogen receptor analysis for breast cancer: current issues and keys to increasing testing accuracy. Adv Anat Pathol 2005;12:10-9. Review. 7. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5)- CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400. Wayne, PA 19087-1898 USA 1999. 8. M3634 IHC003-D03803 Report on file. Przeciwciała Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, są produkowane przez firmę Epitomics Inc. przy uŝyciu technologii produkcji monoklonalnych przeciwciał króliczych chronionej patentami nr 5,675,063 oraz 7,402,409. Wydanie 11/15 (121921-002) P01470PL_003_IS084/2015.11 s. 5/5